納米孔傳感技術(shù)應(yīng)用于核酸檢測(cè)的研究進(jìn)展

汪榮亮，谷德健，劉全俊

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096)

1 前 言

納米孔作為目前最有潛力的單分子DNA測(cè)序工具而備受關(guān)注。在納米孔傳感技術(shù)中，單個(gè)分子穿過(guò)一個(gè)納米尺度的孔從而形成可以檢測(cè)的離子電流變化。通過(guò)對(duì)離子電流的檢測(cè)可以得知該分子的結(jié)構(gòu)組成的相關(guān)信息[1]，是一種非標(biāo)記的快速單分子檢測(cè)方法。

納米孔主要分為3類(lèi)：①生物納米孔，主要包括金色葡萄球菌α-溶血素蛋白納米孔(α-hemolysin, α-HL)[2]、恥垢分枝桿菌孔道蛋白A(α-Mycobacterium smegmatis porin A，MspA)[3]和噬菌體phi29連接器[4]等。其中對(duì)α-HL 納米孔研究最早、研究最多；MspA納米孔孔道相對(duì)更窄更短，近年來(lái)也十分熱門(mén)。②固態(tài)納米孔，是人為制造的納米級(jí)孔道，根據(jù)材質(zhì)可分為氮化硅[5]、二氧化硅[6]、氧化鋁[7]、玻璃毛細(xì)管[8]、二硫化鉬[9](MoS2)，石墨烯[10]納米孔等。其中氮化硅材料因其具有較低的機(jī)械應(yīng)力以及優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最廣泛的固態(tài)納米孔，而二硫化鉬和石墨烯單層的厚度(單層石墨烯約0.5 nm)和DNA堿基對(duì)(B-型DNA堿基對(duì)長(zhǎng)度0.34 nm)相當(dāng)，更適合進(jìn)行納米孔測(cè)序。③復(fù)合納米孔[11]，主要是將生物納米孔與固態(tài)納米孔結(jié)合，集中固態(tài)納米孔可控制備和生物納米孔噪聲小的優(yōu)勢(shì)。與生物納米孔相比，固態(tài)納米孔在化學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)穩(wěn)定性上具有明顯優(yōu)勢(shì)，并可由常規(guī)半導(dǎo)體加工技術(shù)制成，既可以實(shí)現(xiàn)納米孔的大規(guī)模加工，又可以控制其孔徑；生物納米孔的孔道小、信噪比比較好；而復(fù)合納米孔的制作過(guò)程比較復(fù)雜、相關(guān)研究較少?；诟黝?lèi)納米孔性質(zhì)不同，納米孔分別應(yīng)用在DNA測(cè)序、DNA甲基化檢測(cè)，DNA-蛋白相互作用、miRNA檢測(cè)等單分子檢測(cè)的熱門(mén)方向。

2 DNA檢測(cè)

2.1 DNA測(cè)序

2.1.1 直接測(cè)序

研究者首先研究同聚物通過(guò)納米孔形成的電流信號(hào)之間的差別，由于PolyG容易形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此主要以poly(A/T/C)為主。Meller[12]通過(guò)α-HL檢測(cè)poly(A/T/C)100，獲得易位速度約為1 nt/μs。Venta[13]使用厚度5～8 nm、直徑0.8～2 nm的氮化硅納米孔，分別檢測(cè)短鏈同聚物poly(A/T/C)30。Cabello-Aguilar[11]將α-HL插入化學(xué)沉積修飾后的PET納米孔得到復(fù)合納米孔，達(dá)到對(duì)poly(A/C/U/I)100的成功區(qū)分。隨后，研究者開(kāi)始將同聚物中的不同位置分別換成其它核苷酸。如Bayley小組在ployC的不同部位添加A[14]，并成功區(qū)分。Manrao[15]使用M1MspA檢測(cè)同聚物中的一個(gè)核苷酸的改變，并成功區(qū)分。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從原理上說(shuō)明使用納米孔實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序的可能。

