云南省瘧疾報告病例惡性瘧原蟲PfKelch13基因突變與青蒿素耐藥性的關(guān)聯(lián)性分析

孫艾明， 王 劍， 董 瑩， 陳夢妮， 徐艷春， 鄧 艷， 毛祥華

(1. 大理大學 病原與媒介生物研究所普洱分部，普洱 665000； 2. 云南省寄生蟲病防治所 云南省瘧疾研究中心 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室，普洱 665000)

青蒿素是中國藥學工作者20世紀70年代從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的倍半萜內(nèi)酯類化合物，是一種高效、迅速且副作用小的新型抗瘧藥[1-2]。世界衛(wèi)生組織推薦以青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)作為治療惡性瘧疾最有效的一線抗瘧藥，在降低瘧疾相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率中起到了不可或缺的作用，顯著降低了全球范圍內(nèi)的瘧疾負擔[3]。但自2008年首次在柬埔寨地區(qū)報道青蒿素耐藥性蟲株以來[4]，東南亞的緬甸、泰國邊境等地也陸續(xù)檢測到青蒿素耐藥性蟲株[4-9]，目前，柬埔寨、老撾、緬甸、泰國及我國云南省處于青蒿素耐藥性泛濫的中心地帶[10-11]。云南省的惡性瘧流行區(qū)主要局限在中緬邊境地區(qū)[12]，其中80%以上的惡性瘧疾病例在緬甸境內(nèi)感染形成，而緬甸大部分地區(qū)均為青蒿素耐藥性惡性瘧流行區(qū)[13]，青蒿素使用歷史已超過30年[14]，持續(xù)的青蒿素類耐藥性惡性瘧原蟲的傳播將對全球瘧疾控制和消除造成嚴重威脅。

青蒿素及其衍生物是惡性瘧原蟲磷脂酰肌醇-3-激酶(Plasmodiumfalciparumphosphatidylinositol-3-kinase,PfPI3K) 的強效抑制劑[15]，Mbengue等[16]發(fā)現(xiàn)，PfKelch13的某些位點突變，可通過PfPI3K的信號變化，介導青蒿素耐藥性產(chǎn)生。Imwong等[17]、Wang等[18]和Huang等[19]進一步證實，緬甸惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域的F446I突變型基因，對青蒿素耐藥性產(chǎn)生有一定影響，但研究均未對兩者間的關(guān)聯(lián)性進行分析，針對我國云南省的惡性瘧報告病例的類似研究更是匱乏。本研究采用群體遺傳學評價與遺傳關(guān)聯(lián)性研究相結(jié)合的方法，對惡性瘧原蟲不同種群分離株的PfKelch13基因分化進行了分析，間接評估了云南省惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的關(guān)聯(lián)程度，為惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性分子監(jiān)測標志提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 研究對象及血樣采集

1.1.1 云南省瘧疾報告病例血樣來源

實驗所采用的病例血樣來源于2013年1月—2015年12月，經(jīng)云南全省衛(wèi)生醫(yī)療機構(gòu)參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準——瘧疾診斷標準(WS259—2006)》[20]和經(jīng)基因檢測方法[21]確診，屬于“中國疾病預防控制信息系統(tǒng)”登記管理的惡性瘧疾報告病例，采其0.6 mL靜脈血制作濾紙血膜，采集范圍見圖1。通過流行病學調(diào)查判定其感染來源地，瘧疾發(fā)作潛伏期之前無云南省外流動史者為云南本地病例，有緬甸、非洲國家流動史者為緬甸、非洲感染病例。

1.1.2 緬甸境內(nèi)病例血樣來源

實驗所采用的病例血樣來源于2009年1月—2012年12月，經(jīng)顯微鏡檢查和基因檢測確診，且長期定居緬甸拉咱及周邊的緬籍惡性瘧現(xiàn)癥病例，采其靜脈血0.6 mL制作濾紙血膜，采集范圍見圖1。

