FSH和LH及其受體基因在梅山豬公豬HPT軸的表達(dá)

產(chǎn)舒恒，陳子璇，張戌園，陳 青，王宵燕

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

動(dòng)物體內(nèi)的促性腺激素包括垂體前葉分泌的卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)、胎盤分泌的孕馬血清促性腺激素和絨毛膜促性腺激素以及垂體前葉和胎盤分泌的促乳素。其中，F(xiàn)SH、LH及其相關(guān)基因是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的生理功能基因。在雄性動(dòng)物中，F(xiàn)SH促進(jìn)睪丸足細(xì)胞合成和分泌雄激素，刺激生精上皮的發(fā)育和精子發(fā)生(在次級(jí)精母細(xì)胞及其以前的階段，F(xiàn)SH起重要作用，此后由睪酮起主要作用)。LH刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌睪酮，促進(jìn)副性腺的發(fā)育和精子最后成熟[1]。

FSH是一種糖蛋白激素，分子是由非共價(jià)鍵結(jié)合的α和β 2個(gè)亞單位組成的異質(zhì)二聚體。在同一物種中，α亞基是一致的，而β亞基是特異性的[2]。一般認(rèn)為α亞基負(fù)責(zé)信號(hào)的轉(zhuǎn)化作用，β亞基是功能亞基[3]，參與受體的結(jié)合。現(xiàn)在認(rèn)為，α、β亞基均參加受體的結(jié)合與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。LH也是一種糖蛋白激素，它的分子結(jié)構(gòu)與FSH的分子結(jié)構(gòu)相似，由α和β 2個(gè)亞單位組成，α亞基為促性腺激素所共有，β亞基具有激素和種間特異性，是激素的特異性亞基單位，能與靶器官受體結(jié)合。目前，對(duì)FSH-β亞基和LH-β亞基的研究較多，如趙要風(fēng)等對(duì)豬FSH-β亞基基因的研究表明，F(xiàn)SHβ基因在幾個(gè)豬品種之間存在多態(tài)性，而且是作為一種促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟的糖蛋白激素，高排卵數(shù)豬品種二花臉、梅山豬與其他低排卵數(shù)品種表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的差異[3]。對(duì)于FSH和LH的作用，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為FSH、LH只對(duì)性腺有作用，但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在性腺外的組織上也存在這2種激素受體，王亞男對(duì)京海黃雞FSHβ和FSHR基因的表達(dá)規(guī)律的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因在脾臟中的表達(dá)量?jī)H次于性腺[4]，說(shuō)明FSH、LH在性腺外組織中也可能起作用，李波等對(duì)母豬性腺外FSH受體和LH受體表達(dá)的研究也證明了這一點(diǎn)[5]。關(guān)于FSH和LH在動(dòng)物體中的發(fā)育性表達(dá)研究進(jìn)展迅速，倪迎冬等研究了出雛至性成熟紹鴨卵巢FSHR和LHR表達(dá)的變化，結(jié)果顯示卵巢FSHR mRNA水平呈先升后降趨勢(shì)，LHR mRNA水平的變化，總體呈逐漸升高趨勢(shì)[6]。郝建明等論證了垂體前葉存在著LH、FSH、LH-FSH等3種促性腺激素細(xì)胞，為進(jìn)一步探討FSH、LH分泌及基因表達(dá)與調(diào)控，揭示生殖生理規(guī)律提供了新的資料和思路[7]。近年來(lái)，基因工程重組FSH和LH的研究逐步發(fā)展，使人們可根據(jù)一些特殊需求改造天然FSH和LH的結(jié)構(gòu)和功能，使之具有更高的活性、更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，以滿足畜牧生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的需要。同時(shí)，也為其他糖蛋白激素基因工程制劑的研制生產(chǎn)提供借鑒[8]。

