羅洪英,余水泉
(1.四川省宜賓市第三人民醫(yī)院檢驗科 6444000;2.重慶市涪陵區(qū)中心醫(yī)院檢驗科 408000)
目前細菌的耐藥性隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展及臨床實踐中各種主客觀因素的影響作用,已成為全球關(guān)注的問題之一,同時也是臨床面臨的新挑戰(zhàn)[1-2]。腸桿菌科細菌與人們的日常生活密切相關(guān),其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等均為常見的病原菌,并以多重耐藥菌株引起的感染為顯著特點。碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床治療的最常用藥物之一,但近年來隨著其在臨床使用的不斷增加,以及較多的不合理使用,導(dǎo)致出現(xiàn)了碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株。碳青霉烯類耐藥機制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜通透性障礙、細菌生物膜的形成、整合子的介導(dǎo)等,其中產(chǎn)碳青霉烯酶和外膜通透性障礙是對碳青霉烯類耐藥最主要的特征[3-5]。現(xiàn)探討碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥情況,以及耐碳青霉烯類腸桿菌科產(chǎn)碳青霉烯酶、整合子分布、外膜孔蛋白的缺失情況。
1.1一般資料 收集宜賓市第三人民醫(yī)院2014年2月至2016年8月各個科室患者的痰液、尿液、分泌物、血液等標本,對87株耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌(CRE)菌株進行研究。
1.2方法 菌株鑒定按照原衛(wèi)生部《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版)》標準。采用VITEK-2 Compact全自動細菌分析鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司),藥敏檢測使用抗菌藥物紙片(英國Oxoid公司),藥敏紙片使用紙片擴散法;質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603,依照2007年CLSI制定的標準,使用推薦的折點判斷耐藥性。應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測常見碳青霉烯酶基因并描述分布特征,使用煮沸法制備菌株模板后,運用25 μL反應(yīng)體系,PCR擴增KPC、NDM-1(中國疾病預(yù)防控制中心傳染預(yù)防控制所推薦)基因序列,引物序列(NDM-1:正義鏈5′-CAG CAC ACT TCC TAT CTC-3′,反義鏈5′-CCG CAA CCA TCC CCT CTT -3′;KPC:正義鏈5′-TGR AAG TTA CCG CGC TGA GG-3′,反義鏈5′-CCA GAC GAC GGC ATA GTC AT-3′),反應(yīng)過程:95 ℃預(yù)變性10 min后變性30 s,退火55 ℃和52 ℃均30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán)。產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldviewⅠ型核酸染色劑染色,紫外燈下觀察結(jié)果。對整合子分布特征進行總結(jié)分析,PCR檢測體系同上,引物(整合子1:正義鏈5′-GGT CAA GGA TCT GGA TTT CG-3′,反義鏈5′-ACA TCG GTC TAA ATC ATC GTC-3′;整合子2:正義鏈5′-CAC GGA TAT GCG ACA AAA AGG T-3′,反義鏈5′-GTA GCA AAC GAG TGA CGA AAT G-3′;整合子3:正義鏈5′-AGT GGG TGG CGA ATG AGT G-3′,反義鏈5′-TGT TCT TGT ATC GGC AGG TG-3′);與此同時還通過電泳對外膜孔蛋白的缺失情況進行分析。
1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較應(yīng)用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株產(chǎn)碳青霉烯酶情況 87株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株進行PCR擴增碳青霉烯酶基因,檢出碳青霉烯酶基因74株,占85.06%。包括肺炎克雷伯菌65株,占87.84%,大腸埃希菌檢出6株(8.11%),陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌各檢出1株,分別占1.35%。見表1。PCR圖譜以大腸埃希菌進行分析。見圖1。
表1 耐碳青霉烯類抗菌藥物的CRE菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的分布特征
注:M表示DNA 標記物;P表示陽性;N表示陰性
圖1大腸埃希菌PCR圖譜
2.2耐碳青霉烯類CRE菌株表型耐藥情況 74株分離菌中檢測出攜帶KPC型碳青霉烯酶基因33株,陽性檢出率為44.59%。未檢測到NDM-1基因。
2.3對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株整合子情況 Ⅰ類整合子共檢出52株,檢出率為59.77%(52/87),其中47株來自產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,5株為非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,同時均以肺炎克雷伯菌檢出的比例最高(分別為39株和3株);Ⅱ類整合子檢出共8株,檢出率為9.20%(8/87),其中4株來自產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株,4株為非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株;未檢出Ⅲ類整合子。Ⅰ類和Ⅱ類整合子檢出3株,2株來自產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株,1株為非產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。見表2。
表2 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE菌株整合子的分布特征(n)
