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      奶牛隱性乳房炎大腸桿菌16S rRNA序列分析

      2018-03-05 08:02:34蔣成硯李橋善周文樹(shù)唐秀華
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年1期
      關(guān)鍵詞:凝膠電泳瓊脂糖隱性

      謝 昆,蔣成硯,劉 杰,李橋善,周文樹(shù),唐秀華,汪 鏡

      (1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南蒙自 661199;2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南蒙自 661199)

      奶牛乳房炎是奶牛高發(fā)病之一,極大地影響了奶牛業(yè)發(fā)展[1],根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型、非臨床型2種。其中,非臨床乳房炎即隱性乳房炎,最主要是奶牛隱性乳房炎[2],導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的病原菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌等,其中大腸桿菌較為重要[3]。目前,奶牛乳房炎的治療主要靠抗生素,但是經(jīng)過(guò)時(shí)間積累,大量使用或者濫用抗生素現(xiàn)象較為突出,導(dǎo)致抗生素大量殘留在奶牛體內(nèi),最終導(dǎo)致其產(chǎn)生耐藥菌株[4]。因此,盡早診斷出導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的病原菌,對(duì)人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要[5]。奶牛隱性乳房炎不僅給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失,而且牛奶也因?yàn)槟膛;疾《蛊錉I(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降,甚至當(dāng)人類食用帶有病原菌的牛奶后會(huì)給人類健康帶來(lái)巨大威脅[6-7]。本研究在生理生化初步鑒定的基礎(chǔ)上,提取病原菌DNA,設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)奶樣中大腸桿菌16S rRNA,并與GenBank中發(fā)表的16S rRNA序列進(jìn)行比較,以便建立一種檢測(cè)奶樣中大腸桿菌的分子生物學(xué)方法。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      經(jīng)過(guò)生理生化鑒定的大腸桿菌為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從奶樣中分離保存。

      1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

      在超凈工作臺(tái)中,將經(jīng)過(guò)生化鑒定并進(jìn)行純化培養(yǎng)后初步確定的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)液中,再將培養(yǎng)液放置在37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后提取細(xì)菌DNA。

      1.3 細(xì)菌DNA提取

      應(yīng)用CTAB結(jié)合SDS法提取大腸桿菌DNA,取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA含量。

      1.4 大腸桿菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

      根據(jù)GenBank上發(fā)表的大腸桿菌16S rRNA序列(NC002695),應(yīng)用Primier premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,引物序列如下:P1,5′-GAATCACAAAGT GGTAAGCGC-3′;P2,5′-TCGAACAATAACAGGAAACAGC-3′,以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,49.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸100 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,取5 μL樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

      1.5 PCR產(chǎn)物的測(cè)序和分析

      將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到深圳華大基因科技服務(wù)有限公司,完成正反測(cè)序,序列結(jié)果運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 細(xì)菌DNA的提取

      細(xì)菌DNA經(jīng)CTAB結(jié)合SDS法提取后于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果表明,細(xì)菌DNA約為21 000 bp(圖1)。

      2.2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

      PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖2,從圖2可以看出,PCR產(chǎn)物約為1 400 bp,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

      2.3 序列同源性對(duì)比

      PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中大腸桿菌16S rRNA基因序列(NC002695)進(jìn)行同源性對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)二者序列相似性為96%,同源性對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖3。

      3 討論與結(jié)論

      細(xì)菌基因組DNA提取方法較多,有SDS法、CTAB法[8]、傳統(tǒng)DNA抽提法、加熱煮沸發(fā)、試劑盒抽提法、chelex 100法。 本研究利用SDS、CTAB混合法提取細(xì)菌基因組DNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可看到細(xì)菌DNA提取過(guò)程中無(wú)污染,瓊脂糖凝膠條帶中無(wú)拖尾現(xiàn)象,說(shuō)明細(xì)菌提取的基因組DNA較為完整。

      16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列,存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中,具有較高的保守性,由于16S rRNA基因核苷酸序列總長(zhǎng)度適宜,結(jié)構(gòu)完整,更便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各種研究。因此設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以 16S rRNA 為靶分子在適當(dāng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,便得到擴(kuò)增后的16S rRNA片段,將擴(kuò)增后的16S rRNA基因序列與基因庫(kù)中的片段比對(duì),便可以知道未知菌與其他菌的同源性,從而完成對(duì)菌的鑒定。

      [1]李永安.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及防制研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

      [2]程振濤.奶牛隱性乳房炎的診斷方法與細(xì)菌學(xué)研究[D].貴陽(yáng):貴州大學(xué),2006.

      [3]蘇俊強(qiáng),王建亮,梁海鋒,等.奶牛隱性乳房炎發(fā)生規(guī)律探討[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(6):65-68.

      [4]閆常平.奶牛隱性乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

      [5]高會(huì)玲.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)奶牛隱性乳房炎的研究[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

      [6]尹柏雙,王秋竹,付連軍,等.隱性乳房炎奶牛乳清中部分酶活性變化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(7):276-277.

      [7]羅志堯,陳天來(lái).奶牛隱性乳房炎大腸桿菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志,2013(4):11-14.

      [8]周 彪,郭政宏,嚴(yán)亨秀.藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的提取方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(4):93-95.

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