劉芳 陳廣俠 馬蕾 楊煜 郭曉 楊曉慧 董道峰 楊元軍

摘要：富含花青素的馬鈴薯塊莖因含有大量多糖和多酚類次級(jí)代謝產(chǎn)物而難以大量提取高質(zhì)量的總RNA。本研究以紫色和紅色馬鈴薯為材料，利用改良Trizol法實(shí)現(xiàn)了塊莖總RNA的快速高質(zhì)量提取。試驗(yàn)結(jié)果表明，在Trizol法中添加2%（V/V）-巰基乙醇、0.75%（W/V）十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和7.5%（W/V）醋酸鉀（KOAc），可以有效去除多糖、多酚類物質(zhì)，獲得高產(chǎn)、完整的總RNA。改良Trizol法提取時(shí)間短、操作方便，提取的RNA通過了actin RT-PCR和18S rRNA RT-qPCR檢驗(yàn)，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;塊莖;花青素;RNA提取;醋酸鉀;改良Trizol法

中圖分類號(hào)：S532.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）12-0114-05

馬鈴薯是糧菜兼用作物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，有“地下蘋果”的美譽(yù)。紫色和紅色馬鈴薯除具有普通馬鈴薯的優(yōu)良性狀，還含有大量花青素[1]。花青素具有殺菌、清除氧自由基和抗衰老的作用，可以降低心腦血管疾病、癌癥和糖尿病等的發(fā)生[2， 3]。隨著人們對(duì)富含花青素馬鈴薯重要性認(rèn)識(shí)的增加，此類材料的分子生物學(xué)研究也逐漸開展起來。RNA提取是分子生物學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、cDNA文庫構(gòu)建均需要高質(zhì)量的RNA。目前，用于馬鈴薯塊莖RNA的提取方法主要有Trizol法[4， 5]、CTAB法、異硫氰酸胍法[6]、SDS-酚法[7]、LiCl法[8]。由于富含花青素的馬鈴薯塊莖含有大量多糖、酚類等次級(jí)代謝產(chǎn)物[9， 10]，這些提取方法難以滿足此類馬鈴薯塊莖總RNA提取的需要。獲得大量高質(zhì)量的塊莖總RNA成為富含花青素馬鈴薯分子生物學(xué)研究的迫切需要，因此本試驗(yàn)采用改良Trizol法研究了紫色和紅色馬鈴薯塊莖RNA的高質(zhì)量提取方法，以期為富含花青素馬鈴薯材料的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料與試劑

供試材料：馬鈴薯四倍體材料SD92和SD140，其中SD92為紫皮紫肉類型，SD140為紅皮紅肉類型。SD92和SD140種植于溫室。70 d收獲，收獲后的塊莖洗凈后用吸水紙吸干水分，迅速切成片后用液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：焦碳酸二乙酯（DEPC）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鋰（LiCl）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（Agarose）、溴化乙錠（EB）均為 Sigma 公司產(chǎn)品;Trizol 試劑購自Ambion（USA）;PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit為TaKaRa產(chǎn)品;DNaseⅠ購自Thermo（USA）; RT-qPCR采用康為世紀(jì)公司UltraSYBR Mixture;Marker為DL1000 DNA Marker （TaKaRa），引物由上海生工合成;醋酸鉀（KOAc）、醋酸鈉（NaAc）等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

器皿處理：將所用的槍頭及離心管用0.1% DEPC滅菌水浸泡12 h，隨后121℃滅菌20 min，倒掉廢液，然后80℃烘8 h。對(duì)于所用的研缽和金屬藥勺，用錫箔紙封口后在 180℃烘烤8 h。所用試劑均用無RNase的0.1% DEPC滅菌水配制。

