劉冰+霍會永+馮社軍

[摘要] 目的 探究Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖、遷移及凋亡的影響，并嘗試探討其作用機制。 方法 將U251細(xì)胞分為兩組，一組用Tizanidine（20 μmol/L）處理24 h；另一組用DMSO處理為對照組。采用CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖情況；采用Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲情況；采用細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡情況，采用Western blot檢測PI3K-AKT信號通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量的變化。 結(jié)果 CCK8增殖實驗表明Tizanidine可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖（P < 0.05）；Transwell結(jié)果說明Tizanidine可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的遷移和侵襲（P < 0.05）；流式凋亡結(jié)果分析顯示經(jīng)無血清凋亡誘導(dǎo)后，經(jīng)Tizanidine處理的細(xì)胞凋亡明顯增多（P < 0.05），Western blot 結(jié)果顯示經(jīng)過Tizanidine處理的U251細(xì)胞，細(xì)胞的抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（BCL-2）的表達(dá)量顯著下調(diào)（P < 0.05），促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）和Active Caspase3表達(dá)量則顯著上調(diào)（P < 0.05），AKT和mTOR的磷酸化水平均受到了顯著抑制（P < 0.05），PI3K/AKT信號通路的下游蛋白P70、CyclinD1的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)（P < 0.05）。 結(jié)論 Tizanidine抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡，這有可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] Tizanidine；U251；PI3K/AKT信號通路

[中圖分類號] Q71 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0027-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Tizanidine on the proliferation， migration and apoptosis of U251， and to explore its mechanism， as well. Methods U251 cells were divided into two groups， one group treated with Tizanidine （20 μmol/L）， and the other treated with DMSO as control group. CCK8 assay was used to detect cell proliferation； Transwell assay was performed to detect cell migration and invasion； flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis； Western blot was used to detect the expression of PI3K-AKT signaling-related proteins and apoptosis-related proteins. Results The proliferation of U251 cell was inhibited by Tizanidine （P < 0.05）； and Tizanidine treatment also inhibited migration and invasion of U251 cell （P < 0.05）； Tizanidine induced apoptosis in U251 cell （P < 0.05）； Western blot showed that the expression of Bcl-2 was significantly down-regulated （P < 0.05）， and the expression of BAX and Active Caspase3 were both significantly up-regulated in Tizanidine-treated U251 cells （P < 0.05）， respectively. In addition， Tizanidine significantly inhibited the phosphorylation levels of AKT and mTOR （P < 0.05）， and the expression of related downstream proteins （P70s6k and Cyclin D1） were decreased in U251 cells （P < 0.05）. Conclusion Tizanidine inhibits proliferation， migration and invasion， induces apoptosis in U251 cell， which may be achieved by inhibiting activation of the PI3K/AKT signaling pathway.

[Key words] Tizanidine； U251； PI3K/AKT signaling

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，即腦膠質(zhì)瘤，是人腦腫瘤中所占比例最大并且發(fā)病率也相對較高的一類腫瘤，它的發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的46%，綜合發(fā)病年齡有兩個高峰期，分別集中在30～40歲和10～20歲。由于膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高且易復(fù)發(fā)的特點[1]，且膠質(zhì)瘤具有很強的侵襲性和遷移能力，導(dǎo)致臨床上通過手術(shù)切除聯(lián)合放療和化療的傳統(tǒng)療法難以有效治療膠質(zhì)瘤[2-3]。因此，探索和研究大腦中腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移的新的分子機制并找出其轉(zhuǎn)移的有效靶點，對于治療腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤有重要的臨床借鑒意義。Tizanidine是一種α2-腎上腺素能受體激動劑，能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）去甲腎上腺素能神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)，臨床上常作為肌肉松弛劑，用于治療由脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種硬化癥，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、痙攣性癱瘓、背部疼痛或某些其他損傷引起的肌肉痙攣、痙攣和緊張。也是一種輔助睡眠的抗驚厥藥[4-5]。本研究主要用Tizanidine治療膠質(zhì)瘤，檢測其能否有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖，并嘗試闡述Tizanidine影響細(xì)胞增殖、凋亡的具體機制。endprint