本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法和熒光定量(PCR)方法分析FSH和LH在梅山豬公豬腦組織、生殖組織和內(nèi)臟組織中的表達(dá)特征及表達(dá)規(guī)律，確定FSH和LH在不同發(fā)育階段中的表達(dá)量以及它們?cè)诩?xì)胞中的定位，這將有助于更好地了解它們?cè)诰影l(fā)生過(guò)程中的作用和對(duì)睪丸功能的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物梅山豬由江蘇省蘇太豬育種中心提供。取6頭150日齡的梅山豬公豬睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、精囊腺、前列腺、尿道球腺、大腦、小腦、下丘腦、垂體、海馬、心、肝、脾、肺、胃及肌肉等組織用于表達(dá)譜分析。將2(n=6)、30(n=6)、60(n=5)、90(n=5)和150日齡(n=6)的梅山豬在屠宰后取下丘腦、垂體、右側(cè)睪丸用于基因的發(fā)育性表達(dá)研究。

1.2 試劑與儀器

試劑：液氮、TRIzol[寶生物工程(大連)有限公司]、三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、DEPC水(Fermentas)、超純水、Oligo(dT)18(Fermentas)、5×反應(yīng)緩沖液(Fermentas)、Ribonuclease Inhibitor(Fermentas，20 U/μL)、dNTP(Fermentas 10 mmol/L)、M-MuLV Reverse Transcriptase(Fermentas，200 U/μL)、10×buffer[寶生物工程(大連)有限公司]、4×dNTP[寶生物工程(大連)有限公司，2.5 mmol/L]、Taq酶[寶生物工程(大連)有限公司，5 U/μL]、引物(上海英維捷基生物工程有限公司)、瓊脂糖(MBI Fermentas)、5×TAE水、Marker(TaKaRa公司)、熒光定量試劑盒。

試驗(yàn)器材：研缽、研磨棒、勻漿器、4 ℃離心機(jī)、指形管、紫外分光光度儀、PCR管、水浴鍋、普通離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、PCR儀、烘箱、電泳儀和紫外成像儀、熒光定量PCR儀。

1.3 組織樣品RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

1.3.1 樣品RNA的提取與濃度測(cè)定 采用酚-三氯甲烷-異戊醇的方法提取組織RNA。提取的RNA用一定量的DNAase(RNAase free)消化，測(cè)D260 nm/280 nm，采用電泳法檢測(cè)RNA純度。嚴(yán)格定量后，取5 μg組織總RNA利用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄與半定量檢測(cè)目的基因的表達(dá) 取RNA樣品5 μg，按照試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物序列等信息見(jiàn)表1。目標(biāo)基因PCR體系(25 μL)：超純水17.3 μL；10×buffer 2.5 μL；4×dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL；rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL；上游引物(F端)1 μL；下游引物(R端)1 μL；模板DNA 1 μL。目標(biāo)基因PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min；真變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，循環(huán)數(shù)為35次。瓊脂糖電泳檢測(cè)并拍照分析。

表1 檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)情況所用引物序列等信息

1.4 熒光定量

以2、30、60、90及150日齡梅山豬下丘腦、垂體和睪丸為模板研究FSH和LH發(fā)育性表達(dá)變化。20 μL反應(yīng)體系：Mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA樣品 50 ng，加水至20 μL。樣品在96孔板混勻后放入ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序參照SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)說(shuō)明書。

定量PCR的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT分析。CT值由ABI7500的軟件自動(dòng)分析。以β-actin為內(nèi)參，150日齡組作對(duì)照，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)1、30、60、90日齡組-(CT目的基因-CT管家基因)150日齡組。2-ΔΔCT表示2、30、60、90日齡組目的基因的表達(dá)量相對(duì)于150日齡的變化倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析對(duì)FSH、LH及其受體在不同日齡的公豬HPT軸相關(guān)組織中的表達(dá)進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSH和LH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內(nèi)臟組織中的表達(dá)特征

2.1.1 FSH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內(nèi)臟組織中的表達(dá)特征 由圖1可見(jiàn)，F(xiàn)SHβ基因只在梅山豬公豬的下丘腦和垂體中表達(dá)，在垂體中表達(dá)豐度較高，在下丘腦中較低；FSHR基因在梅山豬公豬的睪丸、在附體、附尾和尿道球腺中表達(dá)，在睪丸中表達(dá)豐度較低，在附體、附尾和尿道球腺中的表達(dá)豐度基本一致。

