許雅麗+陳興和+李篤妙

[摘要] 目的 檢測(cè)散發(fā)性單純性尿道下裂患者包皮組織中激活轉(zhuǎn)錄因子3（ Activating transcription factor 3， ATF3）的表達(dá)情況，探索ATF3與散發(fā)性單純性尿道下裂之間的關(guān)系。方法 方便選擇2014年1月—2017年1月該院收治的散發(fā)性單純性尿道下裂患者在尿道成形術(shù)中切除的包皮組織（共35例，其中輕度10例，中度15例，重度10例）作為尿道下裂組樣品，單純包皮過(guò)長(zhǎng)（含包莖）患者在包皮環(huán)切術(shù)中去除的多余的包皮組織（共20例）作為對(duì)照組樣品。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ATF3 mRNA 的表達(dá)情況。采用 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果 通過(guò)RT-PCR方法測(cè)得散發(fā)性單純性尿道下裂患者包皮組織中 ATF3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為：（0.54±0.06），對(duì)照組的包皮組織中ATF3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為：（0.44±0.07），從結(jié)果中可以得出在散發(fā)性單純性尿道下裂患者的包皮組織中ATF3的表達(dá)情況比正常的尿道組織中明顯增加，兩組結(jié)果比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.89，P=0.00）。比較不同嚴(yán)重程度中尿道下裂患者ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，不同嚴(yán)重程度相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.13，P=0.88）。結(jié)論 散發(fā)性單純性尿道下裂患者中ATF3的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，這提示ATF3與散發(fā)性單純性尿道下裂存在著密切的關(guān)系。為將來(lái)研究ATF3在尿道下裂中產(chǎn)生的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，及研究尿道下裂的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 尿道下裂；ATF3；包皮組織

[中圖分類號(hào)] R726 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）12（b）-0005-05

[Abstract] Objective To test the expression of ATF3 in the prepuce tissue of patients with sporadic isolated hypospadias and explore the correlation between the ATF3 and sporadic isolated hypospadias. Methods The prepuce tissues of 35 cases of patients with sporadic isolated hypospadias removed in urethroplasty admitted and treated in our hospital from January 2014 to January 2017 were convenient selected （10 mild， 15 moderate， 10 severe），were selected as the hypospadias group， while the redundant prepuce tissues of 20 cases of patients with simple redundant prepuce （including phimosis） in the circumcision were selected as the control group， and the expression of ATF3mRNA of the two groups was tested by the RT-PCR method， and the data were recorded by the SPSS 12.0 statistical software， and the database was constructed. Results The relative expression of ATF3 mRNA in the prepuce tissue of patients with sporadic isolated hypospadias by the RT-PCR method was （0.54±0.06）， and the relative expression of ATF3 mRNA in the control group was （0.44±0.07）， and the results showed that the expression of ATF3 in the prepuce tissues obviously increased compared with that of the normal urethra tissues， and the difference was statistically significant， （t=5.89， P=0.00）， and the difference in the relative expression of ATF3mRNA of different severity was not obvious （F=0.13， P=0.88）. Conclusion The expression level of ATF3 of patients with sporadic isolated hypospadias was obviously higher than that in the normal control group， which reminds that ATF3 has a close correlation with the sporadic isolated hypospadias， and it can provide related experimental basis for the study of the signal transduction pathway produced by ATF3 in the hypospadias and provide theoretical basis for the study of the pathogenesis of hypospadias.endprint

[Key words] Hypospadias； ATF3； Prepuce tissue

尿道下裂是兒科臨床中最常見的泌尿生殖系統(tǒng)先天性畸形疾病。最近的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，其發(fā)生率在許多國(guó)家和地區(qū)現(xiàn)已持續(xù)上升[1]。臨床上根據(jù)尿道口開口的位置不同，常將尿道下裂分為：遠(yuǎn)端型（輕度，包括龜頭型、冠狀溝型）、中段型（中度，包括陰莖體遠(yuǎn)端型、陰莖體型、陰莖體近端型）、近端型（重度，包括陰莖陰囊交界型、陰囊型、會(huì)陰型）[2]。男性尿道的發(fā)育是一個(gè)涉及多基因編碼、細(xì)胞分化、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性以及組織更新等一系列非常復(fù)雜的過(guò)程[3]。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄激活因子家族的ATF3（Activating transcription factor 3，激活轉(zhuǎn)錄因子 3）成為先天性尿道下裂發(fā)病機(jī)制研究的焦點(diǎn)，被認(rèn)為是先天性尿道下裂病因中的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控基因[4]。該實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)在RNA水平探討了2014年1月—2017年1月期間該院收治的35例散發(fā)性單純性尿道下裂患者包皮組織中ATF3表達(dá)水平與散發(fā)性單純性尿道下裂之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為方便選取在該院住院的散發(fā)性單純性尿道下裂患者共35例（輕度尿道下裂10例，中度尿道下裂15例，重度尿道下裂10例），平均年齡5.3（3～12）歲，且經(jīng)診斷未合并其他疾病。對(duì)照組為20例單純包皮過(guò)長(zhǎng)（含包莖）患者在包皮環(huán)切術(shù)中去除的多余的包皮組織，平均年齡6（3～14）歲。兩組患者一般資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)和匹配