圖1 本研究惡性瘧現(xiàn)癥病例血樣采集范圍

Fig 1 The range of blood sample collection ofPlasmodiumfalciparumin this study

注：“”為云南疫情病例血樣采集中心；“”為緬甸境內(nèi)血樣采集中心；“”為地州、縣政府駐地

1.2 青蒿素敏感性體內(nèi)試驗

緬甸境內(nèi)病例血樣年齡為2～60歲，2周內(nèi)無抗瘧藥或/和抗菌藥服藥史者同時接受青蒿琥酯耐藥性體內(nèi)測試。藥物及治療方案參考文獻[22]，療效評價采用參考文獻[23]，以上內(nèi)容均獲得病人知情和簽字認可。

2 方法

2.1 瘧原蟲DNA提取

參照試劑盒說明書提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 巢式PCR擴增瘧原蟲PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域

參照文獻[8，24-25]的引物和條件擴增PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域，目的基因片段749～850 bp[26]。

2.3 PfKelch13基因序列多態(tài)性及突變位點進化分析

測序結(jié)果在DNAStar Lasergene 7.1拼接或轉(zhuǎn)換后經(jīng)NCBI BLAST與惡性瘧原蟲PfKelch13基因參比序列(ID：PF3D7-1343700)進行比對，比對正常的DNA序列在MEGA5.04軟件進行氨基酸轉(zhuǎn)換和文件格式調(diào)整。用Clustal X2.1軟件多重比對DNA序列，確認錯義突變和同義突變。PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域446、578、556、676、458、574、16、469、449、566、538、481、483、492和76等15個等位基因位點的野生型基因為“F446A578E556A676N458P574S16C469G449V566G538A481F483L492Y76”。用Arlequin 3.01軟件分析基因片段單倍型及期望雜合度(He)、基因多態(tài)系數(shù)(H)和群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)等，F(xiàn)st采用分子方差分析法(AMOVA)計算，檢驗水平為α=0.05。

2.4 統(tǒng)計分析

采用Epi Data 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，在IBM?SPSS?21軟件進行統(tǒng)計分析，對PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變型構(gòu)成比進行χ2檢驗，檢驗水平為α=0.05，并計算惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變型與青蒿素治療失敗的比值比(OR)及其95%CI。

3 結(jié)果

3.1 樣本信息及PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴增

云南省惡性瘧疾報告病例血樣202份，其中192份PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴增陽性，測序成功190例。緬甸境內(nèi)惡性瘧病例血樣382份， 289份PCR擴增陽性，測序成功194例，其中，包括60例接受青蒿琥酯療效評價病例血樣的53條序列，樣本使用流程如圖2。

惡性瘧原蟲分離株的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴增產(chǎn)物如圖3，在750 bp處可見電泳條帶。

圖2 本研究惡性瘧現(xiàn)癥病例的血樣使用流程圖

圖3 惡性瘧現(xiàn)癥病例血樣PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域巢式PCR擴增電泳圖

M：DNA標志物；1：惡性瘧原蟲陽性對照；2：間日瘧原蟲陽性對照；3：第1輪PCR陰性對照；4：第2輪PCR陰性對照；5:陰性樣本；6～13：陽性樣本

3.2 PfKelch13基因突變型分析

190例測序成功的云南省瘧疾報告病例DNA序列中，66例序列檢出10種氨基酸突變型,均為單位點錯義突變，突變率 34.7%(66/190)，10種氨基酸突變型為F446I、A578S、N458Y、P574L、A676D、G449A、C469Y、V566I、E556D和S16L，各型突變所占比如圖4。

圖4 云南省和緬甸兩地感染惡性瘧原蟲PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域氨基酸編碼突變類型及比例(n=16)

“Δ”：云南分離株構(gòu)成比；“*”：緬甸分離株構(gòu)成比

測序成功的194例緬甸境內(nèi)病例DNA序列中，114例序列檢出12種氨基酸突變型，均為錯義突變，突變率為58.8%(114/194)，且每例序列均為單一突變。12種突變型為F446I、P574L、C469Y、A676D、A481V、E556D、N458Y、F483S、L492S、G538V、G449A和Y76K，各型突變所占比例如圖4。