2.4對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌外膜孔蛋白缺失情況 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥比例較高的肺炎克雷伯菌,菌株外膜孔蛋白缺失結(jié)果顯示,共70株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株中,膜蛋白無異常達18.57%,其中產(chǎn)碳青霉烯酶菌株中膜蛋白無異常為16.92%;OmpK35表達下調(diào)菌株占24.29%,OmpK35缺失占10.00%;OmpK36表達下調(diào)和缺失的比例分別為4.23%和57.14%;產(chǎn)碳青霉烯酶菌株中OmpK35表達下調(diào)的菌株占50.77%,OmpK35缺失占9.23%;OmpK36表達下調(diào)和缺失的比例分別為3.08%和55.38%。見表3和圖2。
表3 對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株外膜孔蛋白缺失情況[n(%)]
注:M表示標準蛋白質(zhì)分子
圖2孔膜蛋白電泳圖
近年來,抗菌藥物廣泛應(yīng)用于臨床抗感染,細菌在抗菌藥物的選擇壓力下,耐藥性也逐漸表現(xiàn)出來[6-8]。亞胺培南或美洛培南抗菌藥物是目前臨床特異性強、效果良好的藥物,但目前耐碳青霉烯類桿菌的分離率也逐年升高,主要耐藥菌株常見一些革蘭陰性桿菌,同時也是引起臨床感染最常見的細菌類型,包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌屬等,以及非發(fā)酵革蘭陰性桿菌(銅綠假單胞菌、不動桿菌屬等)。細菌的耐藥性之所以能在抗菌藥物出現(xiàn)之后迅速產(chǎn)生,并且擴散,主要原因之一與基因水平轉(zhuǎn)移密切相關(guān),細菌的耐藥基因多位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等區(qū)域,現(xiàn)研究臨床桿菌的相關(guān)機制,對指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物意義重大[9-11]。
本研究對87株耐碳青霉烯類抗菌藥物的CRE菌株進行PCR擴增碳青霉烯酶基因,檢出碳青霉烯酶基因74株(85.06%),其中包括肺炎克雷伯菌65株,占87.84%,大腸埃希菌檢出6株(8.11%),陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌各1株,分別占1.35%。該耐藥機制的研究近年來早已成為微生物領(lǐng)域的又一個關(guān)注焦點[8,12],其相關(guān)機制除了與上述碳青霉烯酶基因的表達有關(guān)外,還與整合酶基因相關(guān)。本研究整合酶基因檢測結(jié)果表明,Ⅰ類整合子共檢出52株,檢出率59.77%(52/87),其中47株來自產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,5株為非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,同時均以肺炎克雷伯菌檢出的比例最高(分別為39株和3株);Ⅱ類整合子檢出8株,檢出率9.20%(8/87),其中4株來自產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,4株為非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株;未檢出Ⅲ類整合子。Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出3株,2株來自產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株,1株為非產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。
近年來的研究提示,產(chǎn)生ESBL和AMPC酶的同時合并外膜孔蛋白缺失現(xiàn)象的菌株也可導(dǎo)致耐藥作用。外膜孔蛋白表達減低或者缺失對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥作用起著重要的作用,特別是OmpK35、OmpK36、OmpK37,使用抗菌藥物治療的同時,不少菌株會產(chǎn)生下調(diào)這些孔蛋白表達的作用,或者誘導(dǎo)其缺失[13-15]。本研究結(jié)果顯示,70株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌株中,膜蛋白無異常達18.57%,其中產(chǎn)碳青霉烯酶菌株中膜蛋白無異常為16.92%;OmpK35表達下調(diào)菌株占24.29%,OmpK35缺失占10.00%;OmpK36表達下調(diào)和缺失的比例分別為4.23%和57.14%;產(chǎn)碳青霉烯酶菌株中OmpK35表達下調(diào)的菌株占50.77%,OmpK35缺失占9.23%;OmpK36表達下調(diào)和缺失的比例分別為3.08%和55.38%。碳青酶烯酶是能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶,其包括Ambler分子分類為A、B、C、D的4類酶,其中C類酶,即頭孢菌素酶僅水解頭孢菌素而不水解碳青霉烯;肺炎克雷伯菌碳青酶烯酶是目前引起CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因,其基因位于可移動的質(zhì)粒上,幾乎可以水解除頭孢菌素類以外的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,包括碳青霉烯類。而與此同時,產(chǎn)碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌可通過質(zhì)粒、整合子、插入序列的基因元件進行水平傳播使其他細菌獲得耐藥性。耐碳青霉烯類腸桿菌與產(chǎn)碳青霉烯酶、整合子、外膜孔蛋白均存在相互關(guān)聯(lián),且這些機制本身又存在不同程度的協(xié)同等作用,本研究結(jié)果也說明了其間的復(fù)雜相關(guān)性。
綜上所述,對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的CRE耐藥情況嚴峻,且肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因檢出率最高,耐藥最嚴重;耐藥性的發(fā)生還與整合酶基因Ⅰ類整合子,以及孔膜蛋白表達減低與缺失密切相關(guān)。本研究擬為新型抗菌藥物的研發(fā)提供一些理論支持,為預(yù)防抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生提供依據(jù)。
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