許明珠，童 潼，張 琴，董蘭芳，蔣 艷，楊家林

( 廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000 )

方格星蟲(chóng)(Sipunculusnudus)為北部灣特色經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)品和近年來(lái)重點(diǎn)發(fā)展增養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,它生長(zhǎng)快、病害少、活動(dòng)范圍小，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，養(yǎng)殖面積和市場(chǎng)需求量逐年增大[7]。因此，研究有效促進(jìn)方格星蟲(chóng)生長(zhǎng)、適宜人工養(yǎng)殖的飼料，以提高方格星蟲(chóng)產(chǎn)量來(lái)滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求十分重要。目前有關(guān)方格星蟲(chóng)對(duì)飼料脂肪、蛋白、糖、硒、鐵和錳的需求已有研究[8-13]，而對(duì)飼料銅的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了由同一批受精卵孵出、規(guī)格相同、體質(zhì)健康的方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)攝食含蛋氨酸銅飼料的質(zhì)量日增加、組織銅含量和消化酶活性，研究了微量元素銅對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響，為研發(fā)規(guī)?；B(yǎng)殖方格星蟲(chóng)人工配合飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

蛋氨酸銅含銅量17%，由濰坊康科潤(rùn)生物技術(shù)有限公司友情提供，于基礎(chǔ)飼料中分別添加蛋氨酸銅0、4、8、16、32 mg/kg和64 mg/kg(表1)，制成6種試驗(yàn)飼料。經(jīng)GB 13885—2003方法測(cè)定，飼料(以干物質(zhì)計(jì)算)中銅的實(shí)際含量分別為2.7、7.5、11.2、19.8、30.4 mg/kg和52.1mg/kg。飼料制作參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，制成150目微顆粒飼料，標(biāo)號(hào)裝袋備用。

表1 試驗(yàn)飼料基礎(chǔ)配方及營(yíng)養(yǎng)成分分析(干物質(zhì))

注：1.每千克飼料維生素混合物提供：VD2400 IU，VE100 mg，VK1 mg，VC70 mg，VB10.5 mg，VB27 mg，VB66 mg，VB121 mg，D-泛酸32.6 mg，煙酸28 mg，生物素1 mg，葉酸7.5 mg，肌醇440 mg.2.每千克飼料礦物質(zhì)預(yù)混料提供：CaCO33000 mg，ZnSO4·7H2O 300 mg，CaH2PO44125 mg，MnSO4·H2O 270 mg，NaCl 1200 mg，Na2SeO3·H2O 0.75 mg，KCl 750 mg，MgSO4·7H2O 1525.5 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 750 mg，AlSO4·6H2O 6 mg，CoCl2·6H2O 45 mg，KI 6 mg，沸石粉3021.75 mg.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于2013年8月至9月在廣西海洋研究所海水增養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)用稚蟲(chóng)取自廣西海洋研究所培育的同批人工孵化苗種。正式試驗(yàn)前，先給試驗(yàn)稚蟲(chóng)投喂基礎(chǔ)飼料14 d，使之逐漸適應(yīng)試驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。馴養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選出健康無(wú)病、活力較強(qiáng)、體質(zhì)量相近[(18.46±0.11) mg]的稚星蟲(chóng)7200條，飼養(yǎng)于18個(gè)底層鋪有約10 cm細(xì)沙的65 cm×55 cm×45 cm水槽中，每個(gè)水槽放養(yǎng)400條稚星蟲(chóng)。本試驗(yàn)采用自然光照，自然水溫(26～30 ℃)，二級(jí)過(guò)濾海水(鹽度 18～22)，24 h連續(xù)微充氧(溶解氧>5.0 mg/L)，日換水兩次(9:00和17:00)，換水后過(guò)量投喂，保證沙子表面有少量未食用完全的餌料。養(yǎng)殖過(guò)程中每日巡視兩次，及時(shí)清除和記錄死亡的個(gè)體。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

養(yǎng)殖結(jié)束后，將停食吐沙2 d的各組方格星蟲(chóng)收集，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