1.2?RNA提取方法

方法一：采用Trizol法和改良的Chan法提取RNA，Trizol法參照說明書，改良的Chan法具體步驟參照趙寶勰等的方法[9]。

方法二：采用改良的Trizol法提取RNA，具體步驟如下：（1）取馬鈴薯塊莖適量，加液氮和少許PVPP充分研磨，然后取0.1 g研磨材料，加入1 mL的Trizol和2% （V/V） -巰基乙醇混勻，室溫放置10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min;（2）取上清于1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿混勻，室溫放置10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min;（3）取上清于1.5 mL離心管中，然后分別加入1/4氯仿和等于上清體積的其他溶液（表1）顛倒混勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min;（4）取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min;（5）棄上清，加入1 mL的75%（V/V）預(yù)冷乙醇短暫離心，洗滌沉淀后，室溫晾干約5～10 min。（6）RNA干燥后用20 μL DEPC-H2O溶解，-80℃保存。140 V（6 V/cm）電泳15 min，溴化乙錠（EB）染色，Bio-Rad （USA）凝膠成像儀檢測(cè)RNA的完整性;利用 Nanophotometer P330 （IMPLEN，Germany）測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。

1.3?RNA的RT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)

首先采用DNase Ⅰ（Thermo，USA）對(duì)RNA進(jìn)行消化，具體步驟如下：取2 μL采用1.5% CTAB+15% KOAc（pH5.2）提取的RNA，1 μL 10buffer，1 μL DNaseⅠ，DEPC-H2O補(bǔ)足10 μL。37℃消化60 min，最后加入50 mmol/L EDTA 1 μL，65℃、10 min滅活DNaseⅠ。PCR檢測(cè)消化結(jié)果。取1 μL消化完全的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），具體步驟參照說明書。利用PCR擴(kuò)增馬鈴薯肌動(dòng)蛋白基因actin（XM_006351284.1）片段來檢測(cè)消化和反轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。PCR反應(yīng)體積為50 L，引物分別為actin F：5′-GATGGTGTCAGCCACAC-3′和actin R：5′-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3′。PCR程序：94℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。分別以1 L消化產(chǎn)物和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增actin片段，最后1% 瓊脂糖電泳檢測(cè)消化和反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。

對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，50 μL反應(yīng)體系，25 μL 2UltraSYBR Mixture （CWBIO）、1 μL cDNA、0.2 μmol/L引物和ddH2O。RT-qPCR反應(yīng)在iCycler iQ （Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中進(jìn)行，流程為95℃ 15 s，60℃ 1 min，37個(gè)循環(huán)，3次重復(fù)。擴(kuò)增基因?yàn)?8S rRNA，引物分別為18S F：5′-CCTGGTCGGCATCGTTTA-3′，18S R：5′-CGAACAACTGCGAAAGCAT-3′。

2?結(jié)果與分析

2.1?Trizol法與改良Chan法提取RNA

Trizol法提取RNA時(shí)，未見紫色馬鈴薯和紅色馬鈴薯塊莖的RNA條帶，RNA未能成功提取，同時(shí)沒有DNA殘留。利用改良Chan法提取出的RNA有彌散帶，RNA降解嚴(yán)重，并且有大分子量的條帶，說明有DNA殘留。

2.2?改良Trizol 法提取RNA

在紫色馬鈴薯SD92和紅色馬鈴薯SD140塊莖中，3個(gè)處理均可以提取出RNA。而且3% CTAB + 30% KOAc（pH9.1）處理和3% CTAB + 30% KOAc（pH5.2）處理效果最佳，18S rRNA和28S rRNA條帶清晰完整，且RNA產(chǎn)量較高。而3 mol/L NaAc（pH5.2）處理提取的RNA產(chǎn)量明顯少于前兩個(gè)處理，尤其是在SD140中，效果更為明顯。

