羅 芬,黃偉卿,2,李進(jìn)壽,阮少江,林 婕,阮俊峰,周逢芳

( 1.寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠(chéng)水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352100 )

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為我國(guó)特有的中下層暖溫性近海集群洄游魚類，主要分布于南海、東海和黃海南部，原為我國(guó)海洋四大主要捕撈對(duì)象之首[1-2]。經(jīng)過30多年的養(yǎng)殖發(fā)展，至2015年全國(guó)大黃魚產(chǎn)量達(dá)1.48×105t，年產(chǎn)值約120多億元，成為我國(guó)最大規(guī)模的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類和八大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一[3]。大黃魚養(yǎng)殖快速發(fā)展的同時(shí)，累代近親繁殖導(dǎo)致生長(zhǎng)性能、形態(tài)特征、抗逆性能降低等[4-6]。對(duì)大黃魚群體進(jìn)行遺傳性狀改良和良種選育具有現(xiàn)實(shí)意義，而海捕野生大黃魚群體在遺傳特性、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、抗逆性能等方面均優(yōu)于養(yǎng)殖大黃魚群體[7-10]。但海捕野生大黃魚成活率低，直接作為或培育至親本用于種質(zhì)改良難度大，因此有效保存海捕野生大黃魚的精液對(duì)保護(hù)和改良大黃魚種質(zhì)資源具有重要意義。

Gardiner[11]認(rèn)為，魚類精子具有三羧酸循環(huán)代謝能力。嚴(yán)安生等[12]指出，單糖在精漿中的主要作用是維持精子運(yùn)動(dòng)。谷巍[13]發(fā)現(xiàn)，高白鮭(Coregonuspeled)精子在葡萄糖或果糖溶液中激活效果較好。迄今為止，有關(guān)糖類對(duì)大黃魚精子活力的影響研究較少，僅朱東發(fā)[14]報(bào)道過葡萄糖等環(huán)境因子對(duì)養(yǎng)殖大黃魚精子的激活率和活動(dòng)時(shí)間的影響，張藝等[15]在稀釋液中添加0.005 mol/L葡萄糖保存精子；而在果糖中保存精子的研究未見報(bào)道。魚類精子活力是人工授精稀釋液的配制及精子低溫、超低溫保存的基礎(chǔ)。筆者研究了葡萄糖和果糖劑量對(duì)大黃魚精子活力的影響，旨在補(bǔ)充和豐富大黃魚生殖生物學(xué)資料，為人工繁殖時(shí)精子稀釋液和冷凍保存液的配制和大黃魚種質(zhì)資源改良提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健壯、外表無損傷及病害的體長(zhǎng)26.5～35.4 cm、體質(zhì)量325～520 g的成熟海捕野生大黃魚雄魚7尾，每尾注射劑量為5 μg/kg的促黃體素釋放激素類似物，暫養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集與保存

用干毛巾擦拭魚體，吸干生殖孔周圍及體表的水分，用手輕擠壓腹部?jī)蓚?cè)擠出精液，用干凈的膠頭滴管從生殖孔吸取未受污染的精液，放小培養(yǎng)皿中并加蓋，置冰箱4 ℃保存，定期取少許待檢。經(jīng)顯微鏡檢查精子活力在90%以上者用于試驗(yàn)。

1.2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液的配制

以砂濾海水配制濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 mmol/L的葡萄糖溶液和果糖溶液。

1.2.3 精子活力的觀察

采用平板載玻片法。調(diào)好10×40倍的顯微鏡焦距，滴一滴試驗(yàn)液于干燥潔凈的載玻片上，用消毒的解剖針蘸取少許精液均勻涂于試驗(yàn)液中，精液與試驗(yàn)液接觸的瞬間立即啟動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，觀察記錄精子活動(dòng)情況[16]。以1個(gè)視野為準(zhǔn)，每個(gè)樣品重復(fù)3～5次。

精子在水中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)分為激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)和搖尾運(yùn)動(dòng)3個(gè)連續(xù)階段，這3個(gè)階段時(shí)間的總和為總運(yùn)動(dòng)時(shí)間，即精子的壽命。各階段的具體劃分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件處理，用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖和果糖溶液劑量對(duì)海捕野生大黃魚精子活力的影響

