王慧媛+張紫荊+袁封艷

[摘要] 目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）對人主動脈平滑肌細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）啟動子甲基化水平及表達(dá)的影響。 方法 培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞，將其分為兩組：對照組和實(shí)驗組。對照組不加Hcy，實(shí)驗組加入不同濃度Hcy（50、100、200、500 μmol/L）培養(yǎng)48 h。閃爍計數(shù)法檢測膽固醇流出率；實(shí)時定量PCR檢測ABCA1 mRNA表達(dá)水平；Western-blotting檢測ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)；巢式甲基化PCR檢測ABCA1啟動子甲基化水平。 結(jié)果 對照組各時間點(diǎn)膽固醇流出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；各Hcy濃度組不同時間比較顯示，24、48 h膽固醇流出率均明顯低于0、12 h，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與對照組比較，0、12 h各Hcy濃度組膽固醇流出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），24、48 h各Hcy濃度組膽固醇流出率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與對照組比較，實(shí)驗組ABCA1 mRNA相對表達(dá)水平下降（均P < 0.05），ABCA1蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平下降（P < 0.05），ABCA1啟動子甲基化水平顯著升高（P < 0.05）；不同Hcy濃度之間比較，ABCA1mRNA表達(dá)、ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)和ABCA1啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 Hcy使人主動脈平滑肌細(xì)胞ABCA1啟動子甲基化水平升高及表達(dá)下降，引起膽固醇流出率降低，可能是其引起動脈粥樣硬化的病理機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 同型半胱氨酸；ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1；甲基化；血管平滑肌細(xì)胞

[中圖分類號] R543.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of homocysteine （Hcy） on the promoter methylation and expression of ATP binding cassette transporter A1 （ABCA1） in human aortic smooth muscle cells. Methods The human aortic smooth muscle cells were divided into two groups： the control group and the experimental group. The cells in the control group were cultured without Hcy， however cells in the experimental group were cultured with different concentrations of Hcy （50， 100， 200， 500 μmol/L）. The cholesterol outflow rate was detected by scintillation counting technique， the expression of ABCA1 mRNA was detected by real-time quantitative PCR， the expression of ABCA1 protein was detected by Western-blotting， the ABCA1 promoter methylation was detected by nested detection of PCR. Results There was no significant difference in cholesterol efflux rate at each time point in the control group （P > 0.05）. Compared with Hcy treatment for 0 h and 12 h， after treatment of 24 h and 48 h the cholesterol efflux rate of the experimental were significantly decreased （P < 0.05）. After treated with Hcy for 0 h and 12 h， compared with the control group， there was no significant difference in cholesterol efflux rate （P > 0.05）. After treated with Hcy for 24 h and 48 h， compared with the control group， cholesterol efflux rate of the experimental group was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with control group， ABCA1 mRNA relative expression level decreased （P < 0.05）， the relative expression level of ABCA1 protein was decreased （P < 0.05）， ABCA1 promoter methylation level was significantly increased （P < 0.05）. There was no significant difference in ABCA1mRNA expression， ABCA1 protein expression and ABCA1 promoter methylation level between different Hcy concentrations groups （P > 0.05）. Conclusion Hcy can increase the methylation level of ABCA1 promoter and decrease the expression of ABCA1 in aortic smooth muscle cells that lead to lower cholesterol efflux rate， which may be one of the pathological mechanisms of atherosclerosis.endprint

[Key words] Homocysteine； ATP binding cassette transporter A1； Methylation； Vascular smooth muscle cells

血管平滑肌細(xì)胞膽固醇流出減少轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化病理改變之一[1]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCAl）是介導(dǎo)膽固醇流出的限速因子，其功能下降會引起膽固醇流出障礙[2]。人類ABCAl基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平增高能夠引起其表達(dá)及功能下降[3]。同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素，其表觀遺傳機(jī)制越來越受到重視。Hcy增高會加速蛋氨酸循環(huán)，引起DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）增加，導(dǎo)致特定基因甲基化水平增高而影響其表達(dá)和功能[4]。已有研究表明，Hcy可以引起人單核源性泡沫細(xì)胞ABCA1基因甲基化水平上升[5]，導(dǎo)致膽固醇流出率下降，Hcy對人血管平滑肌細(xì)胞ABCA1基因啟動子甲基化水平是否存在影響，目前尚無相關(guān)報道，對此本文進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

液體閃爍計數(shù)儀（美國PerkinElmer）；T/G HAVSMC細(xì)胞株（上海弘順）；Hcy和[3H]膽固醇（美國Sigma）；ABCA1一抗（英國Abcam），β-actin一抗（北京中杉金橋），HRP二抗（1∶500，武漢博士德）；DNA甲基化修飾試劑盒（美國Epigenek）。

1.2 平滑肌細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與分組

人主動脈平滑肌細(xì)胞株（T/G HAVSMC）細(xì)胞來自美國ATCC公司，復(fù)蘇細(xì)胞株后培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：89%DMEM（高糖）+10%FBS+1%雙抗，細(xì)胞密度達(dá)到80%以上進(jìn)行1∶2或1∶3傳代，2～3 d換液周期，取傳3～4代后細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗，實(shí)驗分為，①對照組：加入0 μmol/L Hcy；②實(shí)驗組：加入不同濃度Hcy（50、100、200、500 μmol /L）培養(yǎng)，每組5瓶。

