孟慧 陳波 楊云

摘要 為探討海南降香檀遺傳多樣性，以采自海南省東、西、南、北、中五個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)185份降香檀單株材料為材料，采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：利用篩選出的25對(duì)SRAP引物組合，擴(kuò)增共檢測(cè)到174個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)92個(gè)，多態(tài)率為52.8%。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，185份海南降香檀種質(zhì)材料與對(duì)照多裂黃檀遺傳相似系數(shù)為0.56;在相似系數(shù)約為0.73處，可將收集到降香檀種質(zhì)劃分為4個(gè)類群。SRAP標(biāo)記可較好地反映海南降香檀種質(zhì)間的遺傳多樣性，為合理保護(hù)和利用海南降香檀種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)與借鑒.并為海南降香檀分類系統(tǒng)和進(jìn)化關(guān)系提供分子系統(tǒng)學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 SRAP;降香檀;遺傳多樣性

降香檀（Dalbergia odorifera T.Chen）為豆科黃檀屬植物，是海南特有瀕危樹種，被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1-2]。其根、莖部干燥心材即為中藥“降香”，具有行氣活血、止痛止血的功效[3]，是珍稀名貴南藥。由于國(guó)產(chǎn)降香檀心材具有耐腐蝕、紋理細(xì)密，且散發(fā)芳香，經(jīng)久不退等特點(diǎn)，是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)5屬8類34種紅木之一[4]。早在17世紀(jì)，海南省野生降香檀資源已被掠奪式砍伐[5]?，F(xiàn)僅存的資源也被原產(chǎn)地附近居民采挖栽種于自家院落.導(dǎo)致原始森林中已很難找到成齡降香檀。由于野生資源的匱乏，心材的高附加值，導(dǎo)致海南、廣東、廣西、云南、福建、四川等地大量開展人工栽培降香黃檀林[6-12]。降香檀因地理分布的特點(diǎn)及特有的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其心材生長(zhǎng)發(fā)育影響十分明顯，分析降香檀遺傳多樣性對(duì)于降香檀種質(zhì)資源的收集、品種選育、合理保護(hù)和利用具有重要的意義。

SRAP（序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）是一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)是通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs （Open reading frames開放閱讀框）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[13]。SRAP技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性高，共顯性高、引物具有通用性、易于測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物、植物、微生物等學(xué)科中都廣泛使用。其中，該技術(shù)在植物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、基因定位、重要性狀標(biāo)記以及比較基因組學(xué)等方面廣泛應(yīng)用[14]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)RAPD技術(shù)分析降香黃檀遺傳多樣性[15]，而有關(guān)降香檀的SRAP分析尚未見報(bào)道。前人研究表明，SRAP技術(shù)在生態(tài)型進(jìn)化史上比AFLP更具有一致性。在育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記，有較高的多態(tài)性標(biāo)記比率，是評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具[16]。SRAP標(biāo)記能夠較好的開展遺傳多樣性分析，通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性作為不同居群的劃分依據(jù)更為可行和客觀，可以避免由于不同發(fā)育階段和季節(jié)性生理生化差異而影響指標(biāo)的準(zhǔn)確性[17]。本研究利用篩選出的25對(duì)SRAP引物組合[18]對(duì)采自海南省東、西、南、北、中5個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)185份降香檀單株材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，為合理保護(hù)和利用海南降香檀種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)與借鑒，并為海南降香檀分類系統(tǒng)和進(jìn)化關(guān)系提供分子系統(tǒng)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以采自海南省東、西、南、北、中五個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)共185份降香檀（Dalbergia odorifera T.Chen）和1份外類群物種多裂黃檀（Dalbergia rimosaRoxb）的嫩葉進(jìn)行遺傳多樣性分析，植物經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所資源室李榕濤老師鑒定無(wú)誤，具體見表1。

1.1.2 引物材料

25對(duì)引物參考楊云等[18]對(duì)降香檀SRAP引物的篩選。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取方法與檢測(cè)

降香檀基因組DNA提取參考楊云等[19]的方法。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中10×Taq Buffer 2μL、25 mmol/L MgCl₂ 1.6μL、4×dNTP Mixture 0.5μL、5 U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL、左右引物濃度各2μL，約20 ng/μL基因組DNA 2μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，35℃退火45 s，72延伸45 s，5個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，50℃退火45 s，72延伸45 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后取下凝膠進(jìn)行銀染，染色程序參考張軍等[20]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以電泳照片記錄譜帶，按照相同遷移位上有多態(tài)性擴(kuò)增帶記為“1”，無(wú)帶為“0”的方法，用Glyko Banscan 4.5軟件輔助記錄電泳譜帶，多態(tài)性和重復(fù)性好的擴(kuò)增帶才被記錄。聚類分析應(yīng)用NTSYSpc 2.1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行，UPGMA方法聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增結(jié)果