2.1.2 LH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內(nèi)臟組織中的表達(dá)特征LHβ基因在梅山豬公豬的睪丸、附頭、附體、垂體、大腦、小腦和海馬中表達(dá)，在小腦中的表達(dá)豐度較低；LHR基因在梅山豬公豬的睪丸和下丘腦中表達(dá)，表達(dá)豐度基本相同(圖2)。

2.2 FSH和LH及其受體在不同日齡的公豬HPT軸相關(guān)組織中的表達(dá)

2.2.1 FSH及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對(duì)表達(dá)量 由表2可知，F(xiàn)SHβ在下丘腦和垂體中的相對(duì)表達(dá)量在一定范圍內(nèi)隨日齡的增加而增加，90日齡表達(dá)量開(kāi)始上升，150日齡達(dá)到表達(dá)高峰，F(xiàn)SHβ在下丘腦中的表達(dá)量在前4個(gè)日齡段中無(wú)顯著差異，150日齡的表達(dá)量與前4個(gè)日齡段存在顯著差異(P<0.05)，F(xiàn)SHβ在垂體中的表達(dá)量在90日齡時(shí)顯著高于前3個(gè)日齡段，而150日齡的表達(dá)量與前4個(gè)日齡段有顯著差異(P<0.05)；FSHR在睪丸中的相對(duì)表達(dá)量在前3個(gè)日齡段中較穩(wěn)定，90日齡時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低，150日齡達(dá)到最低值，90日齡、150日齡與前3個(gè)日齡段相比存在顯著差異(P<0.05)。

2.2.2 LH及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對(duì)表達(dá)量 由表3可知，LHβ在垂體中的表達(dá)、LHR在下丘腦中的表達(dá)和LHR在睪丸組織中的表達(dá)趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)波動(dòng)起伏狀態(tài)，30日齡出現(xiàn)表達(dá)高峰，60日齡表達(dá)量降低，90日齡時(shí)再次達(dá)到表達(dá)高峰后又降低，并且30、90日齡的表達(dá)量與其余3個(gè)日齡段的表達(dá)量多數(shù)呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；LHβ在睪丸中的表達(dá)量在前3個(gè)日齡段無(wú)顯著差異(P<0.05)，90日齡時(shí)達(dá)到表達(dá)量最高峰，其表達(dá)量與其他4個(gè)日齡段呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，150日齡時(shí)表達(dá)量有所降低。

表2 FSHβ及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對(duì)表達(dá)量

注：同一行含不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

表3 LH及其受體在垂體、下丘腦和睪丸中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

3.1 FSH和LH在公豬各個(gè)組織中的表達(dá)特征

一直以來(lái)，人們普遍認(rèn)為FSHR、LHR僅存在于特異的性腺的靶器官和組織中，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR、LHR可存在于性腺外組織[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ、LHβ和LHR在腦組織中有表達(dá)，說(shuō)明FSH和LH及其受體并不是特異性地表達(dá)在性腺組織中，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)腦組織參與和調(diào)控性激素的合成和代謝過(guò)程，F(xiàn)SH、LH也可能對(duì)腦組織的某些功能起調(diào)節(jié)作用。此外，F(xiàn)SHβ在下丘腦和垂體中均有表達(dá)，但在垂體中的表達(dá)量高于下丘腦中的，可能因?yàn)镕SHβ在垂體中的調(diào)節(jié)作用大于在下丘腦中的調(diào)節(jié)作用。精子細(xì)胞是在睪丸中生成，在附睪中發(fā)育成熟的[10]。FSHR在睪丸和附睪中均有表達(dá)，但在睪丸中的表達(dá)量比較低，說(shuō)明FSH結(jié)合FSHR可能在精子發(fā)生和成熟方面都有調(diào)控作用，但其對(duì)精子發(fā)育具有主要調(diào)控作用；LHβ在睪丸和附睪中的表達(dá)量基本相同，則其可能在精子發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中都發(fā)揮重要作用；LHR只在睪丸中表達(dá)，那么它可能對(duì)精子發(fā)生過(guò)程起重要的調(diào)控作用。有研究表明，F(xiàn)SH對(duì)雄性動(dòng)物可刺激精子的發(fā)生，它能刺激曲細(xì)精管上皮和次級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)育，在LH和雄激素的協(xié)同下使精子發(fā)育成熟。但是如果只增加FSH的量，雖能使睪丸增大、曲細(xì)精管上皮細(xì)胞分裂活動(dòng)增加、精子細(xì)胞增多，但并無(wú)成熟精子形成[11]。這一研究結(jié)果為本試驗(yàn)的推測(cè)提供了重要依據(jù)。