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞株購于中國上海中科院細(xì)胞庫；Tizanidine購于美國MCE公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；血清購自美國的Gibco公司；雙抗購于美國SIGMA公司；0.25%胰酶消化液（EDTA）、CCK8-kit購于北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購于美國AMRESCO公司；RIPA蛋白裂解液、RIPA Lysis Buffer、BCA蛋白定量試劑盒、BCA Protein Assay Kit、蛋白酶抑制劑混合物Protease Inhibitor Cocktail購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（CWBIO）；蛋白上樣緩沖液，LDS Sample buffer購于美國Invitrogen公司；蛋白預(yù)染Marker購自美國Thermo公司；ECL顯影液、一抗（bcl-2、bax、active-caspase3、CyclinD-1、P-70、tubulin）、HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗購于美國PTG公司；一抗（AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）購于CST公司；TRANSWELL小室購于美國Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

使用DMEM培養(yǎng)液（含10%血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素）于37℃，5%CO2環(huán)境下對U251細(xì)胞進行常規(guī)培養(yǎng)，對數(shù)生長期進行傳代處理。孔板中的細(xì)胞密度達(dá)80%左右時，Tizanidine（20 μmol/L）處理24 h，對照組（NC）加DMSO（1∶1000），其他處理條件與實驗組一致。

1.3 CCK8檢測Tizanidine對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響

用胰蛋白酶對貼壁的U251細(xì)胞消化離心后，制備細(xì)胞懸液，計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，取適量細(xì)胞懸液，以100 μL/孔（約1000個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)）種進96孔板，對照組和Tizanidine組分別加入千分之一的DMSO和20 μmol/L的Tizanidine，將細(xì)胞放于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中常規(guī)培養(yǎng)。每隔24 h每孔加10 μL CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，檢測細(xì)胞活力，并用酶標(biāo)儀在450 nm激發(fā)光下檢測OD值，繪制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖曲線。

1.4 Transwell遷移和侵襲實驗檢測Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移和侵襲的影響

將提前過夜融解的Matrigel基質(zhì)膠100 μL（無血清培養(yǎng)液按1：6稀釋）加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃勻后置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中靜置4～6 h成膠，后吸干培養(yǎng)液，下室中加500 μL不含血清的培養(yǎng)液，靜置半小時水化基底膜。用無血清培養(yǎng)液將加藥處理了24 h的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后取約100 μL細(xì)胞懸液（1×105個）加入到上室中，同時在下室中加入500 μL完全培養(yǎng)液。過夜處理后，取出小室，擦掉上室中殘余的細(xì)胞，用PBS清洗后，用4%多聚甲醛進行固定，時間為30 min。之后，用0.1%結(jié)晶紫進行染色，時間為20 min，再用PBS清洗，顯微鏡下隨機選取5個視野拍照觀察并計數(shù)。

遷移實驗步驟類似于侵襲實驗，Transwell小室無須進行鋪膠處理，細(xì)胞數(shù)目將為5000個。

1.5 Annexin V/FITC檢測Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡的影響

細(xì)胞加藥處理24 h后，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，常規(guī)條件下培養(yǎng)饑餓24 h。收集細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化后收集到離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞并再次離心，小心吸出上清。加入1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為1×106～5×106/mL。取5 mL的流式管加入100 μL細(xì)胞懸液，再加入5 μL Annexin V/FITC，混勻，室溫下避光孵育5 min。再加入10 μL PI染液，同時加400 μL PBS，之后進行上機檢測。用Flowjo軟件對流式結(jié)果進行分析處理。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞增殖、遷移、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

將對照組和Tizanidine組加藥處理24 h，之后將六孔板置于冰上，加入300 μL/孔的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解20 min，提取蛋白于1.5 mL EP管內(nèi)，BCA法測定蛋白濃度，95℃加熱5 min。垂直電泳槽內(nèi)每孔內(nèi)加入約20 μg蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對離蛋白樣品進行分離，轉(zhuǎn)膜，裁膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜。次日，取出條帶，用TBST于搖床上洗3次，每次5 min，之后對條帶二抗室溫孵育1 h，洗膜，加ECL顯影。Quantity One軟件掃描灰度值，以GAPDH為內(nèi)參對照，用目的蛋白與內(nèi)參的比值計算各蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響

CCK8增殖實驗結(jié)果表明，經(jīng)過Tizanidine處理48 h和72 h的U251細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果表明，Tizanidine處理的U251細(xì)胞侵襲能力受到顯著抑制[（35±4）個比（17±2）個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.97，P < 0.05）；遷移能力也同樣受到抑制[（113±5）比（75±3）個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.29，P < 0.05）。見圖2。endprint