利用楊云等[16]篩選出的25對(duì)SRAP引物組合對(duì)185份種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得帶型豐富且清晰可辨的電泳圖譜，共檢測(cè)到174個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)92個(gè)，多態(tài)率為52. 8%，反映了海南降香檀種質(zhì)具有較高的基因多樣性水平。部分引物的電泳結(jié)果見圖～2。

2.2 遺傳多樣性和聚類分析

根據(jù)SRAP標(biāo)記對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到聚類樹狀圖（圖3）。由圖3可知，185份海南降香檀種質(zhì)材料與對(duì)照多裂黃檀（編號(hào)186號(hào)）遺傳距離較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.56。結(jié)果與余敏[21]提出的降香檀與多裂黃檀在黃檀屬中有著較近的親緣關(guān)系，但是二者又不屬于同一植物類群的觀點(diǎn)相同。5個(gè)行政區(qū)域23個(gè)自然居群的185份降香檀樣品，總多態(tài)位點(diǎn)百分率是52.8%，說(shuō)明降香檀種內(nèi)遺傳背景具有較豐富的多樣性;在相似系數(shù)約為0.73處可將供試的185份海南降香檀種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群（即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），這與降香檀自然分布情況一致。

第Ⅰ類群主要為海南南部地區(qū)和北部地區(qū)的部分種質(zhì)，這個(gè)類群又可劃分為2個(gè)亞類群，南、北部地區(qū)的種質(zhì)分別在2個(gè)不同亞類群中。

第Ⅱ類群除了南部地區(qū)的1份種質(zhì)外（編號(hào)112號(hào)），其它8份全部為北部地區(qū)種質(zhì)。

第Ⅲ類群主要包括了海南南部地區(qū)和西部地區(qū)的部分種質(zhì)。

第Ⅳ類群包括了東、西、北和中部地區(qū)的部分種質(zhì)，中部地區(qū)的大部分種質(zhì)均聚在這個(gè)類群中，并且與其它地區(qū)的種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn)。如果將這個(gè)類群再細(xì)劃分，各地區(qū)的種質(zhì)又分別在不同的亞類群中。

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于降香檀遺傳多樣性檢測(cè)方面的報(bào)道不多。楊新全等[22]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)降香黃檀6個(gè)居群77個(gè)樣品的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)位性百分率為54.55%。訾慧等[23]利用RAPD技術(shù)鑒別中藥降香及其易混淆品山油柑，品種間出現(xiàn)了明顯的多態(tài)性差異，每種藥材均得到4～7條帶，易混淆品山油柑與正品降香的帶型不同，有明顯的差異。本研究對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，25對(duì)SRAP引物組合對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得帶型豐富且清晰可辨的電泳圖譜，多態(tài)率為52.8%，說(shuō)明SRAP標(biāo)記技術(shù)在海南降香檀種質(zhì)的遺傳多樣性研究中有較高的檢出率。

海南各地降香檀雖然被聚類為4大類群，但主要以北部地區(qū)和南部及西南部地區(qū)為主，這與海南降香檀野生分布集中在北部石山地區(qū)和南部及西南部地區(qū)相吻合，其余各地區(qū)種質(zhì)基本來(lái)自于這兩個(gè)大地區(qū)。

降香檀種質(zhì)遺傳多樣性較為豐富，但來(lái)源主要為北部、南部及西南部的自然分布區(qū)。第Ⅲ類群中包含了南部和西部2個(gè)區(qū)域，這與降香檀歷史記載的天然分布一致，分布在西南部和南部區(qū)域的種質(zhì)資源來(lái)源基本相同;第IV類群中包含了北、東、西、中4個(gè)區(qū)域，唯獨(dú)沒有南部區(qū)域的種質(zhì)資源，說(shuō)明東、西、中區(qū)域的種源大多來(lái)自北部區(qū)域。北部區(qū)域由于海口的政治經(jīng)濟(jì)文化中心地位以及便利的交通，更利于降香檀種苗的運(yùn)輸和傳播。其中，西部區(qū)域出現(xiàn)了南部和北部種質(zhì)混雜的現(xiàn)象，主要原因是西部樣品來(lái)源于儋州、白沙、昌江、東方等地，其中儋州等位于西北部，其種質(zhì)主要來(lái)源于北部區(qū)域，而另一部分西部區(qū)域采樣點(diǎn)位于西南部，和南部區(qū)域交叉種質(zhì)交流頻繁，所以導(dǎo)致西部區(qū)域種質(zhì)出現(xiàn)南北混雜的現(xiàn)象。