1.3 膽固醇流出實(shí)驗

將加入不同濃度 Hcy培養(yǎng)T/G HAVSMC細(xì)胞至0、12 、24 h及48 h時間點(diǎn)，用0.2μCi/mL[3H]膽固醇在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育48 h，待細(xì)胞長至85%時，用PBS液洗滌細(xì)胞2次，置含100 μg/mL的高密度脂蛋白的無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育16 h，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞中的[3H]膽固醇，膽固醇流出率=培養(yǎng)液中[3H]/總[3H]（培養(yǎng)液[3H]+細(xì)胞[3H]）×100%[6]。見圖1。

1.4 ABCA1 mRNA表達(dá)水平檢測

收集細(xì)胞，抽提總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時定量PCR法檢測GAPDH、ABCA1 mRNA的含量，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min后40次循環(huán)擴(kuò)增（95℃ 10 s，58℃ 30 s，58℃ 30 s）。以GAPDH為內(nèi)參，計算其相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt分析。引物序列如下：ABCA1：上游5′-GGGTGGTGTTCTTCCTCATTAC?TG-3′；下游5′-CCGCCTCACATCTTCATCTTCATC-3′；5′-AGCGTAGCGTTCTCATCC-3′；GAPDH上游5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；下游5′-CGCT?CCTGGAAGATGGTGATGG-3′[7]。

1.5 ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測

使用Western-blotting方法，提取T/G HAVSMC細(xì)胞總蛋白，4℃離心后取上清，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入 ABCA1一抗（1∶500）和β-actin（1∶1000）4℃孵育過夜，結(jié)合HRP二抗孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，暗室曝光、顯影和定影。膠片掃描結(jié)果采用 Quantity-one軟件分析，將目的條帶與β-actin光密度值比較，所得比值表示蛋白相對含量。

1.6 ABCA1啟動子甲基化水平檢測

參照本課題組建立的方法[8]，使用巢式甲基化PCR檢測，在線設(shè)計外引物（Out）、甲基化引物（M）和非甲基化引物（U）（見表1）。提取T/G HAVSMC細(xì)胞DNA，用重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行2次PCR，取擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，采集圖像Quantity-One軟件分析，測量甲基化和非甲基化條帶光密度值，二者比值反映甲基化水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽固醇流出實(shí)驗

對照組各時間點(diǎn)間膽固醇流出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；各Hcy濃度組不同時間比較顯示，24、48 h膽固醇流出率均明顯低于0、12 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。與對照組比較，0、12 h各Hcy濃度組膽固醇流出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）；24、48 h各Hcy濃度組膽固醇流出率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。雙因素方差分析顯示，Hcy對膽固醇流出率的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.551，P < 0.01），時間對膽固醇流出率的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.447，P < 0.05），Hcy和時間對膽固醇流出率的交互影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.8179， P > 0.05。見表2。

2.2 ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)以及啟動子甲基化水平endprint

與對照組比較，不同濃度Hcy導(dǎo)致T/G HAVSMC細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（表3）；與對照組比較，不同濃度Hcy導(dǎo)致T/G HAVSMC細(xì)胞ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖2、表3）；與對照組比較，不同濃度Hcy導(dǎo)致T/G HAVSMC細(xì)胞ABCA1啟動子甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖3、表3）。不同Hcy濃度之間比較，ABCA1 mRNA表達(dá)、ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)和ABCA1啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出減少引起膽固醇沉積，轉(zhuǎn)化成為泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制之一[9]。研究表明，Hcy能夠引起巨噬細(xì)胞膽固醇流出率下降[10-11]，然而Hcy能否導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞膽固醇流出率改變，目前尚無相關(guān)報道。在本實(shí)驗中，用不同濃度的Hcy處理平滑肌細(xì)胞24 h和48 h后，膽固醇流出率下降，雙因素方差分析提示Hcy和時間對膽固醇流出率都具有影響，說明了Hcy能夠降低血管平滑肌細(xì)胞膽固醇流出率。動脈粥樣硬化病變部位的血管平滑肌細(xì)胞中ABCA1表達(dá)明顯下降[11]，研究表明，ABCA1啟動子甲基化水平增高可以導(dǎo)致其表達(dá)下降[2]。Hcy增高對于特定基因啟動子甲基化的存在不同的影響[12]。在本實(shí)驗中，在不同濃度Hcy的作用下，人主動脈平滑肌細(xì)胞ABCA1啟動子甲基化水平顯著升高，同時其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均下降，可能的原因是Hcy增高會加速了蛋氨酸循環(huán)，引起DNMTs增加，DNMTs增高可以引起某些基因啟動子區(qū)的高甲基化，從而引起基因沉默及表達(dá)下降[13]。

本實(shí)驗研究結(jié)果還顯示，用Hcy處理24 h和48 h后，100 μmol/L Hcy組膽固醇流出率最低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即Hcy的作用不具有劑量依賴性的。高濃度的Hcy的作用并未相應(yīng)增強(qiáng)，其可能的原因是Hcy通過多種機(jī)制對血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生影響，當(dāng)濃度進(jìn)一步升高后，其促進(jìn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等機(jī)制可能對細(xì)胞造成更嚴(yán)重的傷害，從而掩蓋其對甲基化修飾的影響，與類似的研究結(jié)果相同[5，10]。

綜上所述，Hcy可以導(dǎo)致人主動脈平滑肌細(xì)胞ABCA1啟動子甲基化水平升高，引起其表達(dá)下降，造成膽固醇流出率的降低，可能是其引起AS的發(fā)病原因之一。目前針對巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究較多，而對于血管平滑肌細(xì)胞研究較少，而血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在AS的發(fā)病中具有重要的意義[12]，該研究深化了Hcy致動脈粥樣硬化機(jī)制的認(rèn)識，為尋找新的作用靶點(diǎn)提供有意義的實(shí)驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-09-05 本文編輯：任 念）endprint