菜籽粕蛋白提取及其氨基酸分析

周天駒，丁之恩

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

在我國，油菜籽作為油料作物具有重要地位，年產(chǎn)量在1×106萬噸以上[1]，油菜籽榨油后的副產(chǎn)品為菜籽粕，其含有35%～45%的蛋白質(zhì)[2]，而菜籽粕只是少量加入飼料作為使用，造成了這一資源嚴(yán)重浪費(fèi)，因此菜籽粕是一種潛在的植物蛋白來源，研究開發(fā)價值很高。

菜籽蛋白中谷氨酸豐富，并且必需氨基酸組成比較平衡[3]，幾乎不存在限制性氨基酸，其營養(yǎng)符合世界衛(wèi)生組織（WHO）與聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）的推薦模式[4]。植物蛋白的主要提取主要有沉淀法、膜分離和離子交換等方法[5-6]。本文以菜籽粕為原料依次采用堿法提取和酸法提取分步提取蛋白質(zhì)，并采用正交組合試驗，優(yōu)化提取菜籽粕蛋白質(zhì)的工藝，以期獲得較好的蛋白質(zhì)提取率和較高的蛋白質(zhì)純度，同時對所得菜籽粕蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸組成分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕：安徽省合肥市肥西縣小苗鎮(zhèn)雷麻加工廠。

五水合硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；S200-k梅特勒-托利多多參數(shù)測試儀、梅特勒-托利多ML204/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EYELA冷凍干燥機(jī)：上海愛郎儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；海能K9840自動凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司；日本Hitachi L-8900全自動氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 主要成分分析及蛋白含量的測定

灰分：GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》；粗纖維：GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》；還原糖：GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》；總糖：GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》；總蛋白：GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

提取蛋白：雙縮脲法。具體步驟如下：以牛血清蛋白為對照，建立回歸方程，得出回歸方程為A=3.873 0C+0.033 6（R2=0.997 2），式中：C 為吸光度，A為蛋白質(zhì)的濃度（g/L）。

菜籽粕中蛋白質(zhì)的提取率/%=（提取液中蛋白質(zhì)含量/菜籽粕總蛋白質(zhì)含量）×100

1.3.2 菜籽粕蛋白質(zhì)最佳析出pH值的測定

取適量的菜籽粕與水按1∶15（g/mL）混合，用1 mol/L NaoH調(diào) pH至 12，50℃水浴振蕩 1 h，在5 000 r/min離心5 min，取等量上清液，調(diào)至不同pH值沉淀蛋白質(zhì)，離心后，用雙縮脲法測定沉淀后上清液中蛋白質(zhì)的殘留含量，上清液中蛋白質(zhì)殘留最低的pH值為菜籽粕蛋白質(zhì)的最佳沉淀pH值[7]。

上清液蛋白質(zhì)殘留率/%=（不同pH沉淀后上清液中蛋白質(zhì)含量/菜籽粕總蛋白質(zhì)含量）×100

1.3.3 菜籽粕蛋白質(zhì)分步提取工藝

1.3.3.1 第一步堿法提取菜籽粕蛋白質(zhì)

稱取樣品1g→加水調(diào)料液比、調(diào)pH值（NaOH）→水浴（控制溫度和時間）→離心5 min（5 000 r/min）→上清液雙縮脲測蛋白質(zhì)→沉淀烘箱烘干

1.3.3.2 第二步酸法提取菜籽粕蛋白質(zhì)

稱取烘干后菜籽粕樣品1 g→加水調(diào)料液比、調(diào)pH（NaOH）→水?。刂茰囟群蜁r間）→離心5 min（5 000 r/min）→上清液雙縮脲測蛋白質(zhì)

1.3.4 菜籽粕蛋白質(zhì)提取最適條件的確定

考察pH值、時間、料液比、溫度對提取菜籽粕蛋白率的影響。把溫度45℃，時間3 h，料液比1∶30（g/mL），設(shè)為初始條件，堿法在 9.0、10.0、11.0、12.0、13.0改變pH值，考察pH值對提取菜籽粕蛋白質(zhì)的影響；確定適宜的pH值后，在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）范圍內(nèi)，考察底物濃度的影響；確定適宜的pH值和料液比后，不改變其他因素的情況下，在提取時間 1、2、3、4、5 h，考察時間的影響；以上3因素確定后，在提取溫度在35、40、45、50、55℃之間，確定適宜的溫度。第二步酸法在0.5～2.5改變pH值，其余條件與堿法相同。1.3.5 菜籽粕蛋白質(zhì)提取的正交試驗

