王玉濤, 潘建飛,黃翠翠,胡 平,韓建林,,*
1 喀什大學,生命與地理科學學院,喀什 844000 2 喀什大學新疆維吾爾自治區(qū)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室,喀什 844000 3 中國農業(yè)科學院-國際家畜研究所畜禽牧草遺傳資源聯(lián)合實驗室,北京 100073
雪雞屬鳥綱(Aves),雞形目(Galliformes),雉科(Phasianidae),雪雞屬(Tetraogallus),包括高加索雪雞(T.caucasicus)、里海雪雞(T.caspius)、阿爾泰雪雞(T.altaicus)、喜馬拉雅雪雞(T.himalayensis)和藏雪雞(T.tibetanus)5個種[1-2],后3種在中國境內均有分布,其中喜馬拉雅雪雞又稱暗腹雪雞,藏雪雞又稱淡腹雪雞。喜馬拉雅雪雞是雪雞屬中體形最大的種[3],在國內主要分布在昆侖山西部、祁連山脈和喜馬拉雅山西部等地,按照分布格局不同又分為有4個亞種:即指明亞種(T.h.himalayensis)分布于我國新疆西部;疆南亞種(T.h.grombszewskii)主要分布于昆侖山西部向東到新疆于田附近;青海亞種(T.h.koslowi)分布于自阿爾金山西部向東經祁連山至青海湖南部地區(qū);天山亞種(T.h.sewerzowi)分布于新疆天山山脈[3]。在國外,阿富汗、土耳其至尼泊爾、巴基斯坦和哈薩克斯坦均有分布[4-6]。昆侖山-帕米爾高原是喜馬拉雅雪雞的分布中心,然而由于全球氣候變化、人類活動干擾、天敵侵害和非法狩獵,喜馬拉雅雪雞賴以生存環(huán)境不斷惡化,群體數(shù)量急劇下降。喜馬拉雅雪雞現(xiàn)為國家Ⅱ級重點保護動物,已被IUCN紅色目錄列為低危(LC)物種[7],中國脊椎動物紅色名錄列為近危(NV)[8]。
雪雞既具有較高的藥用和觀賞價值,又具有一定的生態(tài)價值。關于喜馬拉雅雪雞的研究主要集中在野外生境、巢址選擇、食性和繁殖習性,圈養(yǎng)馴化和繁育以及起源進化方面[9-29]。在起源進化方面,劉強等利用雪雞mtDNACytb基因全長序列(1143bp)與雉科中其他19個屬的Cytb基因進行同源性比較,結果表明雪雞屬在雉科中與鵪鶉屬親緣關系最近,其次是石雞屬,雪雞屬與鵪鶉屬的分歧時間為1.5百萬—2.0百萬年,與石雞屬分歧時間為1.7百萬—2.4百萬年[30]。Ruan等利用mtDNACytb基因部分序列(535bp)分析了6個喜馬拉雅雪雞群體,表明新疆天山地區(qū)雪雞群體遺傳多樣性豐富,且群體間存在基因交流[31-32]。王小立通過對喜馬拉雅雪雞的線粒體DNA控制區(qū)(mtDNAD-loop)序列和微衛(wèi)星進行標記檢測,研究了我國喜馬拉雅雪雞11個地理種群的分子系統(tǒng)地理學,結果表明11個地理種群分為4個進化分支,且近期經歷過種群分化、基因交流受到限制并且在冰期發(fā)生過擴張[33-34]。但以上研究中,涉及東帕米爾高原境內的喜馬拉雅雪雞樣本數(shù)量較少或不足,不足以代表整個地理種群。因此,關于雪雞地理學及遺傳多樣性研究,急需擴大樣本數(shù)量以及地理覆蓋度。
帕米爾高原是地球上兩條巨大山帶 (阿爾卑斯-喜馬拉雅山帶和帕米爾-楚科奇山帶)的山結,也是亞洲大陸南部和中部地區(qū)主要山脈的匯集處,這里群山起伏、連綿逶迤、雪峰群立、聳入云天,因此人口稀少,人類活動較少,是野生動物理想的棲息地。但隨著社會經濟的飛速發(fā)展,人類活動加劇,帕米爾高原植被退化嚴重,荒漠化進程加速,野生動物棲息地生境破碎化程度嚴重[35],邊緣效應加劇,物種內基因交流受阻,群體遺傳多樣性降低,導致該區(qū)域面臨生物多樣性喪失、生態(tài)系統(tǒng)服務低下和貧困的惡性循環(huán)[36],因此開展區(qū)域內生物多樣性評估具有重要的意義。關于東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞群體遺傳多樣性評估及相關研究尚未見報道,因此為闡明東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞遺傳多樣性水平和系統(tǒng)進化地位,本文選擇mtDNAD-loop序列信息,利用生物信息學軟件分析雪雞mtDNAD-loop序列特征和遺傳多樣性水平;選擇GenBank中已提交的雪雞序列,利用最大似然法構建系統(tǒng)進化樹以及中介網絡構建系統(tǒng)發(fā)育關系,這可為喜馬拉雅雪雞遺傳資源保護和利用提供理論依據(jù)。