2.1.2 控制DNA易位速率

DNA高速通過(guò)納米孔的特性使得高速測(cè)序成為可能，但同時(shí)這種高速度也正是很多納米孔測(cè)序技術(shù)的弱點(diǎn)。因?yàn)樗俣忍?，檢測(cè)的信號(hào)質(zhì)量就不高，甚至很多小的信號(hào)根本就檢測(cè)不到。在120 mV的條件下，DNA會(huì)以每個(gè)堿基對(duì)約1～20 μs的速度通過(guò)α-HL素納米孔。這就需要探測(cè)器的檢測(cè)帶寬達(dá)到MHz級(jí)，才能檢測(cè)到皮安級(jí)的電流強(qiáng)度。鑒于此，對(duì)于納米孔測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，最為重要的一點(diǎn)就是如何控制并減慢DNA分子通過(guò)納米孔的速度，同時(shí)盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNA分子跨孔動(dòng)力學(xué)上造成的波動(dòng)現(xiàn)象。

通過(guò)改變電解質(zhì)溶液pH[16]、改變電解質(zhì)[17]、電極化學(xué)修飾[18]，都可以降低DNA易位速率。Kim[19]在納米孔表面修飾正電荷基團(tuán)，通過(guò)靜電相互作用降低易位速率。Goto[20]借鑒凝膠層析的原理在納米孔表面和內(nèi)部加入經(jīng)過(guò)表面修飾的納米硅珠，降低單鏈DNA的易位速率至270 μs/bp。Li小組[21]則通過(guò)改變溫度、鹽離子濃度、溶液粘度，使用4～8 nm直徑的固態(tài)納米孔，將DNA易位速率最低速率降低至3 bp/μs。通過(guò)分子生物學(xué)手段，在生物納米孔中將帶負(fù)電荷氨基酸殘基[22]突變?yōu)檎姾?，也能大大延長(zhǎng)DNA的過(guò)孔時(shí)間。

除了直接降低DNA易位速率，有人使用光鑷或磁鑷[23]給DNA一個(gè)反向作用力，降低DNA易位速率。通過(guò)光鑷降低DNA易位速率200倍，從30 bp/μs降低為1.5 bp/μs。Bayley小組[24]通過(guò)使用鏈霉素生物素固定寡核苷酸，使用改造后的α-HL的3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)R1、R2、R3，對(duì)polyC鏈中不同位置的4種核苷酸進(jìn)行分辨。

2.1.3 DNA外切酶和聚合酶介導(dǎo)測(cè)序

DNA酶能與DNA鏈結(jié)合，受酶催化反應(yīng)的速度的限制，速度可達(dá)每個(gè)核苷酸幾個(gè)ms級(jí)別，這將使得檢測(cè)信號(hào)容易獲得。Baley小組[25]首先使用DNA外切酶I切下核苷酸，隨后切下的核苷酸在電壓的驅(qū)動(dòng)下通過(guò)α-HL納米孔，達(dá)到區(qū)分效果，甚至包括甲基化的dCMP。雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核苷酸的區(qū)分，但是通過(guò)外切酶測(cè)序方法仍然需要以下改進(jìn)：①控制外切酶與納米孔的距離，使得切下來(lái)的順序被正確的檢測(cè)；②對(duì)DNA外切酶I進(jìn)行優(yōu)化，使其在高鹽條件下正常工作；③需要控制DNA外切酶I切割速率使其酶切速率均一。