不同濃度CTAB和KOAc組合可以提取SD92 和SD140塊莖中完整的RNA，包括28S、18S、5S rRNA。從表2可以看出，在0.75%～3% CTAB和7.5%～30% KOAc時(shí)，CTAB和KOAc濃度越低，提取的RNA總量越大。添加3% CTAB和30% KOAc時(shí)，SD140和SD92的RNA提取量分別為410 ng/μL和442 ng/μL，而在0.75% CTAB和7.5% KOAc時(shí)，它們的提取量分別為982 ng/μL和600 ng/μL，后者的提取量是前者的2.40倍和1.36倍。另外，在SD92和SD140提取RNA的3種處理中，提取的RNA OD260/OD280都大于1.80，說明蛋白質(zhì)的殘留量很低，RNA質(zhì)量良好。

利用管家基因actin擴(kuò)增檢測(cè)Trizol提取RNA的消化和反轉(zhuǎn)錄效果。通過PCR，RNA、cDNA和DNA均能擴(kuò)增出actin條帶，消化后的RNA未擴(kuò)增出條帶，說明DNA消化完全，提取的RNA質(zhì)量?jī)?yōu)，雜質(zhì)殘留量低，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)。

利用18S rRNA檢測(cè)改良Trizol法提取RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA的RT-qPCR效果。兩種材料中18S rRNA的擴(kuò)增曲線是光滑的，兩個(gè)樣品的Ct值< 20，并且熔解曲線是單一峰，說明反轉(zhuǎn)錄的cDNA達(dá)到了熒光定量檢測(cè)的要求，表明改良Trizol法提取的RNA可以用于后續(xù)的熒光定量檢測(cè)。

3?討論與結(jié)論

富含花青素的馬鈴薯塊莖中含有多糖、酚類化合物，蛋白質(zhì)和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，采用Trizol法和改良的Chan法不能從該類塊莖中提取出完整的RNA。Trizol法簡(jiǎn)單方便、耗時(shí)較短，但不能有效除掉塊莖中的多糖。而RNA與多糖可以形成共沉淀[11]，導(dǎo)致RNA難以分離。Chan法提取RNA時(shí)，使用3 mol/L NaAc有效去除塊莖中的多糖，但是步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，導(dǎo)致RNA出現(xiàn)了降解;并且該法利用LiCl選擇性沉淀RNA效果不佳，導(dǎo)致大量DNA殘留。

改良Trizol法提取RNA純度高、完整性好，可以用于后續(xù)的RT-PCR和RT-qPCR等分子生物學(xué)試驗(yàn)。該法操作簡(jiǎn)單方便，單樣品提取時(shí)間約90 min。改良Trizol法較Trizol法在提取過程中添加了PVPP、β-巰基乙醇、CTAB和KOAc。PVPP可以與酚類物質(zhì)結(jié)合[12]，從而除去塊莖中的酚類。β-巰基乙醇作為一種變性劑可以去除RNase和其他一些活性酶，有效阻止RNA的降解和酚類向醌類的轉(zhuǎn)化[13， 14]。由于在低鹽條件下，多糖會(huì)與核酸形成膠狀沉淀[15， 16]，所以提取RNA時(shí)需要高鹽環(huán)境，而常用的NaCl對(duì)RNA提取的效果有限[17]。在本試驗(yàn)中，采用高濃度的KOAc和NaAc去除多糖，與KOAc相比，NaAc提取RNA的產(chǎn)量較低，說明Na+對(duì)RNA的提取效果差于K+，采用KOAc去除多糖效果更好。CTAB作為一種很強(qiáng)的離子變性劑，可以使核酸從植物組織中充分分離[18， 19]。KOAc和CTAB共同使用，可以使RNA與多糖等其它代謝產(chǎn)物在充分分離的條件下，獲得高純度的RNA。

總之，改良Trizol法可以高效地提取富含花青素馬鈴薯塊莖的RNA，提取的RNA可以用于后續(xù)的基因表達(dá)分析等分子生物學(xué)試驗(yàn)。此法對(duì)于其它富含多糖、多酚和花青素等代謝產(chǎn)物作物RNA的提取提供了參考。

參?考?文?獻(xiàn)：

[1]?Brown C R， Culley D， Bonierbale M， et al. Anthocyanin， carotenoid content， and antioxidant values in native South American potato cultivars[J]. HortScience， 2007， 42（7）： 1733-1736.