喜馬拉雅雪雞樣本是從2008年開始在新疆帕米爾高原的塔什庫爾干野生動物自然保護區(qū)(紅其拉甫、達布達爾、恰拉奇古等區(qū)域)、阿克陶縣和帕米爾雪雞繁育基地收集雪雞尸體的肌肉組織,合計25個。收集的肌肉組織放入75%酒精中-80℃保存,肌肉組織樣本保存在喀什大學葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室。
肌肉組織基因組DNA提取參照《分子克隆》(第三版)的提取方法,采用常規(guī)的酚·氯仿抽提法,并結合實驗室條件進行了優(yōu)化和改進。
利用Primer 5軟件,根據(jù)GenBank上公布的雪雞mtDNA序列(登錄號:NC.027279)設計特異性擴增引物。正向引物L15725x-15705:5′-CCTAGCAGCCTCAGTACTCATCCTAC-3′,反向引物H1530x-1498:5′-CCGCGGTGGCTGGCACAAGATTTACC-3′,測序引物L15725-seq1:5′-CCTCTATTTTTCCCACAAAACTAGG-3′。 引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。
PCR反應體系:總體積25μL,其中TaqDNA酶(500U)0.5μL,dNTPs(10mmol/L)0.5μL,Buffer(2.5mmol/L)12.5μL,上下游引物(10pmol/μL)1μL,DNA模板(100ng/μL)1μL,ddH2O 8.5μL。
擴增反應條件:94℃預變性3min,35個循環(huán)(94℃變性30s, 63℃退火30s, 72℃72延伸1.5min),72℃延伸7min,4℃保存。PCR產物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增產物送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。
Chromas Version 1.45對喜馬拉雅雪雞mtDNAD-loop區(qū)序列進行人工校對。用MEGA 5.0比對序列以及統(tǒng)計序列堿基組成,并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。DnaSPV5用于統(tǒng)計單倍型,計算單倍型和核苷酸多樣性指標,利用Adobe Illustrator軟件對圖片進行處理。利用Network4.6.1.1軟件對本研究所得序列和GenBank下載的喜馬拉雅雪雞和藏雪雞的同源mtDNAD-loop序列進行網絡關系及其單倍型分布頻率分析。喜馬拉雅雪雞和藏雪雞序列信息見表1。
表1 雪雞mtDNA D-loop序列信息表Table 1 mtDNA D-loop sequence information of Tetraogallus
圖1 mtDNA PCR擴增產物Fig.1 Amplifications of mtDNA gene
對25份喜馬拉雅雪雞mtDNA目的片段進行PCR擴增,擴增產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。檢測產物大小與目的片段長度一致(2496bp),且條帶清晰,無雜帶或拖帶,無非特異擴增產物,可以用于PCR產物直接測序。
2.2.1 mtDNA D-loop核苷酸組成