更多的研究組采用DNA聚合酶控制DNA的易位速率。Wilson[26]和Hurt[27]通過(guò)DNA聚合酶Klenow大片段(KF DNA聚合酶)與納米孔相結(jié)合，控制DNA分子-KF DNA聚合酶到達(dá)納米孔，加入dGTP，統(tǒng)計(jì)KF-DNA復(fù)合物和KF-DNA-dGTP三體來(lái)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明在納米孔上進(jìn)行的DNA合成可重復(fù)、特異性強(qiáng)、保真度高。而Olasagasti[28]使用T7 DNA聚合酶、Lieberman[29]使用phi29 DNA聚合酶與α-HL相結(jié)合拖拽DNA，實(shí)時(shí)測(cè)量DNA復(fù)制過(guò)程。Cherf[30]使用phi29 DNA聚合酶和α-HL相結(jié)合，通過(guò)設(shè)計(jì)DNA序列，使得DNA序列解鏈并通過(guò)α-HL納米孔，然后在phi29 DNA聚合酶拖拽下進(jìn)行合成各測(cè)序一次(圖1b)，初始測(cè)序錯(cuò)誤率10%～24.5%，錯(cuò)誤的原因可能有插入和缺失。使用類(lèi)似DNA序列設(shè)計(jì)，Manrao[31]使用MspA納米孔和phi29 DNA聚合酶相結(jié)合，達(dá)到了單堿基的分辨率，如圖1所示。經(jīng)過(guò)優(yōu)化和陣列化測(cè)試，以使用phi29 DNA聚合酶與α-HL相結(jié)合技術(shù)為基礎(chǔ)成立的Oxford公司，成功推出以納米孔為基礎(chǔ)的商用化MinION測(cè)序儀[32]。但MinION 仍存有系統(tǒng)錯(cuò)誤，在測(cè)試的數(shù)據(jù)中，有一些讀長(zhǎng)沒(méi)有錯(cuò)誤，而另一塊區(qū)域有不少錯(cuò)誤。盡管納米孔測(cè)序儀的系統(tǒng)誤差可能意味著某些區(qū)域難以獲得準(zhǔn)確的序列，但測(cè)序行業(yè)仍然看好這一平臺(tái)，這主要有幾個(gè)方面的原因。首先，測(cè)序界的許多研究人員期望納米孔數(shù)據(jù)能像PacBio的數(shù)據(jù)那樣演化。其次，MinION順應(yīng)了測(cè)序儀更小巧、更便宜的潮流，能進(jìn)入更多的科研實(shí)驗(yàn)室和臨床環(huán)境。這意味著實(shí)時(shí)的病原體檢測(cè)、醫(yī)院的病床邊測(cè)序以及實(shí)時(shí)的環(huán)境監(jiān)控將很快成為現(xiàn)實(shí)。當(dāng)然，要實(shí)現(xiàn)真正的便攜式測(cè)序，還需要克服一些挑戰(zhàn)，比如樣品制備、試劑冷藏等。

圖1 在納米孔中使用合成法進(jìn)行DNA測(cè)序[31]：(a)MspA與phi29 DNA聚合酶結(jié)合，先解鏈通過(guò)納米孔，再合成反向拉回通過(guò)納米孔，(b)全過(guò)程的電流信號(hào)示意圖，(c)DNA被phi29 DNA聚合酶反拉過(guò)孔的示意圖，(d)電流信號(hào)與DNA序列對(duì)應(yīng)Fig.1 Synthesis method used in nanopore for DNA sequencing[31]: (a) Crystal structure of M2-NNN MspA nanopore; (b) DNA passed through nanopore firstly and then went opposite direction by synthesis and the current signal of the whole process; (c) Illustration of DNA being dragged by phi29 DNAP during synthesis; (d) Typical current trace associated DNA sequence

2.2 DNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)

在許多的細(xì)胞生命活動(dòng)中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問(wèn)題。生物細(xì)胞中，DNA與蛋白結(jié)合緊密，調(diào)節(jié)表達(dá)活性發(fā)揮功能。而檢測(cè)與DNA相互作用的蛋白質(zhì)是個(gè)研究難題。