平均終末體質(zhì)量/mg=m/n

質(zhì)量日增加/mg·d-1=(mt-m0)/t

式中，m和n分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)水族箱中稚蟲(chóng)的總體質(zhì)量(mg)和總數(shù)量(條)，m0和mt分別為星稚蟲(chóng)平均初始體質(zhì)量(mg)和平均終末體質(zhì)量(mg)，t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

飼料、蟲(chóng)體、體壁(解剖剪剪開(kāi)后去除內(nèi)臟和體腔液所得)均采用GB 13885—2003方法進(jìn)行測(cè)定。將樣品于550 ℃馬福爐中灰化，用濃鹽酸溶解殘?jiān)⑾♂尪ㄈ?，然后?dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)(4510F，上海儀電分析)的空氣—乙炔火焰中，測(cè)定銅元素的吸光度，并與元素校正溶液的吸光度比較定量。體腔液中銅含量采用化學(xué)法測(cè)定，試驗(yàn)原理為：在pH=9的氨溶液中，銅離子與二乙基二硫代氨基甲酸鈉作用，生成摩爾比為1∶2的黃棕色膠體配合物，在452 nm處測(cè)定吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量銅離子的含量。

消化酶的活性的測(cè)定方法：參照南京建成生物工程研究所試劑盒的組織勻漿方法，將稚星蟲(chóng)整體勻漿進(jìn)行酶液制備。蛋白酶活性采用Folin-酚法；脂肪酶活性和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液蛋白含量。酶活力用比活力(U/mg)表示。

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，若差異達(dá)到顯著，則進(jìn)行Tukey′s多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 方格星蟲(chóng)攝食含不同銅水平飼料時(shí)的質(zhì)量日增加

不同銅水平顯著影響方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的終末體質(zhì)量和質(zhì)量日增加(P<0.05)，銅含量為11.2 mg/kg時(shí)終末體質(zhì)量和質(zhì)量日增加最高(0.68±0.02)mg/d，顯著高于銅含量為2.7、19.8、30.4 mg/kg的試驗(yàn)組(P<0.05)，但與銅含量為7.5、52.1 mg/kg的試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05)(表2)。銅含量最低(2.7 mg/kg)的試驗(yàn)組稚蟲(chóng)的質(zhì)量日增加顯著低于其余各組(P<0.05)。

2.2 方格星蟲(chóng)攝食含不同銅水平飼料時(shí)組織的銅含量

飼料銅水平均顯著影響方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體中體壁銅含量和蟲(chóng)體銅含量(P<0.05)(表3)。稚星蟲(chóng)的體壁銅含量和蟲(chóng)體銅含量均隨著飼料中銅含量的提高而升高。當(dāng)飼料銅含量為52.1 mg/kg時(shí)，稚星蟲(chóng)的體壁銅含量和蟲(chóng)體銅含量均達(dá)到最大值，且其體壁銅含量顯著高于較低(2.7 mg/kg)銅含量組(P<0.05)；蟲(chóng)體銅含量顯著高于2.7、7.5 mg/kg和11.2 mg/kg銅含量組。各處理組稚蟲(chóng)體腔液銅含量為2.32～4.53 μg/g，組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 方格星蟲(chóng)攝食含不同銅水平的飼料時(shí)的質(zhì)量日增加(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

表3 飼料銅水平對(duì)方格星蟲(chóng)稚星蟲(chóng)組織銅的影響(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差) μg/g

統(tǒng)計(jì)分析表明，體壁銅含量(y)與飼料銅含量(x)的回歸方程為(圖1)：

y=0.8431ln(x)+0.683(r2=0.9351)

體腔液銅含量y1與飼料銅含量x1(2.7、7.5、11.2、19.8 mg/kg)的線(xiàn)性回歸方程為(圖2)：

y1=0.1094x1+2.1031(r12=0.9138)

體腔液銅含量y2與飼料銅含量x2(19.8、30.4、52.1 mg/kg)的線(xiàn)性回歸方程為(圖2)：

y2=0.0118x2+3.935(r22=0.9371)