根據(jù)堿法、酸法單因素的試驗結(jié)果，分別選取L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化菜籽粕提取蛋白質(zhì)的正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽粕原料的主要成分分析

菜籽粕原料的主要成分結(jié)果見表1。

表1 菜籽粕主要成分Table 1 The main components of rapeseed dregs

由表1可知，菜籽粕中的粗蛋白和總糖含量比較高，具有很好的潛在利用價值。

2.2 菜籽粕蛋白等電點(diǎn)分析

菜籽粕蛋白的等電點(diǎn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可看出，菜籽粕蛋白在不同pH值的條件下，上清液中的蛋白含量隨著pH值的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在pH=5時最低，暗示了菜籽粕蛋白在pH為5時析出的最多，即為菜籽粕蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

2.3 菜籽粕蛋白堿法提取的單因素試驗

2.3.1 堿法pH值對蛋白提取率的影響

堿法pH值對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖1 菜籽粕蛋白的等電點(diǎn)分析Fig.1 The isoelectric point analysis of rapeseed dreg protein

圖2 堿法pH值對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of pH on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由圖2可知，隨著pH值的上升，蛋白質(zhì)的提取率也隨之上升，當(dāng)pH值為12時，提取率為50.41%；pH值為13時最大為54.81%，但當(dāng)pH超過13時可能會引起蛋白理化性質(zhì)的改變，降低其營養(yǎng)價值[8]，因此初步確定最佳pH值為12。

2.3.2 堿法料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

堿法料液比對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 堿法料液比對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由圖3可知，料液比對蛋白質(zhì)提取率的先升高后趨于平緩，料液比過高，蛋白質(zhì)的提取率并沒有顯著增加，反而增加了后續(xù)的處理負(fù)擔(dān)，初步確定料液比為 1 ∶15（g/mL）。

2.3.3 堿法提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

堿法提取時間對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 堿法提取時間對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由圖4可知，當(dāng)提取率時間為2 h時，蛋白質(zhì)提取率基本達(dá)到最高為45.69%，再增加提取時間，蛋白質(zhì)提取率并沒有明顯提高。為了縮短生產(chǎn)周期，初步確定提取時間2 h。

2.3.4 堿法提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

堿法提取溫度對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖5所示。

法國心理學(xué)家勒龐認(rèn)為，人一到群體中就變得低智商、非理性、易盲從，于是他把人群稱為“烏合之眾”，著有著名的暢銷書《烏合之眾：大眾心理研究》，這本書在國內(nèi)也備受推崇。勒龐的看法只是一家之言，未見得便是真理，譬如與他同時代的另一位法國心理學(xué)家塔爾德便提出了幾乎相反的觀點(diǎn)。但個體受群體影響，卻是沒有疑義的。

圖5 堿法提取溫度對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由圖5可知，隨著溫度的升高，提取率緩慢增加。當(dāng)提取溫度為45℃時，蛋白質(zhì)提取最高為52.25%，初步確定提取溫度為45℃。

2.3.5 堿法正交試驗

以 pH 值（A）、料液比（B）、溫度（C）、時間（D）4個單因素設(shè)計正交試驗，因素水平表、試驗設(shè)計及結(jié)果見表2和表3，方差分析見表4。

由表3中R值可知，4個影響菜籽粕蛋白提取率因素的順序是A＞B＞D＞C，即pH值＞料液比＞時間＞溫度。在表3中，當(dāng)pH值13，料液比1∶20（g/mL），溫度45℃和時間1 h時，菜籽粕蛋白的提取率最高，為67.93%。而從k值分析得知，堿法提取菜籽粕蛋白的最佳組合為A3B2C2D1，即pH值13，料液比1∶15（g/mL），溫度 45 ℃和時間 1 h，此時的提取率為67.86%，與表3中的最高提取率無顯著性差異。因此，出于節(jié)約原料和成本的考慮[8]，堿法提取菜籽粕蛋白的最佳條件：pH 13，料液比 1 ∶15（g/mL），溫度45℃和時間1 h，此時的菜籽粕蛋白的提取率為67.86%。并按最佳工藝進(jìn)行驗證試驗，測得的菜籽粕蛋白提取率為67.90%，與之前的結(jié)果一致，說明該工藝具有重復(fù)性。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table

表3 堿法正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The orthogonal experimental design and results of alkali method

表4 堿法方差分析Table 4 The variance analysis of alkali method

由表4的方差分析可知，pH值對堿法蛋白質(zhì)提取有顯著性影響，而料液比、時間和溫度對其提取率影響不顯著。

2.4 菜籽粕蛋白酸法提取的單因素試驗

2.4.1 酸法pH值對蛋白提取率的影響

酸法pH值對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖6所示。

圖6 酸法pH值對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.6 The effect of pH on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由圖6可知，當(dāng)pH值為1時，提取率為33.16%；pH值為0.5時，提取率為最大35.07%，初步確定最佳pH值為0.5。

