王志宇，王國(guó)艷，薛俊龍，張偉業(yè)，孫仰介，劉 源

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

大腸桿菌因血清型復(fù)雜而又具較強(qiáng)變異性，接種疫苗效果不佳，因而在生產(chǎn)中多采用抗生素防治。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛、持續(xù)應(yīng)用，大腸桿菌耐藥水平隨之提高，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給抗菌治療帶來了困難，給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。大腸桿菌的多重耐藥主要是由外膜通透性改變和主動(dòng)外排系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。其中，主要是外排泵系統(tǒng)（AcrAB-TolC）[3-8]與多重耐藥有關(guān)。

本研究通過采集近年來山西各地不同的大腸桿菌菌株，在實(shí)驗(yàn)室分離純化培養(yǎng)，篩選出30株多重耐藥的菌株作為研究對(duì)象，選取影響大腸桿菌多重耐藥的基因AcrA[9-11]，并結(jié)合喹諾酮類耐藥基因qnrA[12-14]和 ESBLs（超廣譜 β- 內(nèi)酰胺酶）[15-16]相關(guān)耐藥基因TEM[17-18]進(jìn)行了初步分子生物學(xué)分析，旨在了解近年來山西省雞源大腸桿菌的耐藥機(jī)理，豐富山西省大腸桿菌病分子流行病學(xué)特征，也為今后生產(chǎn)實(shí)踐中更好地防控大腸桿菌疫病奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

病料采集于2016—2017年山西省部分地區(qū)疑似大腸桿菌病的病死雞。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR擴(kuò)增試劑購自Taraka寶生物（大連）；引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司；革蘭陰性需氧菌鑒定板和腸桿菌藥敏板購自上海復(fù)星佰珞生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng)鑒定及藥敏 從病料采集菌株并分離純化，初步篩選革蘭氏陰性桿菌，使用微生物鑒定藥敏儀（上海復(fù)星佰珞）進(jìn)行菌種鑒定和18種藥敏判讀。

1.2.2 相應(yīng)基因的擴(kuò)增 提取大腸桿菌基因組DNA作為模板，分別使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序及同源性比較。AcrA：上游引物為 5′-GACGACAAACAGGCCCAACA-3′，下游引物為 5′-TTAAGACTTGGACTGTTCA-3′；qnrA[19]：上游引物為 5′-CCAGGATTTGAGTGACAGC-3′，下游引物為 5′-TCCCAAGGGTTCCAGCA-3′；TEM[20]：上游引物為 5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′，下游引物：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌藥敏結(jié)果分析

藥敏結(jié)果表明，30株雞源性致病大腸桿菌對(duì)18種抗生素的17種產(chǎn)生不同程度耐藥，其中，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物高度耐藥，耐藥率達(dá)70%，對(duì)FQs類藥物耐藥率為60%（表1）。

對(duì)多重耐藥進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，30株大腸桿菌均表現(xiàn)多重耐藥。其中，7株菌耐4種藥，5株菌耐2種藥，耐6種藥和12種藥的菌各3株。每株菌平均耐藥6.5種，最少2種，最多14種（表2）。依據(jù)ELBLs判定方法，共計(jì)14株菌為ELBLs菌株。

表1 大腸桿菌對(duì)18種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 大腸桿菌多重耐藥性結(jié)果

對(duì)多重耐藥類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，山西各地采集到的30株雞源大腸桿菌中，有23種多重耐藥類型，其中，AMK-TZP-SAM-CZO和CIP-LVX的耐藥型各4株，其他類型的多重耐藥譜出現(xiàn)情況幾乎無重復(fù)（表3）。

表3 大腸桿菌耐藥譜型

2.2 多重耐藥相關(guān)基因分析

以大腸桿菌基因組為模板，對(duì)AcrA基因片段的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

從電泳結(jié)果可以看到，所有菌株通過PCR均得到了AcrA基因片段，選取多重耐藥菌株的PCR結(jié)果進(jìn)行膠回收并連接T載體、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，同源性達(dá)99%。對(duì)序列的編碼蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白編碼沒有改變。由此可知，菌體中的AcrAB功能完整。

由圖2可知，30株雞源大腸桿菌中檢測(cè)到符合目的基因（約592 bp）的共計(jì)11株，通過與藥敏結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)增獲得qnrA基因的菌株均對(duì)FQs類藥物耐藥；而另有7株不具備qnrA基因的菌株也對(duì)FQs耐藥。在所有18株對(duì)FQs類耐藥的菌株中，僅有4株單純對(duì)FQs類耐藥，其余14株均不同程度對(duì)其他藥物也產(chǎn)生耐藥。

對(duì)TEM基因片段的擴(kuò)增結(jié)果表明，30株雞源大腸桿菌中檢測(cè)到符合目的基因（約861 bp）的共計(jì)4株（圖3）。根據(jù)PCR結(jié)果和藥敏結(jié)果綜合分析，具有TEM基因的菌株均表現(xiàn)為ESBLs型。而14株ESBLs菌株中僅有4株TEM檢出陽性，占28.5%。

3 討論

本研究以30株雞源致病性大腸桿菌作為試驗(yàn)組，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，山西省雞源致病性大腸桿菌已對(duì)喹諾酮類、氨基糖苷類藥物產(chǎn)生高度耐藥性。其中，喹諾酮類藥物中，環(huán)丙沙星和左氟沙星耐藥率均為60%。選取與之耐藥有關(guān)的基因進(jìn)行分析，菌體染色體中具有遺傳耐藥性的已達(dá)61%，這是由喹諾酮類藥物在長(zhǎng)期的使用過程中導(dǎo)致菌體基因突變等原因造成的。

氨基糖甙類平均耐藥率已達(dá)到55%，該類藥物在生產(chǎn)實(shí)踐中已存在長(zhǎng)期普遍性耐藥。遺傳耐藥性已較為廣泛。

而頭孢類藥物耐藥情況表現(xiàn)為，對(duì)第1代頭孢（頭孢唑林）的耐藥性較高，耐藥率達(dá)到70%；而對(duì)2，3，4代頭孢的耐藥率平均為26.6%。在對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，具有可遺傳性耐藥的僅占28.5%，其余大部分是由于用藥環(huán)境不當(dāng)（如抗生素的長(zhǎng)期使用、不規(guī)范使用等）激發(fā)菌體主動(dòng)外排機(jī)制活躍而引起，這種情況在用藥環(huán)境改善后會(huì)逐步消除。

從山西省雞源致病性大腸桿菌耐藥情況來看，喹諾酮類和氨基糖甙類由于耐藥水平較高且具有較高遺傳性，因而在實(shí)際生產(chǎn)中建議不作為首選用藥。頭孢藥物中除一代頭孢外，均對(duì)菌體具有一定的藥物敏感性，且其中具有遺傳性耐藥的比率很低，可作為首選用藥推薦使用。

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