2.3 Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡的影響

流式凋亡結(jié)果分析表明：經(jīng)無血清凋亡誘導(dǎo)后，Tizanidine處理組細(xì)胞凋亡明顯增多[（11.87±0.27）%比（4.15±0.31）%，t=32.53，P < 0.05]，見圖3?？沟蛲龅鞍譈淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)量顯著下降[（0.598±0.095）比（1.00±0.180），t=3.421，P < 0.05]，促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-Associated X protein，BAX）表達(dá)量上調(diào)[（1.990±0.150）比（1.00±0.124），t=8.811，P < 0.05]，Active Caspase3表達(dá)量同樣顯著上調(diào)[（1.477±0.079）比（1.00±0.126），t=5.555，P < 0.05]。見圖4。

2.4 Tizanidine對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中PI3K/AKT信號通路的影響

Western blot結(jié)果表明經(jīng)過Tizanidine處理的U251細(xì)胞，AKT和mTOR的磷酸化水平均受到了顯著抑制[（0.627±0.102）比（1.000±0.201），t=2.87，P < 0.05；（0.491±0.130）比（1.000±0.282），t=2.84，P < 0.05]。PI3K/AKT信號通路的下游蛋白p70核糖體蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70s6k/P70）和G1/S-特異性周期蛋白-D1（CyclinD1）的表達(dá)也同樣被抑制[（0.537±0.074）比（1.000±0.314），t=2.79，P < 0.05；（0.417±0.084）比（1.000±0.197），t=4.72，P < 0.05]。見圖5。

3 討論

膠質(zhì)瘤，即腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，是臨床上比較常見的一種顱內(nèi)腫瘤，由于其無法控制的細(xì)胞增殖以及腫瘤侵襲性等生物學(xué)行為，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[6]。U251細(xì)胞是目前已經(jīng)建立的比較經(jīng)典的一類人的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，現(xiàn)作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞模型已經(jīng)被廣泛用于科研工作中。

Tizanidine是一種α2-腎上腺素能激動劑，可以激活α2-腎上腺受體，進而對天冬氨酸和谷氨酸或者P物質(zhì)的釋放產(chǎn)生抑制作用[7]。此外，它還能激活第二信使，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，同時激活細(xì)胞鉀離子通道，引起細(xì)胞膜的超極化，對鈣離子內(nèi)流產(chǎn)生抑制，引發(fā)下游效應(yīng)。為探究Tizanidine在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用，本研究選用Tizanidine處理U251細(xì)胞并檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況。實驗結(jié)果顯示Tizanidine可以顯著抑制U251細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的進展。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路由Ras、PTEN、PIP、PI3K、AKT等多種蛋白組成。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、生長以及存活等生命活動中發(fā)揮著重要作用，并發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中過表達(dá)[8-11]。磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphotidylinositol 3，4，5-trisphosph?ate，PIP3）是磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)上的3'-OH磷酸化了的一類酶，包括Ⅰ、Ⅱ類和Ⅲ類[12]。它是由PI3K產(chǎn)生的一種十分重要的脂質(zhì)第二信使，并能夠通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活絲氨酸/蘇氨酸激酶（phosphoin?ositide dependent kinase-1，PDK1）和AKT[13-14]。AKT，也就是我們通常所說的蛋白激酶B，可以通過磷酸化mTOR來控制蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的生長[15-16]。研究表明，PI3K/AKT信號通路的激活會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖失去控制，進而引發(fā)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[17]。近年來有研究顯示，IA型PI3K及其下游分子AKT所組成的PI3K/AKT信號通路在人類腫瘤的生物學(xué)特性中十分重要[18]。PI3K/AKT信號通路可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，能夠引發(fā)腫瘤細(xì)胞代謝活動異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并且該信號通路與腫瘤的遷移、增殖、黏附等密切相關(guān)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)Tizanidine處理可以減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中PI3K/AKT通路的激活以及其下游相關(guān)蛋白P70和CyclinD1的表達(dá)，提示Tizanidine可能是通過PI3K/AKT通路產(chǎn)生抑癌作用。以上結(jié)果提示Tizanidine或許能夠給膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療提供新的藥物靶點，其具體機制仍待進一步研究。

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（收稿日期：2017-08-24 本文編輯：任 念）endprint