葡萄糖濃度為0、100、900 mmol/L時(shí)，大黃魚精子不運(yùn)動(dòng)；200～800 mmol/L時(shí)，精子被激活；200～500 mmol/L時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)、平均壽命隨濃度升高而延長(zhǎng)；500 mmol/L時(shí)激烈運(yùn)動(dòng)和平均壽命達(dá)最大值，分別為(172.11±7.60) s和(654.44±36.95) s；超過500 mmol/L則隨濃度升高逐漸縮短；500 mmol/L葡萄糖溶液對(duì)大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)的影響顯著高于其他濃度(P<0.05)；500 mmol/L與600 mmol/L間的平均壽命差異不顯著(P>0.05)(表1)。

果糖濃度在0、100、800、900 mmol/L大黃魚時(shí)，精子不運(yùn)動(dòng)；200～700 mmol/L時(shí)，精子被激活并運(yùn)動(dòng)；200～600 mmol/L時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)和平均壽命隨濃度升高而延長(zhǎng)；600 mmol/L時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)和平均壽命達(dá)最大值，分別為(160.78±8.80)s和(599.56±21.13) s；超過600 mmol/L時(shí)，隨濃度升高明顯縮短；600 mmol/L果糖溶液對(duì)大黃魚精子活力的影響顯著高于其他濃度(P<0.05)(表2)。

表1 葡萄糖溶液濃度對(duì)海捕野生大黃魚精子活力的影響 s

注：同列中帶不同上標(biāo)字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

表2 果糖溶液濃度對(duì)海捕野生大黃魚精子活力的影響 s

2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液與海捕野生大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的關(guān)系

大黃魚精子在0～200 mmol/L葡萄糖溶液中無激烈運(yùn)動(dòng)，數(shù)學(xué)模型為y=0(0 mmol/L

果糖濃度在0～100 mmol/L和800～900 mmol/L時(shí)精子無激烈運(yùn)動(dòng)，數(shù)學(xué)模型y=0(0 mmol/L

葡萄糖和果糖溶液對(duì)大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)影響的比較表明，最適葡萄糖溶液對(duì)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)的效果明顯優(yōu)于最適果糖溶液濃度(圖1)。

2.3 葡萄糖溶液和果糖溶液與海捕野生大黃魚精子壽命的關(guān)系

0～100 mmol/L葡萄糖溶液中精子不運(yùn)動(dòng)，擬合的精子壽命數(shù)學(xué)模型y=0(0 mmol/L

圖1 葡萄糖和果糖溶液對(duì)海捕野生大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

0～100 mmol/L和800～900 mmol/L果糖溶液中精子不運(yùn)動(dòng)，數(shù)學(xué)模型為y=0(0 mmol/L

圖2 葡萄糖和果糖溶液對(duì)海捕野生大黃魚精子壽命的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，果糖溶液在濃度較高時(shí)表現(xiàn)出較好的延長(zhǎng)精子壽命的作用，而葡萄糖溶液在相對(duì)較低濃度時(shí)就表現(xiàn)出了較好的延長(zhǎng)效果，且葡萄糖溶液對(duì)大黃魚精子壽命的影響普遍明顯高于果糖(圖2)。

3 討 論

精、卵質(zhì)量與活力決定著人工繁育中的受精率，延長(zhǎng)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間可提高受精率，也是考察魚類人工繁育中精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。體外受精魚類中，精子在精巢或精漿中沒有活力，只有排到水環(huán)境中才被激活，其活力受pH、溫度、鹽度、離子、糖類等因素影響[13]。如果精子在最適條件下被激活，將顯著提高受精率，有助人工繁育的順利進(jìn)行，保證魚類胚胎的質(zhì)量，對(duì)種質(zhì)資源的改良亦具積極的促進(jìn)意義。