對25個喜馬拉雅雪雞mtDNAD-loop區(qū)進行序列測定,測序結果經比較、矯正后獲得了1157bp的全長序列。與參照序列NC027279進行對比編輯進行分析。結果表明:mtDNAD-loop中T、C、A、G 4種堿基平均比例分別為33.0%、26.2%、26.8%、14.0%,A+T的平均含量為59.8%,顯著高于G+C平均含量40.2%。因此雪雞mtDNAD-loop區(qū)富含A和T。進而說明堿基組成具有偏倚性,符合禽類線粒體DNA序列特征。
2.2.2 mtDNA D-loop核苷酸變異與單倍型多樣性分析
利用DnaSP5.10.01軟件對25個喜馬拉雅雪雞的mtDNAD-loop高變區(qū)進行單核苷酸多態(tài)性分析,以Hap1為標準,共檢測到64個多態(tài)位點,占所測核苷酸的5.5%。其中有29個單一多態(tài)位點,位于第32、165、199、290、295、299、304、349、392、393、397、400、404、407、409、452、478、504、524、544、566、571、581、585、598、646、697、723和725位;33個簡約信息位點,位于第146、166、168、173、189、205、208、217、218、220、222、223、231、236、237、242、243、245、256、289、383、554、573、576、578、606、609、714、740、780、826、838和1003位;240和953位存在兩個插入/缺失位點。本實驗檢測到轉換、顛換、插入或缺失4種核苷酸變異類型,其中轉換42次,占變異位點數(shù)的65.63%,A/G之間轉換8次,T/C之間轉換34次;顛換20次,占變異為點數(shù)的31.25%;存在兩處插入或缺失,在240處插入或缺一個C,在953處插入或缺失一個T。
通過DnsSP5.10.01軟件對喜馬拉雅雪雞的25個個體mtDNAD-loop區(qū)序列進行多態(tài)性分析,結果共檢測到64個多態(tài)位點,存在23種單倍型,命名為Hap1—Hap23(表2),25個雪雞中有2個個體共享單倍型Hap11,2個個體共享單倍型Hap19,其余23個個體均為獨立單倍型。平均單倍型多樣度(Hd)為0.92±0.0001,平均核苷酸多樣度(π)為0.00958,平均核苷酸差異度(K)為11.067,從而顯示東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞核苷酸多樣性較低,單倍型多樣性高,具有較為豐富的遺傳多樣性。
表2 25個喜馬拉雅雪雞mtDNA D-loop 的23個單倍型變異序列Table 2 Sequence variation of 23 haplotypes in 25 Tetraogallus himalayensis group mtDNA D-loop
2.2.3 mtDNA D-loop區(qū)序列(1157bp)堿基變異和核苷酸多樣性分布
利用DnaSP5.10.01軟件分析高變區(qū)序列變異的位置(圖2)。結果表明:喜馬拉雅雪雞mtDNAD-loop序列堿基變異的分布有很大的差異,在1—80bp之間較保守,在80—300bp之間變異較大,300—500bp相對保守,在500—700bp之間變異增大,700—1157bp相對比較保守,其中在230bp處的堿基變異最豐富。這一結果符合mtDNAD-loop的結構組成特點,5′末端為高變區(qū)I,突變率較高的中間區(qū)域為保守區(qū)域II,3′末端為高變區(qū)III。從而驗證了擴增序列是來自mtDNAD-loop區(qū)域。對mtDNAD-loop序列核苷酸多樣性分布分析(圖3),結果表明:在堿基1—80bp之間保守,80—270bp之間核苷酸多樣度較高,在270—500bp之間變異較少,500—700bp之間略微有所增加,在750bp之后逐漸趨于保守之勢,在230bp處核苷酸多樣度的值最大。核苷酸變異分布與核苷酸多樣性分布基本一致。對mtDNAD-loop區(qū)序列(1157bp)錯配分布分析(圖4),表明東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞經歷過群體擴張。