通過(guò)DNA-蛋白復(fù)合物與DNA分子通過(guò)納米孔引起的阻塞電流的差異，Kowalczyk[33]通過(guò)分析DNA和DNA-RecA蛋白復(fù)合物通過(guò)8 nm固態(tài)納米孔產(chǎn)生的信號(hào)的差別，用簡(jiǎn)單可控的檢測(cè)方法進(jìn)行與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)篩選。相關(guān)研究非常多，如Raillon[34]檢測(cè)DNA與RNA聚合酶復(fù)合物，Ivankin[35]檢測(cè)DNA與組蛋白的相互作用，Japrung[36]使用固態(tài)納米孔檢測(cè)SSB蛋白-DNA復(fù)合物，Squires[37]使用固態(tài)納米孔檢測(cè)可以與DNA相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，Yu[38]使用固態(tài)納米孔區(qū)分鋅指蛋白和DNA復(fù)合物，尋找單分子水平的DNA結(jié)合位點(diǎn)。Fanzio[39]將雙鏈LNA探針共價(jià)結(jié)合到氮化硅薄膜，用以篩選NF-κB蛋白，用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞提取物里面的混合蛋白樣品。

固態(tài)納米孔孔徑可控，可以用于與DNA結(jié)合的蛋白乃至DNA結(jié)合藥物的篩選，也可以判斷與DNA特異位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)的判斷。除此之外，由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，在正常條件下很難解折疊通過(guò)納米孔。而寡聚核苷酸修飾后的蛋白質(zhì)或多肽可以在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下由寡核苷酸引導(dǎo)過(guò)孔并解鏈蛋白[40]，這也給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析提供新的研究手段。

2.3 DNA損傷檢測(cè)

DNA存儲(chǔ)著生物體賴(lài)以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA分子的完整性對(duì)細(xì)胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，而且與RNA及蛋白質(zhì)可以在胞內(nèi)大量合成不同，一般在一個(gè)原核細(xì)胞中只有一份DNA，在真核二倍體細(xì)胞中相同的DNA也只有一對(duì)，如果DNA的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對(duì)體細(xì)胞就可能影響其功能或生存，對(duì)生殖細(xì)胞則可能影響到后代。而研究表明，核酸變異或修飾往往與癌癥、衰老或疾病相關(guān)。例如脫氨基現(xiàn)象在DNA損傷中十分常見(jiàn)，將引發(fā)突變導(dǎo)致病變。Marshall[41]使用固態(tài)納米孔檢測(cè)DNA脫氨基化。酸性條件下，脫嘌呤堿基，導(dǎo)致易位速度明顯變慢。

端粒末端序列常常包含TTAGGG重復(fù)序列，其中鳥(niǎo)嘌呤(G)的氧化產(chǎn)物是8-羥基鳥(niǎo)嘌呤(OG)，是氧化損傷的生物標(biāo)記。氧化損傷導(dǎo)致端粒序列變短，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老。Wolna[42]利用生物納米孔檢測(cè)端粒序列損傷后的包含T=T的G四聯(lián)體，檢測(cè)結(jié)構(gòu)變化。Perera[43]利用端粒重復(fù)序列在NaCl溶液中形成G四聯(lián)體，降低端粒序列通過(guò)α-HL的易位速率。而形成OG損傷的G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，無(wú)法形成G四聯(lián)體。解折疊速率增快10倍，從而檢測(cè)OG損傷的存在。

2.4 特異基因檢測(cè)

除DNA測(cè)序外，納米孔對(duì)特定基因的檢測(cè)，原理上是通過(guò)在納米孔內(nèi)修飾與之雜交配對(duì)的探針，通過(guò)區(qū)分特異性雜交信號(hào)與非特異性信號(hào)，而達(dá)到檢測(cè)效果。Balagurusamy[44]通過(guò)使用生物素連接DNA分子，與特異性DNA形成12 bp雜交區(qū)域，達(dá)到對(duì)DNA分子的雜交檢測(cè)。Singer[45]使用PNA序列作為探針，檢測(cè)基因組DNA內(nèi)部特異序列。Tan等[46]通過(guò)化學(xué)修飾，在納米孔內(nèi)部連接特異性DNA探針?lè)肿?，?duì)電流信號(hào)進(jìn)行分析，可以區(qū)分與探針雜交的DNA序列。

2.5 甲基化檢測(cè)

