DNAzymes針對Ezrin mRNA的反義技術(shù)靶點(diǎn)篩選及驗(yàn)證

潘輝龍 張國如 王晉 吳興源

[摘要] 目的 分析腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（Ezrin mRNA）的結(jié)構(gòu)，尋找并驗(yàn)證DNAzymes作用的最佳靶點(diǎn)。 方法 利用RNAstructure與RNAdraw程序分析Ezrin mRNA結(jié)構(gòu)，計(jì)算其一、二級結(jié)構(gòu)，兩種程序同時(shí)計(jì)算出堿基未配對的單鏈成環(huán)區(qū)，且連續(xù)存在4個(gè)以上，則將其設(shè)為反義技術(shù)的靶區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)DNAzymes的作用靶點(diǎn)，再依據(jù)最低自由能原則，運(yùn)用計(jì)算機(jī)中的OligoWalk程序進(jìn)行篩選，以此方式得到各反義技術(shù)的作用靶點(diǎn)，以實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果。 結(jié)果 兩種軟件預(yù)測的共同的單鏈區(qū)共42個(gè)，其中完全匹配的單鏈區(qū)21個(gè)，編碼區(qū)具27個(gè)。AU1655、AU1751、AU1766、AU1789及GU2623位于連續(xù)未配對堿基超過10個(gè)的單鏈區(qū)，僅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。酶切反應(yīng)結(jié)果顯示DNAzymes在AU1751位點(diǎn)能夠最為理想地切割Ezrin mRNA。結(jié)論 相對于傳統(tǒng)的單純依靠實(shí)驗(yàn)來尋找靶點(diǎn)，核酸二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)能夠更精確、快速地處理靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選取問題。AU1751位點(diǎn)相對應(yīng)的DNAzymes不易形成穩(wěn)定的自身雜合體，有利于DNAzymes結(jié)合RNA。

[關(guān)鍵詞] Ezrin;反義技術(shù);靶點(diǎn);DNAzymes;二級結(jié)構(gòu)

[中圖分類號] R73 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the structure of distant metastasis associated protein （Ezrin mRNA） and find and verify the best target of DNAzymes. Methods RNAstructure and RNAdraw programs were used to analyze the structure of Ezrin mRNA and calculate its first or secondary structure. If RNAstructure and RNAdraw simultaneously calculate 4 or more unpaired single chain ring forming regions， the single chain ring forming region would be set as the target area of antisense technology for the design of the target of the DNAzymes. Then， according to the principle of minimum free energy， the OligoWalk program was used for screening， and the target of each antisense technology was screened by screening. The experimental method was used to verify the prediction results. Results There were 42 common single chain regions predicted by the two software， of which 21 were single matched， and 27 were coding regions. AU1655， AU1751， AU1766， AU1789 and GU2623 were located in the single chain region over 10 consecutive unpaired bases. Only AU1655， AU1751， AU1766 and AU1789 meet the requirements. The results of enzyme digestion showed that DNAzymes could cut Ezrin mRNA most ideally at AU1751 site. Conclusion Compared with the traditional experiment to find the target， the combined thermal dynamic parameters of the two stage structure of nucleic acid could deal with the design and selection of the target more accurately and quickly. The DNAzymes corresponding to the AU1751 locus is less likely to form stable self heterozygotes， which is beneficial to DNAzymes binding to RNA.

[Key words] Ezrin; Antisense technology; Target; DNAzymes; Secondary structure

Ezrin是一種細(xì)胞骨架蛋白，具有連接細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的功能，屬于ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族，其作用在于維持細(xì)胞正常形態(tài)，在細(xì)胞一系列生理功能中扮演著重要的角色[1]。大量研究結(jié)果表明，Ezrin蛋白在多種惡性腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[2-5]，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)[6-7]。因此，將Ezrin蛋白作為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療可能成為惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)新的治療路徑。反義技術(shù)建立在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上，能夠使RNA的分子與目的基因特異性結(jié)合，令mRNA被切割或降解，使其表達(dá)受到抑制[8]。但靶點(diǎn)可能被基因的二級結(jié)構(gòu)所隱藏，因而限制了反義技術(shù)的應(yīng)用。最常用的反義技術(shù)之一為DNAzymes，是一種人工合成的單鏈的小DNA分子，可以在特定位點(diǎn)對RNA分子進(jìn)行切割，從而下調(diào)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。本研究聯(lián)合核酸二級結(jié)構(gòu)和熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)來綜合預(yù)測DNAzymes的作用位點(diǎn)，以探求一種合理的設(shè)計(jì)方式使反義技術(shù)能夠運(yùn)用于Ezrin。