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①尿道下裂組：臨床確診為單純性尿道下裂疾?。荒虻老铝焉l(fā)性患者，不呈現(xiàn)出地區(qū)聚集性；不伴有其他的泌尿生殖系統(tǒng)疾?。徊』技覍俸炇稹吨橥鈺?，自愿參與該項(xiàng)課題研究。②對(duì)照組：對(duì)照組共20例，單純包皮過(guò)長(zhǎng)的患者不伴有其它畸形或疾病，患者家屬簽署《知情同意書》，自愿參與該項(xiàng)課題研究。

1.2.2 匹配 尿道下裂組和對(duì)照組基本情況的匹配，根據(jù)尿道下裂組患者一般人口學(xué)情況，對(duì)照組患者進(jìn)行了年齡的適當(dāng)匹配，兩組人群構(gòu)成總體一致。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

TRIzol試劑、盒裝tip頭（上海生工，中國(guó)）、氯仿、異丙醇、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（杭州主諾生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、全部PCR引物（上海生工，中國(guó)）、兔抗人激活轉(zhuǎn)錄因子 ATF3抗體 P3 571Rb-h（上海羲森生物科技有限公司）、SP-9 000免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑（上?？婆d貿(mào)易有限公司）PE2 400型PCR擴(kuò)增儀（河南新鄉(xiāng)優(yōu)科儀器商行）JY-ECP3 000型高壓電泳儀（北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司）Gel Doc-It 310 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)（賽百奧科技）Gel Doc2000 凝膠掃描儀（BIO-RAD，美國(guó)）

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 獲取組織和冷藏 將手術(shù)中切除的包皮組織，用液氮冷凍，并保存在液氮罐中備用。

1.4.2 Trizol 法提取包皮組織中總RNA 采用TRIzol法提取組織中的總RNA。經(jīng)過(guò)組織勻漿化作用、分離階段、RNA沉淀、RNA洗脫和再溶解，最后對(duì)所提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄（RT）和PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分析 逆轉(zhuǎn)錄主要采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。配置好的瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，電泳1.5 h后紫外燈檢測(cè)，凝膠密度掃描找尋核酸染液染色的特異性條帶。具體方法如下。

①設(shè)計(jì)ATF3和GAPDH（內(nèi)參基因）的PCR引物。

GADPH基因引物（280 bp）：

上游5`CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT`3

下游5`GTTCAGCTCAGGGATGACCTTG`3，

ATF3 基因引物（218 bp）：

上游5`TCGGGGTGTCCATCA-CAAAAGC`3

下游5`CTTCTCGTTCTTGAGCTCCTCAATC`3，

②采用常規(guī)Trizol法提取組織總RNA，于-80℃保存待用。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA ，并用theomo酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 公司）操作步驟合成 cDNA。

③PCR具體包括如下5個(gè)步驟。

第1步，各RNA 模板均設(shè)置無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照組，同時(shí)，各 PCR 體系均設(shè)置陰性對(duì)照組，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。第2步，反應(yīng)體系與條件： 總反應(yīng)體系為 20 μL， 30個(gè)循環(huán)：（95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），4℃終止反應(yīng)。第3步，PCR反應(yīng)管同時(shí)加入 ATF3 和GAPDH 的上下游引物，擴(kuò)增 ATF3 和 GAPDH 基因片斷。第4步，2% 瓊脂糖凝膠，85 V，電泳1.5 h，觀察電泳條帶。第5步，拍照，并計(jì)算 ATF3 mRNA 的相對(duì)含量= OD值（ATF3）/OD 值（GAPDH）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采集的數(shù)據(jù)均進(jìn)行了嚴(yán)格檢查，重復(fù)測(cè)量將偏出均值3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)進(jìn)行刪除。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。計(jì)量資料使用（x±s）表示，采用F/t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象一般人口學(xué)情況