DNA甲基化是真核細(xì)胞基因組中常見(jiàn)的表觀遺傳修飾，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、個(gè)體發(fā)育等方面起重要作用，并且DNA甲基化水平異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?，F(xiàn)有的DNA甲基化檢測(cè)方法主要為重亞硫酸鹽測(cè)序[47]、甲基化特異性PCR[48]、甲基化熒光定量PCR法[49]和DNA微陣列法[50]，然而這些處理方法往往需要大量DNA樣本(源于重亞硫酸鹽處理過(guò)程中DNA的降解)、大量測(cè)序成本或者PCR擴(kuò)增甚至復(fù)雜探針的設(shè)計(jì)。PCR過(guò)程中又容易呈現(xiàn)出低的擴(kuò)增效率、擴(kuò)增偏性和工作量偏大等缺點(diǎn)。因此，一種快速而靈敏的甲基化判定方法將在臨床診斷中具有重大價(jià)值。

Shim[51]使用固態(tài)納米孔與甲基化結(jié)合蛋白(MBD)檢測(cè)DNA甲基化位點(diǎn)。結(jié)合MBD蛋白的DNA阻塞電流相較于DNA分子增大3倍(圖2 d和2e)。在進(jìn)一步的工作中，他們[52]利用19 nm納米孔區(qū)分短鏈(30，60，90 bp)ds DNA和甲基化結(jié)合蛋白MBP-ds DNA復(fù)合物，并通過(guò)電流增大的位置判斷DNA甲基化的位點(diǎn)。

固態(tài)納米孔孔徑偏大，生物納米孔對(duì)甲基化的細(xì)節(jié)信息則有著更細(xì)致的研究。Kang[53]則使用重亞硫酸鹽修飾DNA，使得未甲基化的胞嘧啶C變?yōu)槟蜞奏，而Hg2+結(jié)合到UT位置使得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。使用α-HL檢測(cè)DNA，結(jié)合Hg2+的DNA過(guò)孔時(shí)間將明顯延長(zhǎng)。并以此原理，檢測(cè)腫瘤抑制基因P16基因CpG島內(nèi)部的甲基化。Laszlo[54]則將合成測(cè)序的方法借鑒到甲基化堿基的檢測(cè)過(guò)程當(dāng)中，他們采用MspA納米孔與phi29 DNA聚合酶相結(jié)合，測(cè)定DNA中CpG島中的甲基化程度，其中5-甲基化胞嘧啶的準(zhǔn)確率97%，5-羥甲基胞嘧啶的準(zhǔn)確率97.5%(圖2a～2c)，首次實(shí)現(xiàn)了5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的區(qū)分。Wescoe[55]則檢測(cè)以XnCGY四堿基重復(fù)序列中的5種胞嘧啶：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，準(zhǔn)確率91.6%～98.3%。

相比于傳統(tǒng)DNA甲基化檢測(cè)方法，納米孔具有以下優(yōu)勢(shì)：①可直接檢測(cè)基因組DNA，無(wú)需擴(kuò)增，擴(kuò)增帶來(lái)的誤差也不存在；②基因組DNA可以在納米孔中無(wú)限的保留，理論上可以進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)序，而重復(fù)測(cè)序可以增加準(zhǔn)確率；③讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，基因組內(nèi)部重復(fù)序列可以有效解決；④無(wú)需樣品處理，檢測(cè)成本相對(duì)較低。

2.6 重金屬離子檢測(cè)

重金屬污染是全球化問(wèn)題，吸引眾多關(guān)注。環(huán)境污染方面的重金屬主要是指汞、鎘、鉛、鉻以及類(lèi)金屬砷等生物毒性顯著的重金屬元素。主要來(lái)源于自然或者人為的污染，主要包括火山噴發(fā)、煤炭發(fā)電、金礦冶煉、廢棄物焚化等。如果重金屬元素未經(jīng)處理就直接排入河流、湖泊或海洋，繼而在食物鏈的生物放大作用下，它們成千百倍地富集，最后進(jìn)入人體，最終影響到人類(lèi)。如Hg2+，是水銀污染的常見(jiàn)形式，有神經(jīng)毒性并可以導(dǎo)致腎臟和免疫系統(tǒng)的損壞。