1 對象與方法

1.1 研究對象

自GenBank數(shù)據(jù)庫篩選出編碼為X51521.1的人類Ezrin蛋白mRNA全長序列，在其中獲取3044個(gè)堿基編碼Ezrin蛋白的基因。通過RNAstructure與RNAdraw程序分析Ezrin mRNA結(jié)構(gòu)，分析計(jì)算其一、二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。兩種程序同時(shí)計(jì)算出堿基未配對的單鏈成環(huán)區(qū)，且連續(xù)存在4個(gè)以上，則將其設(shè)為反義技術(shù)的靶區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)DNAzymes的作用靶點(diǎn)，再依據(jù)最低自由能原則，運(yùn)用計(jì)算機(jī)中的OligoWalk程序進(jìn)行篩選，以此方式得到各反義技術(shù)的作用靶點(diǎn)，篩選結(jié)果為AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及DNAzymes合成

人成骨肉瘤耐藥細(xì)胞系MG63/DOX（100萬細(xì)胞數(shù)）購買自上海酶研生物公司，將細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液中，加入10%小牛血清，37℃培養(yǎng)使其貼壁生長，每隔6 h觀察1次，至細(xì)胞90%融合后，取出，嚴(yán)格按照說明書提取RNA。Trizol總RNA抽提試劑盒購自上海滬峰化工有限公司。DNAzymes委托上海生工公司合成。與RNA提取試劑盒提取總RNA后，用紫外分光光度儀測定濃度與質(zhì)量，行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并以cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。以Ezrin編碼區(qū)1761 bp作為底物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并克隆入T-tailed載體中合成質(zhì)粒并測序。根據(jù)篩選出的AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789四個(gè)切割位點(diǎn)分別合成相應(yīng)的DNAzymes。在體外，采用DNAzymes鑒定EzrincRNA的酶切反應(yīng)與底物。

1.3 EzrinmRNA一、二級結(jié)構(gòu)與熱動(dòng)力學(xué)的分析及預(yù)測

用軟件RNAdraw和RNAstructure分析EzrinmRNA全長序列以及其一、二級結(jié)構(gòu)，同時(shí)檢測Ezrin mRNA一級結(jié)構(gòu)內(nèi)堿基數(shù)量及含量、37℃時(shí)EzrinmRNA的二級結(jié)構(gòu)[10]。將兩種軟件計(jì)算出RNA二級結(jié)構(gòu)中共同的單鏈區(qū)，若在連續(xù)4個(gè)以上出現(xiàn)沒有配對的堿基區(qū)域，則將其設(shè)計(jì)作為DNAzymes的作用的靶點(diǎn)。用核酸熱動(dòng)力學(xué)軟件OligoWalk對DNAzymes和EzrinmRNA作用位點(diǎn)結(jié)合后形成的雜合體進(jìn)行熱穩(wěn)定性計(jì)算[11-12]。

2 結(jié)果

2.1 EzrinmRNA結(jié)構(gòu)預(yù)測

兩種軟件預(yù)測的共同的單鏈區(qū)共42個(gè)，其中完全匹配的單鏈區(qū)21個(gè)，編碼區(qū)具有27個(gè)。42個(gè)單鏈區(qū)的18個(gè)AU和GU位點(diǎn)被挑選作為DNAzymes的作用位點(diǎn)，其中12個(gè)在編碼區(qū)。見表2。

2.2 EzrinmRNA切割位點(diǎn)的篩選

OligoWalk軟件被用于計(jì)算DNAzymes和EzrinmRNA作用位點(diǎn)結(jié)合后的熱穩(wěn)定性，18個(gè)AU或GU位點(diǎn)的GBreak-targ、Goverall、Goligo-oligo和Goligo-self，見表2。依據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，僅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。該4個(gè)位點(diǎn)與所在的Ezrin mRNA二級結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，且均集中位于A1654-A1797編碼區(qū)，見圖1，可見有效的DNAzymes作用位點(diǎn)相對集中在特定區(qū)域。

2.3 酶切反應(yīng)結(jié)果

酶切反應(yīng)結(jié)果顯示，在預(yù)期位點(diǎn)成功切割Ezrin全長mRNA的只有AU1751相對應(yīng)的DNAzymes，經(jīng)反應(yīng)后可見，AU1751位點(diǎn)所剩的底物最少。且此位點(diǎn)相對應(yīng)的DNAzymes，其△Goligo-oligo為0 kcal/mol，高于其他DNAzymes。

3 討論

導(dǎo)致惡性腫瘤患者的預(yù)后較差及患者死亡的主要因素是腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，Ezrin蛋白已被證實(shí)在骨肉瘤[13-14]等惡性腫瘤中扮演者重要角色。