3.2 FSH和LH在各日齡的下丘腦、垂體和睪丸中的表達(dá)規(guī)律

陳雪雁等研究FSH和LH在不同發(fā)育階段(4、6、9周)大鼠睪丸中的表達(dá)，結(jié)果顯示在mRNA水平，在不同發(fā)育階段中FSH的表達(dá)無(wú)明顯差別，而LH只在6周和9周的大鼠中有表達(dá)[12]。位蘭等研究黃體生成素在不同日齡(1、30、90日齡)雛鴕鳥睪丸內(nèi)的分布發(fā)現(xiàn)，1 d鴕鳥睪丸內(nèi)有分布，但在30 d睪丸內(nèi)未檢測(cè)到；LH在90 d鴕鳥睪丸內(nèi)有分布，但其陽(yáng)性表達(dá)較弱[13]。Grzegorzewska等在雞胚發(fā)育的第11天和第17天的FSH和LH表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，在不同性別中FSH和LH的表達(dá)具有明顯差異[14]。上述幾項(xiàng)研究只選取了2個(gè)或3個(gè)發(fā)育階段，而本試驗(yàn)選取了梅山豬生長(zhǎng)過(guò)程的5個(gè)日齡段(2、30、60、90、150日齡)。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)SHβ在下丘腦和垂體中的表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，90日齡的表達(dá)量迅速升高，150日齡最高；LHβ在垂體中的表達(dá)、LHR在下丘腦中的表達(dá)和LHR在睪丸組織中的表達(dá)趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)波動(dòng)起伏狀態(tài)，30日齡出現(xiàn)第1次表達(dá)高峰，90日齡時(shí)又達(dá)到第2次表達(dá)高峰，出現(xiàn)這種情況的原因可能與梅山豬公豬在30日齡開(kāi)始精子發(fā)生過(guò)程和60～90日齡間到達(dá)初情期密切相關(guān)；FSHR在睪丸中的表達(dá)量與LHβ在睪丸中的表達(dá)量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，不同的是在FSHR在30日齡時(shí)表達(dá)量最高，LHβ在90日齡時(shí)表達(dá)量最高，而30日齡是精原干細(xì)胞啟動(dòng)精子發(fā)生的時(shí)期，60～90日齡是公豬的初情期啟動(dòng)階段，這一試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)公豬體內(nèi)促性腺激素對(duì)精子發(fā)生和初情期的啟動(dòng)具有調(diào)控作用。

4 結(jié)論

4.1 FSH和LH在公豬各個(gè)組織中的表達(dá)特征

FSHβ基因在梅山豬公豬的下丘腦和垂體中表達(dá)，F(xiàn)SHR基因在梅山豬公豬的睪丸、附體、附尾和尿道球腺中表達(dá)，LHβ基因在梅山豬公豬的睪丸、附頭、附體、垂體、大腦、小腦和海馬中表達(dá)，LHR基因在梅山豬公豬的睪丸和下丘腦中表達(dá)。

4.2 FSH和LH在各日齡的下丘腦、垂體和睪丸中的表達(dá)規(guī)律

FSHβ在下丘腦和垂體中的表達(dá)總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，LHβ在垂體中的表達(dá)、LHR在下丘腦中的表達(dá)和LHR在睪丸組織中的表達(dá)趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)波動(dòng)起伏狀態(tài)，30日齡出現(xiàn)第1次表達(dá)高峰，90日齡時(shí)又達(dá)到第2次表達(dá)高峰，F(xiàn)SHR在睪丸中的表達(dá)與LHβ在睪丸中的表達(dá)都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

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