Wen[56]設(shè)計(jì)含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針，汞離子可以穩(wěn)定T-T(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)錯(cuò)配，過(guò)孔時(shí)間將有所延長(zhǎng)，從而與未結(jié)合的探針進(jìn)行區(qū)分(圖3a～3c)。探針對(duì)Hg2+選擇性強(qiáng)，不受其他金屬離子干擾，對(duì)Hg2+的檢測(cè)限度達(dá)到7 nmol/L。利用相同原理，Zeng等[57]的研究中檢測(cè)靈敏度低至0.5 nmol/L。Yang[58]設(shè)計(jì)G四聯(lián)體探針(圖3d和3e)，檢測(cè)Ba2+和Pb2+。與離子結(jié)合的探針的易位時(shí)間將延長(zhǎng)，從而產(chǎn)生差別(圖3e)，據(jù)此可以測(cè)得離子的濃度，最低限可至0.8 nmol/L。目前痕量重金屬離子檢測(cè)主要依賴(lài)于原子吸收、原子熒光、電感耦合等離子體、質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)室方法。盡管這些方法檢測(cè)精度比較高，但儀器耗資昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、操作要求多，檢測(cè)比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且測(cè)量時(shí)需萃取、濃縮富集或抑制干擾等復(fù)雜前處理過(guò)程。而應(yīng)用納米孔檢測(cè)盡管尚未達(dá)到現(xiàn)有檢測(cè)精度，但其可重復(fù)利用及操作簡(jiǎn)單將是其持續(xù)研究的優(yōu)勢(shì)。

圖2 納米孔檢測(cè)DNA甲基化[54]：(a)胞嘧啶、5-甲基化胞嘧啶和 5-羥甲基化胞嘧啶化學(xué)結(jié)構(gòu)；(b)MspA-phi29 DNA聚合酶構(gòu)成的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖；(c)DNA通過(guò)MspA-phi29DNA聚合酶納米孔裝置生成的一段典型的易位電流信號(hào)；(d)甲基化DNA-MBD復(fù)合物俯視圖；(e)比較甲基化DNA與甲基化DNA-MBD蛋白復(fù)合物通過(guò)12 nm固態(tài)納米孔的易位信號(hào)Fig.2 DNA methylation detected by nanopore[54]: (a) Chemical structure of cytosine, 5-methylcytosine, and 5-hydroxymethylcytosine; (b) Schematic illustration of a typical MspA-phi29 DNA polymerase (DNAP) experiment; (c) A typical current trace of DNA being pulled through MspA by phi29 DNAP; (d) Top down view of methylated DNA-MBD complex; (e) Comparisons of translocation signatures for methylated DNA and methylated DNA-MBD complex through a 12 nm pore

圖3 設(shè)計(jì)特定DNA探針用于檢測(cè)重金屬離子：(a)～(c)三種不同雜交的DNA檢測(cè)Hg2+ [56]；(d)G四聯(lián)體DNA檢測(cè)Pb2+和Ba2+的原理示意圖；(e)Pb2+結(jié)合的G四聯(lián)體易位時(shí)間明顯延長(zhǎng)[58]Fig.3 Specific DNA probes being designed for sensing heavy metal ions: (a)～(c) Three different probes for sensing Hg2+[56]; (d)The principle of detecting Pb2+ and Ba2+ with G-quadruplex DNA; (e) Representation of the translocation time expanding of Pb2+-induced G-quadruplex through a single α-HL nanopore[58]

3 RNA檢測(cè)

與DNA類(lèi)似，RNA的研究也經(jīng)歷了核苷酸、寡聚物，到使用探針雜交檢測(cè)、功能檢測(cè)、結(jié)構(gòu)檢測(cè)的發(fā)展過(guò)程。 Bayley小組[59]將RNA分子通過(guò)生物素與鏈霉素固定在α-HL納米孔內(nèi)，通過(guò)突變的α-HL的R1識(shí)別位點(diǎn)的NNY殘基成功區(qū)分rA、rC、rT堿基。Wanunu等[60]使用厚度7 nm、直徑3 nm的氮化硅納米孔分別檢測(cè)25 bp的DNA、22 bp的RNA和tRNA分子。