3.3 PfKelch13基因突變及單倍型分析

測序成功的云南省病例血樣的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域DNA序列共有13種單倍型，He、H分別為0.0481和0.5183，緬甸境內(nèi)病例血樣的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域DNA序列共有19種單倍型，He、H分別為0.0440和0.6510。兩地惡性瘧原蟲種群間的Fst=0.0410(P<0.05)(見表1)。來自群體內(nèi)的變異占95.90%，群體間變異比例占4.10%，群體內(nèi)遺傳變異大于群體間遺傳變異。

表1 云南及緬甸境內(nèi)惡性瘧病例分離株P(guān)fKelch13基因 kelch結(jié)構(gòu)域的等位多態(tài)性分析

“※”：百分數(shù); “Δ”:1 組與2組配對分析; “*”:P<0.05

3.4 PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域位點突變與青蒿素耐藥性關(guān)聯(lián)程度分析

60例緬甸境內(nèi)病例接受青蒿琥酯療效評價，其中49例完成全程隨訪。完成全程隨訪病例中，28例病例血樣檢出PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)存在5種位點突變，突變率為57.1%(28/49)，突變型為F446I 、C469Y 、A676D 、N458Y 和P574L，所占比例分別為46.9%(23/49)、4.1%(2/49)、2.0%(1/49)、2.0%(1/49)和2.0%(1/49)。

緬甸境內(nèi)惡性瘧病例青蒿琥酯治療失敗與PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變位點間的關(guān)聯(lián)程度分析如表2。

表2 緬甸境內(nèi)病例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變位點與青蒿素耐藥性關(guān)聯(lián)程度分析

4 討論

本研究中，盡管云南報告病倒惡性瘧原蟲種群與緬甸境內(nèi)病例惡性瘧原蟲種群PfKelch13基因的位點突變類型、單倍型種類及其數(shù)量均存在不同(表1)，但兩種群間的遺傳分化系數(shù)較小(Fst=0.0410，P<0.05)，且群體內(nèi)變異貢獻率占95.9%，群體間變異貢獻率只占4.1%，故可認為云南及緬甸境內(nèi)惡性瘧疾病例種群具有相似的遺傳背景，因而以緬甸境內(nèi)病例蟲株求得的PfKelch13基因突變對青蒿素耐藥性的風險程度(表2)，可以用于評估云南瘧疾報告病例PfKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的關(guān)聯(lián)性，即感染PfKelch13基因F446I突變型或感染所有突變型位點的惡性瘧蟲株病例，其青蒿素治療無效的風險是感染PfKelch13基因野生型惡性瘧原蟲的1.640倍(95%CI：1.284～2.095)和1.840倍( 95%CI：1.412～2.398)，其中，單一F446I突變型位點是PfKelch13基因的主導型突變(圖4)，與Tun等[14]、Wang等[18]、Huang等[19]和Ye等[27]的研究結(jié)果一致。雖然本研究中的關(guān)聯(lián)性評價并不能完全揭示基因突變與耐藥性產(chǎn)生的因果關(guān)系，但仍提示PfKelch13基因多態(tài)性突變位點特別是F446I突變位點可以作為云南地區(qū)的惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性分子水平的監(jiān)測標志。

本研究的局限性也不容忽視。首先，我們進行遺傳關(guān)聯(lián)性研究的樣本量仍不足夠大，PfKelch13基因突變的危險程度如何，需進一步進行論證；其次，本研究中接受表型測試的對象為緬甸境內(nèi)的外國人種，與云南本地瘧疾報告病例之間可能存在遺傳異質(zhì)性，加之本實驗中的表型研究地區(qū)——緬甸拉咱仍為瘧疾高度流行區(qū)，因此，不同惡性瘧流行區(qū)使用本研究所獲得的微觀評價指標時須謹慎理解。下一步除需擴大同質(zhì)研究樣本量外，可適當開展相關(guān)的系統(tǒng)分析研究，以期高效揭示PfKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的遺傳關(guān)聯(lián)性。

致謝：感謝云南省德宏、保山、昆明、普洱、臨滄、大理、怒江、麗江、西雙版納、玉溪、楚雄、紅河、昭通、迪慶、曲靖、文山16個州/市級及其轄區(qū)內(nèi)各縣級疾病預防控制中心的傾力支持。

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