本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)解析了海南地區(qū)降香檀種質(zhì)遺傳多樣性，為我國(guó)降香檀種質(zhì)資源調(diào)查、種質(zhì)鑒別提供理論依據(jù)。但由于研究區(qū)域、采樣數(shù)量的局限性，只能局部的反映降香檀種質(zhì)的遺傳多樣性特點(diǎn)。因此，要全面系統(tǒng)地對(duì)降香檀種質(zhì)遺傳多樣性研究還需要更大的采樣量并結(jié)合多種研究方法，后續(xù)工作也正在開展。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)，中國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2015.

[2]韋直，陳德昭，陳邦余，等，中國(guó)植物志（第40卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1994.

[3]陳煥鏞，海南植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1965.

[4]傅立國(guó).中國(guó)植物紅皮書——稀有瀕危植物（第一冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[5]林勵(lì)，丘金裕，蔡岳文，等，廣東珍貴南藥樹種生產(chǎn)現(xiàn)狀、問題及對(duì)策研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（2）：127-130.

[6]羅文揚(yáng)，羅萍，武麗瓊，等.降香檀及其可持續(xù)發(fā)展對(duì)策探討[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29 （1）：44.

[7]連輝明，張謙，殷祚云，等，廣東降香黃檀人工林生長(zhǎng)及寒害調(diào)查分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào).2014， 34（10）：26-31

[8]郭文福，賈宏炎，降香黃檀在廣西南亞熱帶地區(qū)的引種[J].福建林業(yè)科技，2006，33 （4）：152.

[9]王立新，許麗萍，李倩，等，降香黃檀在普洱市引種試驗(yàn)初報(bào)，林業(yè)調(diào)查規(guī)劃[J].2016，41（5）：81-85.

[10]姚慶端，林清錦，鄭志雷.福建省降香黃檀引種適宜區(qū)研究[J].福建林業(yè)科技，2012，39 （2）：89-84.

[11]魯洋，魏鵬，賈晨，等.降香黃檀在宜賓地區(qū)引種栽培試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)[J].南方農(nóng)業(yè)，2017，11（8）：121-123.

[12]孟慧，謝彩香，楊云，等，降香黃檀產(chǎn)地適宜性分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21 （9）：2 304-2306.

[13] Li G，Quiros C F.Sequence-related amplifiedpolymorphism （SRAP）， a new marker system based ona simple PCR reaction： its application to mappingand gene tagging in Brassica [J]. Theor ApplGenet， 2001， 103： 455-461.

[14]劉中華，林志堅(jiān)，李華偉.等，基于SRAP標(biāo)記的甘薯遺傳多樣性與起源演化分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2018，19 （3）：468-477.

[15]楊新全，馮錦東，楊成民，等，瀕危藥用植物降香黃檀DNA提取及RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化[J].熱帶林業(yè)，2007， 35 （1）：47-49.

[16] Ferriol M， Pico B， Cordava P F.Molecular diversity of a germplasm collection of sqash （Cacurbitamoschata） determined by SRAP and AFLP makers [J].Crop Sci， 2004， 44： 653-664.

[17]鐘軍，王坤，仇萍，等.SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分析魚腥草居群的遺傳多樣性[J].植物生理學(xué)通訊，2010， 46（3）：210-216.

[18]楊云，孟慧，吳翼，等，降香黃檀SRAP分子標(biāo)記的引物篩選[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，29（3）：29-31.

[19]楊云，孟慧，魏建和，等，降香檀基因組DNA的提取方法研究[J].生物技術(shù)通訊，2009，20（3）：383-385.

[20]張軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測(cè)[J].棉花學(xué)報(bào)，2000，12（5）：267-269.

[21]余敏.降香檀與多裂黃檀木材DNA提取及其rDNA-ITS序列分析[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[22]楊新全，馮錦東，魏建和，等.我國(guó)特有瀕危藥用植物降香黃檀遺傳多樣性研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007， 9（2）：73-76.

[23]訾慧，曹愛民，孟憲生，等.RAPD技術(shù)對(duì)重要降香的鑒別研究[J].遼寧中醫(yī)藥雜志，2009，36（1）：103-105.