miRNA是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，研究報(bào)道，其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進(jìn)程密切相關(guān)[61]，并有望成為新的腫瘤標(biāo)志物。特異性miRNA在細(xì)胞中成分復(fù)雜，濃度極低，且大小類(lèi)似，針對(duì)miRNA的檢測(cè)研究非常熱門(mén)。使用納米孔檢測(cè)miRNA分子通常通過(guò)DNA探針?lè)肿舆_(dá)到對(duì)特異性miRNA的檢測(cè)。Wang[62]使用α-HL的生物納米孔，利用特異性的探針區(qū)分大小相近的miRNA分子，并通過(guò)檢測(cè)6個(gè)肺癌病患的血液樣本的miR-155分子，發(fā)現(xiàn)患者樣本的miR-155分子相對(duì)于健康患者上升(圖4a～4c)。Tian[63]使用肽核酸(PNA)探針從核酸混合物中檢測(cè)特異性結(jié)合的miRNA分子。Zhang[64]使用不同長(zhǎng)度的PEG修飾DNA探針，通過(guò)不同大小的阻塞電流，同時(shí)檢測(cè)4種miRNA分子(圖4d)。Sawafta[65]研究了丙型肝炎病毒(RNA病毒)在藥物作用下的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。病毒是彎曲結(jié)構(gòu)，易位極其艱難，容易出現(xiàn)堵孔現(xiàn)象。而與藥物結(jié)合的病毒的阻塞電流信號(hào)改變明顯且變得相對(duì)較快，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，該藥物與RNA結(jié)合，改變了病毒的結(jié)構(gòu)。據(jù)此，納米孔可以用來(lái)檢測(cè)與特定分子相互作用的藥物篩選。tRNA具有二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至高級(jí)結(jié)構(gòu)，而Andrew[66]通過(guò)在tRNA兩端加上適配子使得tRNA在通過(guò)α-HL納米孔時(shí)解折疊。使用phi29DNA聚合酶邊合成邊解折疊，同時(shí)降低tRNA分子的易位速率。通過(guò)對(duì)易位電流的解析，他們成功區(qū)分大腸桿菌中攜帶的甲酰甲硫酰胺(fMet)和賴(lài)氨酸(Lys)的tRNA分子。

圖4 使用DNA 探針檢測(cè)miRNA 分子：(a)miRNA分子(紅色)和DNA探針(綠色)雜交的圖解;(b)100 mV偏置電壓下100 nM miR-155和P155的混合物在cis池中混合后并通過(guò)納米孔的阻塞事件的連續(xù)顯示;(c)miRNA-探針復(fù)合物通過(guò)納米孔時(shí)解鏈產(chǎn)生的多個(gè)電流水平的易位動(dòng)力學(xué)過(guò)程[62]；(d)使用長(zhǎng)度不同的PEG分子作為條碼檢測(cè)多種miRNA分子[64]Fig.4 DNA probes being used to detect miRNA molecule: (a) Molecular diagram of a micro RNA (red) bound to a probe (green) bearing signal tags on each end; (b) Sequence of nanopore current blocks in the presence of 100 nM miR-155 and 100 nM P155 in the cis solution,100 mV; (c) Translocation dynamics of miR-155-P155 complex and Multi-level current generated by the unfolding process[62]; (d) Different PEG molecules were treated as barcodes for multiplex detection of miRNA molecule[64]

4 病毒檢測(cè)

通過(guò)解析納米孔易位事件阻塞電流信號(hào)可以得知目的分子的理化性質(zhì)，如尺寸大小、形貌、結(jié)構(gòu)、帶電荷性質(zhì)等等。納米孔正越來(lái)越普遍地應(yīng)用到表征納米顆粒的尺寸和帶電性質(zhì)及多種形態(tài)的病毒分子。另外，對(duì)于柔性的生物分子來(lái)說(shuō)(如DNA)，其容易形成無(wú)規(guī)則的螺旋折疊結(jié)構(gòu)[67]。對(duì)納米孔測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，其中一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是理解DNA分子通過(guò)納米孔的動(dòng)態(tài)學(xué)過(guò)程[68]，這對(duì)研究DNA測(cè)序非常重要。到目前為止，研究者對(duì)柔性生物分子通過(guò)納米孔的復(fù)雜行為依然知之甚少。這一方面，也促使研究者尋找一種簡(jiǎn)單的一維的分子模型(如病毒)來(lái)進(jìn)行納米孔的研究。