收錄調(diào)查對(duì)象共55例，于2014年1月—2017年1月期該院該院住院手術(shù)的尿道下裂患者和包皮過(guò)長(zhǎng)（包括包莖）的患者。對(duì)尿道下裂組與對(duì)照組患者的年齡進(jìn)行嚴(yán)格的匹配，所有患者年齡控制在14歲以內(nèi)。尿道下裂組共35例，≤6歲23例（占65.7%），7～10歲10例（占28.6%），14歲以下2例（占5.7%）。正常包皮組≤6歲13人（占65.0%），7～10歲5人（占25.0%），14歲以下2人（占10.0%）。見表1。endprint

2.2 ATF3 mRNA測(cè)定結(jié)果

2.2.1 兩組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 檢測(cè)尿道下裂組35例和正常包皮組20人的包皮組織中 ATF3mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其中尿道下裂組 ATF3 m RNA測(cè)定結(jié)果0.39～0.64之間，平均（0.54±0.06）；正常包皮組ATF3 mRNA測(cè)定結(jié)果0.33～0.55之間，平均（0.44±0.07）。尿道下裂組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常包皮組（t=5.89，P=0.00）。具體見表2、圖1。

2.2.2 不同嚴(yán)重程度尿道下裂患者ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ATF3 mRNA 的相對(duì)含量如下：輕度患者（0.53±0.06）、中度患者（0.54±0.06）、重度患者（0.54±0.43），不同嚴(yán)重程度相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.13，P=0.88），見表3。

2.2.3 尿道下裂患者的尿道組織和正常組織包皮RNA電泳圖譜結(jié)果 對(duì)尿道下裂組和正常包皮組患者樣本組織進(jìn)行擴(kuò)電泳。左側(cè)為100 bp的DNA Marker電泳圖譜，第2道為陰性對(duì)照，第3和第4道為正常對(duì)照組，第5和第6道為尿道下裂組，見圖2。

2.2.4 不同嚴(yán)重程度尿道下裂患者包皮組織RNA電泳圖譜結(jié)果 再對(duì)不同嚴(yán)重程度尿道下裂患者組織標(biāo)本中內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增電泳。左側(cè)為100 bp的DNA Marker電泳圖譜，第2道為陰性對(duì)照，第3道為正常對(duì)照組，第4～6道分別為重度尿道下裂患者、中度尿道下裂患者、輕度尿道下裂患者，見圖3。

3 討論

先天性尿道下裂的發(fā)生主要是由于胚胎早期受到各種因素的影響和作用，使尿道的海綿體融合過(guò)程發(fā)生了中斷，管化過(guò)程發(fā)生了異常，前尿道發(fā)育不全從而導(dǎo)致了尿道的開口不能達(dá)到正常龜頭最頂端的位置，出現(xiàn)尿道開口的異常，使其開口在陰莖腹側(cè)、龜頭至陰囊、會(huì)陰部的途徑上。同時(shí)由于融合中斷、管化異常的尿道海綿體發(fā)生了攣縮，形成陰莖腹側(cè)纖維索帶，牽拉而引起了陰莖變形彎曲，導(dǎo)致陰莖下彎曲。所以，尿道下裂的根本病變就是尿道組織表現(xiàn)（尿道海綿體和尿道板）的異常[5]。