[2] Liu Y H， Wang K L， Deng C， et al. Comparative transcriptome analysis of white and purple potato to identify genes involved in anthocyanin biosynthesis[J]. PLoS ONE， 2015，10（6）：e0129148.

[3] Bontempo P， Carafa V， Grassi R， et al. Antioxidant， antimicrobial and anti-proliferative activities of Solanum tuberosum L. var. Vitelotte[J]. Food and Chemical Toxicology， 2013， 55： 304-312.

[4] 劉柏林， 尤佳， 張寧， 等. 3種商品化Trizol試劑提取高質(zhì)量馬鈴薯塊莖總RNA的比較[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 2（1）： 59-63.

[5] Wei Q， Wang Q L， Feng Z H， et al. Increased accumulation of anthocyanins in transgenic potato tubers by overexpressing the 3GT gene[J]. Plant Biotechnology Reports， 2012， 6：69-75.

[6] 王偉， 李立芹， 鄒雪， 等. 馬鈴薯塊莖總RNA提取方法比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（1）： 38-40.

[7] 白斌， 張金文. 馬鈴薯塊莖RNA提取及RT-PCR法克隆酸性轉(zhuǎn)化酶基因[J]. 分子植物育種， 2005， 3（3）： 479-484.

[8] Stushnoff C， Ducreux L J M， Hancock R D， et al. Flavonoid profiling and transcriptome analysis reveals new gene-metabolite correlations in tubers of Solanum tuberosum L.[J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61（4）： 1225-1238.

[9] 趙寶勰， 程李香， 林必博， 等. 兩種馬鈴薯塊莖總RNA提取方法的比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（1）：124-127.

[10]Lachman J，Hamouz K. ?Nutrition-a review[J]. Plant Soil and Environment， 2005， 51： 477-482.

[11]Gao J W， Liu J Z， Li B， et al. Isolation and purification of functional total RNA from blue-grained wheat endosperm tissues containing high levels of starches and flavonoids[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2001， 19（2）： 185-186.

[12]Bridi R， Troncoso M J， Folch-Cano C， et al. A Polyvinylpolypyrrolidone （PVPP）-assisted folin-ciocalteu assay to assess total phenol content of commercial beverages[J]. Food Analytical Methods，2014，7（10）： 2075-2083.

[13]Rashid A， Baldwin T， Gines M， et al. A high-throughput RNA extraction for sprouted single-seed barley （Hordeum vulgare L.） rich in polysaccharides[J]. Plants， 2017，6（1）：1.

[14]Tong Z G， Qu S C， Zhang J Y， et al. A modified protocol for RNA extraction from different peach tissues suitable for gene isolation and real-time PCR analysis[J]. Molecular Biotechnology， 2012， 50： 229-236.

[15]Sabzevari A G， Hosseini R. A quick， efficient， and cost-effective method for isolating high-quality total RNA from tomato fruits， suitable for molecular biology studies[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology， 2014， 44： 418-431.

[16]Birtic S， Kranner I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol， polysaccharide and lipid-rich seeds[J]. Phytochemical Analysis， 2006， 17（3）：144-148.

[17]Deepa K， Sheeja T E， Santhi R， et， al. A simple and efficient protocol for isolation of high quality functional RNA from different tissues of turmeric （Curcuma longa L.）[J]. Physiological and Molecular Biology Plants， 2014， 20（2）：263-271.

[18]Kim S H， Hamada T. Rapid and reliable method of extracting DNA and RNA from sweet potato， Ipomoea batatas （L）. Lam[J]. Biotechnology Letters， 2005， 27（23）： 1841-1845.

[19]Wang X C， Tian W M， Li Y X. Development of an efficient protocol of RNA isolation from recalcitrant tree tissues[J]. Molecular Biotechnology， 2008， 38（1）： 57-64.