2.3.1 系統(tǒng)發(fā)育分析
結合本研究獲得數(shù)據(jù),下載GenBank已提交的雪雞屬mtDNAD-loop同源序列(886bp),比對分析共獲得84個單倍型雪雞(表1),利用MEGA6.1軟件,采用Kimura-2模型,以鄰接法構建其NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),并對拓撲圖進行自展檢驗,重復抽樣次數(shù)為1000,然后以2條喜馬拉雅雪雞(GQ343551、GQ343550)的mtDNAD-loop同源序列作為根序列。
圖2 mtDNA D-loop區(qū)序列堿基變異分布Fig.2 mtDNA D-loop base variation distribution
圖3 mtDNA D-loop序列核苷酸多樣度分布Fig.3 mtDNA D-loop nucleotide diversity distribution
圖4 mtDNA D-loop堿基錯配分布 Fig.4 Mismatch distributes for all Tetraogallus himalayensis samples
圖5 84個雪雞mtDNA D-loop單倍型構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Evolution tree Tetraogallus constructs 84 mtDNA D-loop haplotypes in NJ tree
從圖5系統(tǒng)發(fā)育樹可以發(fā)現(xiàn),84個單倍型共分為兩大支。一支為喜馬拉雅雪雞,一支為藏雪雞。而喜馬拉雅雪雞支又分為3支,本實驗確定的23個單倍型喜馬拉雅雪雞聚在2個進化支上,其中19個單倍型與Wang等[35],Luzhang等[33]采集自塔什庫爾干縣樣本(H32,H33,H34,AFXI-83)聚一個進化支上,可見來自東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞獨享進化支,但單倍型Hap2、Hap17、Hap5、Hap15聚在另一個進化支上,進而說明該區(qū)域喜馬拉雅雪雞出現(xiàn)種群分化。
2.3.2 網絡關系分析
Network網絡分析法是系統(tǒng)進化分析最常用的方法之一,主要用于闡述種內水平的系統(tǒng)發(fā)育關系,能清晰地表明單倍型之間的關系、各單倍型在各群體中的分布頻率及其基因流的方向。利用Network4.6.1.1軟件對雪雞mtDNAD-loop84個單倍型的網絡關系進行分析(圖6)。結果顯示網絡關系分析與其系統(tǒng)發(fā)育NJ樹的結果完全一致,所有的單倍型聚為2個簇群,分別為喜馬拉雅雪雞簇群和藏雪雞簇群。按照動物地理分布分析,本研究的19個單倍型與前人研究的4個單倍型聚在以東帕米爾高原為中心的喜馬拉雅雪雞簇中,且形成單獨的一支,不與其他區(qū)域雪雞共享進化支;其余4個單倍型與其他單倍型聚在以昆侖山、天山、阿爾金山和祁連山為分布區(qū)域的喜馬拉雅雪雞簇中。由此可見喜馬拉雅雪雞遺傳特征具有明顯的地理分布特征,并由此形成不同的亞種,說明雪雞進化具有明顯的地理起源特征。所有藏雪雞均聚在以青藏高原為中心的簇中。
圖6 84個單倍型網絡關系Fig.6 Network relationship of the 84 haplotypes
本研究喜馬拉雅雪雞25個樣本獲得1157bp長的mtDNAD-loop區(qū)序列,與其他鳥類控制區(qū)長度差異不大。喜馬拉雅雪雞堿基A+T的含量為59.8%,高于G+C的含量40.2%,證明雪雞mtDNAD-loop區(qū)序列存在堿基偏倚性,符合鳥類線粒體DNA堿基組成偏倚性的特點。這與脊椎動物mtDNA的特點一樣,存在一條重鏈和一條輕鏈,就是由于這兩條鏈的A+T的含量差異造成的。共發(fā)現(xiàn)64個變異位點,占所檢測核苷酸的5.53%,其中有29個單一多態(tài)位點,33個簡約信息位點和兩個插入/缺失位點,變異較高。