反義技術(shù)作為基因治療的方式之一，近年來得到了較快的發(fā)展，其中最常見的為DNAzymes反義技術(shù)，其具有廣闊的應(yīng)用前景。有研究[15]表明位點(diǎn)是否被隱藏，嚴(yán)重影響著反義技術(shù)的應(yīng)用。雖然DNAzymes的位點(diǎn)被認(rèn)為與其他反義技術(shù)相似，但目前尚缺乏直接的研究證據(jù)支持，因此，高效的選擇DNAzymes對于其靶基因的作用點(diǎn)具有重要的研究意義。

在影響反義技術(shù)效果的因素中，靶基因的二級結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。鑒于RNA的潛在二級結(jié)構(gòu)可能阻礙DNAzymes與靶基因結(jié)合的。反義分子與靶基因在二級結(jié)構(gòu)最簡單的區(qū)域結(jié)合最為牢固，因此研究者選擇作用位點(diǎn)時(shí)，單鏈區(qū)比雙鏈區(qū)有更大的優(yōu)勢[16]，高活性的反義分子作用位點(diǎn)被認(rèn)為存在于mRNA中未形成二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域內(nèi)[17]，反義技術(shù)的作用位點(diǎn)是否因?yàn)槎壗Y(jié)構(gòu)而被隱藏，與靶基因的單鏈區(qū)密切相關(guān)。對兔β-globinmRNA進(jìn)行研究的結(jié)果證實(shí)了單鏈區(qū)對作用位點(diǎn)是否可及具有具有決定作用[18]。有研究提出DNAzymes的切割位點(diǎn)至少應(yīng)該存在連續(xù)4個(gè)以上未配對的堿基成環(huán)區(qū)[19]，超過10個(gè)堿基連續(xù)未配對區(qū)對于選擇反義分子作用位點(diǎn)是更為理想的區(qū)域。

由于mRNA存在二級結(jié)構(gòu)，掩蓋了相當(dāng)部分的DNAzymes作用位點(diǎn)，因此不能成功結(jié)合反義分子，難以發(fā)揮作用下調(diào)金銀的表達(dá)，因此本研究目的不僅在于篩選租用位點(diǎn)，還需要對其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過軟件計(jì)算，本研究得到了4個(gè)作用位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均在連續(xù)10個(gè)以上未成對堿基形成的環(huán)狀區(qū)，其中AU1751位點(diǎn)相應(yīng)的DNAzymes能夠成功切割EzrinmRNA，得到的片段與預(yù)期相符合。

DNAzymes和底物相互作用后，形成雜合體的熱動(dòng)力學(xué)也影響著eDNAzymes對EzrinmRNA的切割。雜合體的熱穩(wěn)定性不僅與RNA雜合區(qū)域結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與反義分子結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性有關(guān)。本研究將Goverall（-25.0 kcal/mol）設(shè)定為為評估標(biāo)準(zhǔn)，用以評價(jià)DNAzymes和靶基因雜交熱穩(wěn)定性，最終選出的4個(gè)位點(diǎn)均集中位于A1654～A1797編碼區(qū)，可見有效的DNAzymes其作用位點(diǎn)傾向于在某一個(gè)特定的區(qū)域相對集中。酶切反應(yīng)結(jié)果顯示，在預(yù)期位點(diǎn)成功切割Ezrin全長mRNA的只有AU1751相對應(yīng)的DNAzymes，經(jīng)反應(yīng)后可見，AU1751位點(diǎn)所剩的底物最少，說明DNAzymes在AU1751位點(diǎn)能夠最為理想地切割Ezrin mRNA。且此位點(diǎn)相對應(yīng)的DNAzymes，其△Goligo-oligo為0 kcal/mol，高于其他DNAzymes，可見另外三個(gè)位點(diǎn)的DNAzymes可能形成自身雜合體，且較為穩(wěn)定，不利于DNAzymes結(jié)合RNA。推測DNAzymes與靶基因雜交時(shí)，△Goligo-oligo可用于預(yù)測其熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

另外，盡管RNA二級結(jié)構(gòu)在反義技術(shù)中起至關(guān)重要的作用，但核酸三級結(jié)構(gòu)也可能影響RNA與蛋白質(zhì)之間的作用，限制其預(yù)測價(jià)值，因此，多種方法預(yù)測作用位點(diǎn)有其必要性。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了預(yù)測所得位點(diǎn)的驗(yàn)證，但將其應(yīng)用到腫瘤的治療中，還需要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以明確其應(yīng)用前景。

綜上所述，應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序預(yù)測與篩選針對EzrinmRNA的DNAzymes作用位點(diǎn)，相對于單純實(shí)驗(yàn)方式，更為精確與快速、高效，將實(shí)驗(yàn)與計(jì)算機(jī)技術(shù)聯(lián)合在一起，聯(lián)合多學(xué)科進(jìn)行研究，有利于更大限度發(fā)揮反義技術(shù)的靶向治療作用。

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（收稿日期：2018-06-05 ?本文編輯：任 ? 念）