2.4.2 酸法料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

酸法料液比對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖7所示。

圖7 酸法料液比對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.7 The effect of solid-liquid ratio on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

2.4.3 酸法提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

酸法提取時間對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖8所示。

圖8 酸法提取時間對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.8 The effect of extraction time on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由圖8可知，當(dāng)提取率時間為2 h時，蛋白質(zhì)提取率基本達(dá)到最高為32.13%，再增加提取時間，蛋白質(zhì)提取率并沒有明顯提高，因此初步確定提取時間2 h。

2.4.4 酸法提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

酸法提取溫度對菜籽粕蛋白提取率的影響如圖9所示。

圖9 酸法提取溫度對菜籽粕蛋白提取率的影響Fig.9 The effect of extraction temperature on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由圖9可知，蛋白質(zhì)的提取率先升后降。當(dāng)提取溫度為45℃時，蛋白質(zhì)提取最高為35.67%，初步確定提取溫度為45℃。

2.4.5 酸法正交試驗

以 pH（E）、料液比（F）、溫度（G）、時間（H）4個單因素設(shè)計正交試驗，因素水平表和試驗設(shè)計及結(jié)果見表5和表6，方差分析見表7。

表5 因素水平表Table 5 Factors and levels table

表6 酸法正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 The orthogonal experimental design and results of acid method

表7 酸法方差分析Table 7 The variance analysis of acid method

由表6中R值可知，4個影響菜籽粕蛋白提取率因素的順序是F＞E＞G＞H，即料液比＞pH值＞溫度＞時間。在表 6中，當(dāng) pH 值 0.5，料液比 1∶15（g/mL），溫度45℃和時間2 h時，菜籽粕蛋白的提取率最高，為36.10%。

而從k值分析得知，酸法提取菜籽粕蛋白的最佳組合為 E1F2G3H2，即 pH0.5，料液比 1 ∶15（g/mL），溫度50℃和時間2 h，此時的提取率為35.32%，低于表3中的最高提取率。因此，酸法提取菜籽粕蛋白的最佳條件：pH 0.5，料液比 1 ∶15（g/mL），溫度 45 ℃和時間2 h，菜籽粕蛋白的提取率為36.10%。并按最佳工藝進(jìn)行驗證試驗，測得的菜籽粕蛋白提取率為36.25%，略高于表6中的最高提取率。

由表7的方差分析可知，料液比對酸法蛋白質(zhì)提取有顯著性影響，而pH值、時間和溫度對其提取率影響不顯著。

2.5 菜籽粕蛋白的氨基酸分析

2.5.1 菜籽粕蛋白質(zhì)的氨基酸分析

菜籽粕蛋白的氨基酸組成與含量如表8所示。

表8 菜籽粕蛋白的氨基酸組成與含量Table 8 Amino acid composition and content of the rapeseed dreg protein g/100 g

從表8可以看出，菜籽粕蛋白質(zhì)的氨基酸含有7種必需氨基酸，占總氨基酸的29.41%。全部氨基酸中谷氨酸的含量最高為25.96%，其中精氨酸的含量明顯高于FAO/WHO/UNU 1985年的推薦值[9]，亮氨酸與蘇氨酸也推薦值相近。

2.5.2 菜籽粕蛋白質(zhì)必需氨基酸組成

菜籽粕蛋白的必需氨基酸組成如表9所示。

表9 菜籽粕蛋白質(zhì)必需氨基酸組成Table 9 Essential amino acid composition of the rapeseed dreg protein%

由表9可以看出，菜籽粕蛋白必需氨基酸組成。菜籽粕粗蛋白的必需氨基酸占氨基酸總量的35.6%，高于淮山藥[10]，與FAO/WHO模式標(biāo)準(zhǔn)蛋白[11]相當(dāng)。

3 討論

以堿法和酸法分步提取菜籽粕蛋白，通過正交試驗優(yōu)化了菜籽粕蛋白提取的工藝流程。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在堿法提取的菜籽粕蛋白的提取率可達(dá)67.86%，堿法提取菜籽粕蛋白更加適合工業(yè)生產(chǎn)。同時通過對提取的菜籽粕蛋白氨基酸分析可知，菜籽粕的氨基酸組成豐富，與FAO/WHO模式標(biāo)準(zhǔn)蛋白相當(dāng)。

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