McMullen[69]使用納米孔分辨fd、M13病毒。Harms[70]構(gòu)造了一種具有雙孔的納米孔來(lái)檢測(cè)HBV病毒，相對(duì)于單孔，雙孔檢測(cè)信號(hào)變化不大，但檢測(cè)信噪比有所提升。Darvish[71]則使用納米孔區(qū)分出不同成熟型的HIV病毒。Yao等[72]使用α-HL納米孔檢測(cè)HBV的遺傳物質(zhì)DNA，其檢測(cè)限度可低至10 pmd/L。Liu[73]研究fd病毒易位時(shí)與孔壁的相互作用，并將過(guò)孔事件分為3類(lèi)：①直接過(guò)孔(低電壓低濃度最多，主要事件)(圖5a)；②與孔壁相互作用后過(guò)孔(圖5b)；③未能過(guò)孔(圖5c)。

圖5 fd病毒的3種典型的易位事件：(a)單個(gè)fd病毒易位行為導(dǎo)致的方型電流變化；(b)fd病毒先與納米孔相互作用再易位；(c)fd病毒與納米孔道相互作用卻未能成功易位[73]Fig.5 Three typical models of translocation events of the fd virus: (a) The square-like current change of single fd virus translocation event; (b) The fd virus interacted with the nanopore before translocation; (c) The fd virus touched the mouth of the nanopore but failed to pass through[73]

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，納米孔傳感檢測(cè)技術(shù)因其快速、高效地對(duì)DNA進(jìn)行非標(biāo)記、無(wú)需擴(kuò)增的測(cè)序潛能，將有望實(shí)現(xiàn)個(gè)體基因組測(cè)序成本的進(jìn)一步下降，而備受關(guān)注。在核酸檢測(cè)領(lǐng)域，納米孔也取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。但是要推出成功的檢測(cè)儀器并擴(kuò)大應(yīng)用前景，仍有許多技術(shù)瓶頸需要克服。

(1)納米孔制備技術(shù)改進(jìn)

生物納米孔不夠穩(wěn)定，它的穩(wěn)定性仍是困擾其發(fā)展的最大瓶頸。現(xiàn)有的固態(tài)納米孔制備主要通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)[74]、聚焦離子束(FIB)技術(shù)[75]。這些設(shè)備昂貴，且制備耗時(shí)長(zhǎng)，制備費(fèi)用高昂，無(wú)法批量制備，這顯然不利于商業(yè)化推廣。

(2)定量檢測(cè)

在核酸檢測(cè)領(lǐng)域，定量檢測(cè)應(yīng)用廣泛。如對(duì)病毒的定量檢測(cè)對(duì)臨床診斷和用藥十分重要，然而由于分子在納米孔內(nèi)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，納米孔定量檢測(cè)研究仍然非常少也很困難。

(3)檢測(cè)分析一體化儀器構(gòu)建

雖然納米孔對(duì)分析物是實(shí)時(shí)檢測(cè)，但由于熱運(yùn)動(dòng)的存在，分子隨機(jī)通過(guò)納米孔，需要對(duì)分子過(guò)孔事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從樣本的檢測(cè)到拿到結(jié)論需要一定的時(shí)間。目前，各研究組已經(jīng)開(kāi)發(fā)分析軟件，實(shí)現(xiàn)易位事件的通量處理。進(jìn)一步的發(fā)展目標(biāo)，將是實(shí)時(shí)定量PCR儀形成數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化，在減少人工勞力的同時(shí)，能極大提高檢測(cè)通量。

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