由圖2可知，當(dāng)飼料銅含量(x)小于18.69 mg/kg時(shí)，體腔液銅含量(y)符合y1方程式；當(dāng)飼料銅含量(x)大于18.69 mg/kg時(shí)，體腔液銅含量(y)符合y2方程式。

2.3 方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)攝食含不同銅水平飼料時(shí)消化酶的活性

飼料的銅水平對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均無(wú)顯著影響(P>0.05)(表4)。各處理組稚星蟲(chóng)蛋白酶活性為0.58～0.67 U/mg，淀粉酶活性為0.45～0.58 U/mg，脂肪酶活性為0.45～0.47 U/mg。

圖1 方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體壁銅含量與飼料銅含量的回歸分析

圖2 方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體腔液銅含量與飼料銅含量的回歸分析

3 討 論

3.1 飼料銅水平對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)質(zhì)量日增加的影響

已有研究表明，羅非魚(yú)(Oreochromis)和草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)對(duì)飼料中谷氨酸銅[15]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)對(duì)飼料中蛋氨酸銅[16]的生物利用度大于硫酸銅；凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)對(duì)飼料中各種銅源的生物利用度為蛋氨酸銅>富馬酸銅>硫酸銅>堿式氯化銅[17-18]；而異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)對(duì)飼料中各種銅源的生物利用度則為堿式氯化銅>氨基酸銅絡(luò)合物>硫酸銅[19]。

本試驗(yàn)中，在銅含量為11.2 mg/kg時(shí)，方格星蟲(chóng)的質(zhì)量日增加最大，繼續(xù)增加飼料銅的含量，稚星蟲(chóng)的質(zhì)量日增加下降，然后緩慢上升趨于平穩(wěn)。這與軍曹魚(yú)研究結(jié)果類(lèi)似[23]。究其原因可能是方格星蟲(chóng)沒(méi)有肝臟等器官，解毒能力較弱，銅元素和鋅元素在生物體內(nèi)具有拮抗作用，過(guò)度升高飼料中銅含量會(huì)影響生物對(duì)鋅元素的吸收，因此高含量的飼料銅可能在一定程度上抑制方格星蟲(chóng)的生長(zhǎng)[24-26]。

3.2 飼料銅水平對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體成分組織銅含量的影響

在其他水產(chǎn)動(dòng)物的研究中，飼料中銅含量升高對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝胰臟中銅含量有顯著影響，但對(duì)肌肉中銅含量均無(wú)顯著影響；飼料銅水平為10、30、50 mg/kg時(shí)，硫酸銅和蛋氨酸銅為銅源極顯著影響凡納濱對(duì)蝦肝胰臟的銅含量[27-28]。葉超霞等[29]研究高銅水平飼料的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，高銅水平飼料組的斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)全魚(yú)和肝胰臟中的銅含量顯著高于銅適量組。本研究中，飼料銅含量對(duì)方格星蟲(chóng)體壁銅含量和蟲(chóng)體銅含量有顯著影響，對(duì)體腔液銅含量無(wú)顯著影響，與上述研究結(jié)果略有出入。一般水產(chǎn)動(dòng)物都將體內(nèi)大部分銅儲(chǔ)存于肌肉、骨骼和肝臟等器官組織中，方格星蟲(chóng)屬于低等水生動(dòng)物，體內(nèi)并無(wú)骨骼和肝胰臟，其體內(nèi)銅主要儲(chǔ)存于體壁肌肉細(xì)胞和體腔液中，因此可能造成飼料銅含量的變化對(duì)體壁銅含量以及蟲(chóng)體銅含量影響顯著[30]，但是各試驗(yàn)組體腔液中銅元素含量差異不顯著的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料銅含量變化顯著影響方格星蟲(chóng)的質(zhì)量日增加、體壁銅含量和蟲(chóng)體銅含量(P<0.05)，但各組體腔液銅含量和消化酶活性差異不顯著(P>0.05)。綜合質(zhì)量日增加和飼料成本，建議方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)飼料銅水平為7.5～11.2 mg/kg。

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