單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(π值)是衡量一個群體mtDNA 變異程度的兩個重要指標。π值越大遺傳多樣性越高。本實驗喜馬拉雅雪雞π值為0.00958,平均單倍型多樣度為0.92±0.0001,說明東帕米爾喜馬拉雅雪雞核苷酸多樣性低,而單倍型多樣性較高,這與王小立對喜馬拉雅雪雞的11個地理種群67個樣品的mtDNAD-loop的平均核苷酸多樣性為0.0103±0.00523,單倍型多樣性為0.977±0.00690結果一致[34]。安蓓對西藏雪雞部分mtDNAD-loop控制區(qū)序列進行研究,結果表明藏雪雞的核苷酸多樣性(π值)為0.0036[37-38],由此可見,喜馬拉雅雪雞的核苷酸多樣性高于藏雪雞。研究認為降低物種遺傳多樣性的主要原因有:(1)種群間隔離:長時間缺乏基因交流;(2)棲息地破壞:自然種群棲息地片段化和嚴重近親繁殖;(3)小種群遺傳效應:遺傳漂變、瓶頸效應和奠基者效應等[39]。由此推測出東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞可能由于缺乏基因交流和遺傳漂變導致核苷酸多樣性降低。鑒于此,喜馬拉雅雪雞作為國家Ⅱ級重點保護動物,國家林業(yè)部門應加強該物種的保護,建議:首先擴大位于東帕米爾高原的塔什庫爾干野生動物自然保護區(qū)范圍并建立國家自然保護區(qū),恢復生態(tài)環(huán)境,提高雪雞棲息地的適宜性;其次在東帕米爾高原原地建立雪雞人工馴化繁育基地,借助分子遺傳標記建立人工繁殖群體,以加強物種保護和利用;第三建立雪雞捕殺懲戒制度,對于人為捕殺者偷食者進行嚴重懲戒。
對喜馬拉雅雪雞和GenBank中雪雞mtDNAD-loop共84個單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育和網絡關系分析,兩者聚類分析結果一致,84個單倍型聚為喜馬拉雅雪雞簇和藏雪雞簇。關于喜馬拉雅雪雞和藏雪雞起源研究,包新康從種內亞種間分子系統(tǒng)發(fā)生關系、喜馬拉雅雪雞與藏雪雞分歧時間的估算以及高原及其周邊地質環(huán)境演變方面認定,喜馬拉雅雪雞和藏雪雞是在高原隆升前(也就是說在3.6百萬年前)就已經分化形成了,在青藏高原隆升初期的多瑙河冰期(3.5百萬—2.6百萬年),淡腹組雪雞(藏雪雞又叫淡腹雪雞)的一支由天山東部地區(qū)向東南擴散至青藏高原東部地區(qū)的一些高山,伴隨著青藏高原的隆升而形成藏雪雞;暗腹組雪雞(喜馬拉雅雪雞又稱暗腹雪雞)的一支形成喜馬拉雅雪雞后在高原隆升中期(大約0.88百萬年前)開始向高原上擴散并形成各亞種[40]。王小立研究了我國11個地理種群喜馬拉雅雪雞系統(tǒng)發(fā)育,結果表明喜馬拉雅雪雞存在4個進化支,即昆侖山進化支、青藏高原進化支、天山進化支和喀喇昆侖山進化支,而喀喇昆侖山進化支為東帕米爾高原(塔什庫爾干縣)所獨有,為獨立進化支,不與其他地理群體雪雞共享進化支[34],而本研究23個單倍型分布中19個單倍型(占84%)聚在以帕米爾高原為中心的進化支上,這與王小立研究結果一致。但本研究有4個單倍型不與喀喇昆侖山進化枝共享進化支,暗示了東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞經歷過群體擴張,具有兩個地理群體。帕米爾高原的群山起伏,連綿逶迤,冰川匯聚,雪峰群立,聳入云天,形成了獨特的地理區(qū)域,作為生長在高海拔低溫地區(qū)的鳥類,這里形成的地理障礙使得雪雞基因交流受到限制,即形成獨立的地理類群或亞種,這一點在本研究得到進一步證實。但東帕米爾高原喜馬拉雅雪雞是否經歷過群體擴張,由于受樣本數(shù)量的限制,尚需要進一步驗證。
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