ATF3是含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的活化轉(zhuǎn)錄因子，屬于ATF/cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ATF/CREB），為轉(zhuǎn)錄因ATF/CERB家族成員之一[6]。在大部分正常靜息細(xì)胞中ATF3呈穩(wěn)態(tài)表達(dá)，mRNA的基礎(chǔ)水平非常低。既往研究表明：當(dāng)細(xì)胞受到體內(nèi)外損傷性壓力信號(hào)刺激時(shí)，ATF3的mRNA水平顯著的上升[7]。ATF3參與維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、損傷修復(fù)、細(xì)胞黏附及凋亡。在許多研究中證明ATF3的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在動(dòng)物模型試驗(yàn)中，ATF3在老鼠中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)和收縮功能障礙[8]，在老鼠肝臟中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝臟功能障礙[9]等等。在動(dòng)物模型中，很多病理性損傷可誘導(dǎo)組織細(xì)胞表達(dá)ATF3；在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，生長(zhǎng)刺激因子、細(xì)胞因子、遺傳毒性因子、病毒蛋白和信號(hào)分子等可誘導(dǎo)ATF3表達(dá)[10]。誘導(dǎo)信號(hào)不僅增加ATF3轉(zhuǎn)錄，還可以增強(qiáng)mRNA的水平與穩(wěn)定性[11]。大量研究表明，ATF3可以根據(jù)靶基因和細(xì)胞環(huán)境的不同，激活或抑制相關(guān)基因表達(dá)，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，許多學(xué)者們認(rèn)為ATF3基因是先天性尿道下裂病因中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因。在對(duì)330例尿道下裂的兒童患者及380例對(duì)照兒童外周血進(jìn)行 SNPs序列測(cè)序的相關(guān)性分析與研究中，Beleza-Meireles 等[12]發(fā)現(xiàn) ATF3 基因發(fā)生變異是尿道下裂的危險(xiǎn)因素之一，ATF3基因變異可導(dǎo)致細(xì)胞的生存、死亡、應(yīng)激等，在上皮及間質(zhì)細(xì)胞之間引起的反應(yīng)與尿道下裂的發(fā)生和發(fā)展存在著密切的關(guān)系。王勇等[13]在研究ATF3在糖皮質(zhì)激素與鄰苯二甲酸二丁酯聯(lián)合作用致大鼠尿道下裂發(fā)生中的表達(dá)變化中發(fā)現(xiàn)，地塞米松聯(lián)合鄰苯二甲酸二丁酯進(jìn)一步增強(qiáng)了鄰苯二甲酸二丁酯的致畸作用，ATF3在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組生殖結(jié)節(jié)中的表達(dá)有了明顯的變化，且隨著尿道下裂程度的加重而表達(dá)增高，ATF3的過(guò)表達(dá)影響了生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育及尿生殖褶的融合，認(rèn)為這可能是尿道下裂發(fā)生的機(jī)制之一。

為了進(jìn)一步研究ATF3與散發(fā)的單純性尿道下裂之間的關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR的方法對(duì)35例散發(fā)性單純性尿道下裂術(shù)中多余的包皮組織和正常包皮組織進(jìn)行處理與測(cè)定，在RNA水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在的差異，從而推論ATF3 和散發(fā)性單純性尿道下裂之間的關(guān)系。通過(guò)采用RT-PCR技術(shù)，再經(jīng)凝膠電泳后進(jìn)行圖像分析，最終測(cè)得尿道下裂組 ATF3 mRNA的結(jié)果在0.39～0.64之間，平均（0.54±0.06）；而正常包皮組ATF3 mRNA的結(jié)果在0.33～0.55之間，平均（0.44±0.07）。尿道下裂的尿道組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常包皮組（t=5.89，P=0.00）。值得注意的是，在不同嚴(yán)重程度（輕度、中度和重度）尿道下裂患者中ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.13，P=0.88）。這與李遠(yuǎn)偉等[14]的研究結(jié)果相一致，該研究組測(cè)得尿道下裂患者ATF3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為（0.5375±0.0591）， 對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為（0.4193± 0.0678）， 兩組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也發(fā)現(xiàn)在正常人包皮組織中ATF3表達(dá)量很少，散發(fā)的單純性尿道下裂患者包皮組織中ATF3的表達(dá)明顯增多。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)：轉(zhuǎn)錄因子 ATF3與散發(fā)性單純性尿道下裂存在著密切的關(guān)系， ATF3有可能通過(guò)調(diào)節(jié)ATF3 相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或者調(diào)控尿道下裂相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致患兒尿道下裂的發(fā)生、發(fā)展。因此，仍需要進(jìn)一步研究ATF3的相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以發(fā)現(xiàn)尿道下裂的發(fā)病機(jī)制，以期將來(lái)可在發(fā)病機(jī)制的層面進(jìn)行干預(yù)，減少尿道下裂的發(fā)病率。

4 結(jié)論

散發(fā)性單純性尿道下裂患者中ATF3的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，這提示ATF3與散發(fā)性單純性尿道下裂存在著密切的關(guān)系。為將來(lái)研究ATF3在尿道下裂中產(chǎn)生的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，及研究尿道下裂的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。endprint

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（收稿日期：2017-09-12）endprint