魚類精子發(fā)生過程中形成的能量物質(zhì)很少，體外精、卵相遇時(shí)精子入水耗費(fèi)了大量能量以調(diào)節(jié)滲透壓平衡，可用于維持運(yùn)動(dòng)的能量甚少，因此精子被激活后運(yùn)動(dòng)時(shí)間十分短暫。有研究表明，適當(dāng)濃度的糖類可提高鯉魚(Cyprinuscarpio)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、高白鮭、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)、白斑狗魚(Esoxlucius)、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)等魚類精子活力[12-13,18-20]。本試驗(yàn)中，適當(dāng)濃度的葡萄糖或果糖溶液可激活大黃魚精子，并延長(zhǎng)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，即對(duì)大黃魚精子運(yùn)動(dòng)具明顯促進(jìn)作用，與上述研究結(jié)果相似。其原因是葡萄糖、果糖、半乳糖等是魚類精漿的重要組成成分，參與精子代謝，維持精子活力[12]。Gardiner[11]認(rèn)為，魚類的精子是具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，通過氧化葡萄糖、果糖等外源性碳水化合物得到能量補(bǔ)償，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖這三種單糖是精子活動(dòng)及存活可選擇的能源[21]。單糖物質(zhì)有效地延長(zhǎng)了精子活動(dòng)時(shí)間，精卵有更多接觸機(jī)會(huì)，勢(shì)必大大提高人工授精的受精率。朱冬發(fā)[14]報(bào)道，葡萄糖溶液影響?zhàn)B殖大黃魚精子的活動(dòng)時(shí)間，筆者關(guān)注不同濃度葡萄糖溶液對(duì)精子激烈運(yùn)動(dòng)和壽命的影響，因?yàn)檠娱L(zhǎng)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)受精過程中精卵的結(jié)合更具有實(shí)際意義。通過建模進(jìn)一步求出最適葡萄糖濃度：527 mmol/L葡萄糖溶液中大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)；559 mmol/L葡萄糖溶液中大黃魚精子壽命最長(zhǎng)；超過該濃度精子活力逐漸下降，這可能與濃度升高導(dǎo)致了外界溶液滲透壓過高，在運(yùn)動(dòng)過程中需要消耗能量調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān)。故建議人工授精時(shí)選擇527～559 mmol/L葡萄糖溶液作為激活的稀釋液，以提高大黃魚精子活力，保持激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延長(zhǎng)壽命，提高受精率。0～100 mmol/L和大于900 mmol/L精子無運(yùn)動(dòng)，因此這兩個(gè)范圍的葡萄糖溶液可作為大黃魚精子保存液的參考值。

糖類作為外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)魚類精子活力的影響多見于葡萄糖[11-15,18-21]，果糖的研究較少。谷巍等[13]關(guān)注了果糖對(duì)高白鮭精子活力影響；萬全等[19]比較了葡萄糖、果糖等5種糖類對(duì)大鱗副泥鰍精子的保存效果，認(rèn)為不同糖類保存精子的效果不同，保存效果由高到低依次是：葡萄糖>蔗糖>L-山梨糖>D-果糖>D-木糖。本試驗(yàn)首次關(guān)注果糖溶液對(duì)大黃魚精子活力的影響，且通過數(shù)學(xué)建模求出最適果糖濃度為614 mmol/L，大黃魚精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)；597 mmol/L果糖液大黃魚精子的壽命最長(zhǎng)。由此建議人工授精時(shí)可選擇濃度為597～614 mmol/L的果糖溶液作為激活的稀釋液，以延長(zhǎng)精子壽命，保持精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高受精率。果糖濃度在0～100 mmol/L和800 mmol/L之后時(shí)，精子無運(yùn)動(dòng)能力，這兩個(gè)濃度可作為大黃魚精子保存液的參考值。

雖然果糖和葡萄糖都是單糖，但對(duì)海捕野生大黃魚精子活力的影響并不完全相同，這與兩種單糖溶液的理化性質(zhì)緊密相關(guān)。最適葡萄糖溶液比最適果糖溶液對(duì)延長(zhǎng)大黃魚精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命的效果更好，因此，葡萄糖較果糖更適宜作為海捕野生大黃魚精子的激活液。而大黃魚精子對(duì)這兩種單糖吸收和利用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝

寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司提供試驗(yàn)魚，在此表示衷心感謝！

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