梁云飛 張林成 蒲全明 雷鎮(zhèn)澤 施松梅 姜宇鵬 任雪松 高啟國,*

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甘藍轉(zhuǎn)錄因子的克隆與轉(zhuǎn)基因甘藍的表型分析

梁云飛1,**張林成1,**蒲全明2雷鎮(zhèn)澤1施松梅1姜宇鵬1任雪松1高啟國1,*

1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院 / 南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室, 重慶 400716;2南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 四川南充 637000

bHLH轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育、形態(tài)調(diào)控有重要作用, 為了研究基因在甘藍葉片發(fā)育及形態(tài)建成中的調(diào)控功能, 本文以甘藍品種519為材料, 克隆出轉(zhuǎn)錄因子基因。序列分析表明, 該基因含有一個795 bp的開放閱讀框, 編碼264個氨基酸, 具有一個保守的典型bHLH結(jié)構(gòu)域。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將正義基因?qū)敫仕{品種519中以增強表達, 通過PCR篩選出9株T0代轉(zhuǎn)基因單株, 結(jié)合T2代單株的qRT-PCR分析表明, 篩選的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)基因的表達積累量明顯高于野生型。試驗基地隔離網(wǎng)內(nèi)種植的轉(zhuǎn)基因甘藍表型明顯, 主要表現(xiàn)為蓮座期莖葉間距拉長、葉柄伸長以及植株莖和葉柄顯示紫色, 植株葉片平展, 無向上向內(nèi)卷曲趨勢, 表明基因可能對甘藍葉片發(fā)育有重要的調(diào)控作用。

甘藍; BoLH27; 基因克隆; 轉(zhuǎn)基因; 表型

bHLH (basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 1989年Ludwig等[1]首次從玉米中分離出bHLH類蛋白質(zhì)Lc (leaf colour), 證明該基因參與調(diào)控花青素合成。Ling等[2]在番茄中鑒定出bHLH類基因, 發(fā)現(xiàn)該基因調(diào)控番茄適應(yīng)缺鐵脅迫。Kiribuchi等[3]從水稻中分離出bHLH基因類, 發(fā)現(xiàn)該基因通過茉莉酸信號途徑響應(yīng)干旱脅迫。擬南芥基因組中經(jīng)測序鑒定發(fā)現(xiàn)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)超過150個[4-5]。bHLH 結(jié)構(gòu)域約含50~60個氨基酸, 由堿性區(qū)域(basic region)和α螺旋1-環(huán)-α螺旋-2 (helix-loop-helix)組成, 其堿性區(qū)域通常能與基因啟動子區(qū)域的E-Box和G-Box結(jié)合[6-8], 一些關(guān)鍵氨基酸位點通常保守, 13E-16R是結(jié)合下游基因啟動子E-box的2個關(guān)鍵位點[9], Leu23是bHLH功能域形成同源或異源二聚體的關(guān)鍵位點[10]。

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族具有重要的生物學(xué)功能, 參與植物一系列的生命活動, 涉及生長發(fā)育[11-12]、代謝調(diào)控[13-14]以及對非生物脅迫的抗性等[15]。同樣, 具有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在葉片發(fā)育和形態(tài)建成中也有重要調(diào)控作用。()是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 擬南芥中功能缺失的突變體具有較大的子葉, 較長的下胚軸和較大的葉片, 而的過表達則導(dǎo)致較小的子葉和葉片[16]。在擬南芥中利用啟動子超表達表皮細(xì)胞中特異表達的(), 能使植株形成葉片卷曲的表型[17]。金魚草中發(fā)現(xiàn)一種突變體, 能編碼具有bHLH結(jié)構(gòu)域的TCP蛋白,突變體的葉片邊緣區(qū)域過度生長, 逐漸使原本平展的葉片變得卷曲[18]。擬南芥中下調(diào)表達、、、四個基因能導(dǎo)致葉片變皺[19]。在擬南芥中增強表達基因會使植株早熟, 細(xì)胞增殖減慢, 葉片變小[20]。在擬南芥中下調(diào)表達、、三個基因會造成葉片變大, 鄰近的葉片會擴張到葉柄區(qū)域[21]。2013年莫曉婷[22]在玉米中克隆到轉(zhuǎn)錄因子, 在擬南芥中超表達時植株呈現(xiàn)出矮化, 葉片數(shù)量增加, 葉片長寬比變大, 葉片及果莢皺縮。

本課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)掘在甘藍519蓮座期和結(jié)球期差異表達的基因, 從中選出在結(jié)球期上調(diào)表達的基因。本試驗克隆出基因的編碼序列, 進行了序列生物信息學(xué)分析, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)入甘藍519, 令其超量表達, 并初步分析轉(zhuǎn)基因植株表型, 以期為進一步探討基因在甘藍葉片發(fā)育及形態(tài)建成中的調(diào)控功能和作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與載體

中晚熟結(jié)球性好的純合穩(wěn)定品種甘藍519, 由西南大學(xué)十字花科研究所提供, 2013年9月將幼苗種于重慶歇馬試驗基地, 2014年9月將T0代幼苗種植在試驗基地, 轉(zhuǎn)基因甘藍開花后, 單株人工自花授粉留種, 2015年9月種植經(jīng)PCR鑒定的T1代9個株系, 每個株系30個單株, 2016年9月選取3∶1分離的T2代4個株系, 共種40株幼苗。2014年10月選取10株T0代8片葉的幼苗期葉片用于轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定, 2016年10月隨機取3株T2代8葉片幼苗期的葉片(每株3片)用于轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量表達鑒定。

克隆載體pEASY-Blunt Simple購于北京全式金公司。根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株、載體pBL525和植物表達載體pCAMBIA1300為本實驗室保存。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

用植物總RNA提取試劑盒(天根, 北京)提取甘藍幼嫩莖尖總RNA, 通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 之后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA用于基因克隆, 熒光定量取材部位為幼苗期葉片, 方法同上。

1.3 基因的克隆及序列的生物信息學(xué)分析

利用蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/ index.php)和甘藍數(shù)據(jù)庫(http://www.ocri-genomics. org/bolbase/)查找同源序列, 結(jié)合前期課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的包含的片段, 對比數(shù)據(jù)庫, 得知轉(zhuǎn)錄組獲得的片段包含完整的, 根據(jù)序列的保守性運用Primer premier 6.0軟件設(shè)計特異性擴增引物, 采用高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase (寶生物工程(大連)有限公司)從cDNA中擴增基因, 基因擴增所用引物klBoLH27見表1。PCR程序為98°C預(yù)變性1 min; 98°C變性20 s, 63°C退火15 s, 72°C延伸60 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min。將目的片段與克隆載體pEASY連接(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 挑取陽性單克隆委托成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

用EditSeq軟件推導(dǎo)基因編碼的氨基酸序列, 運用ExPASy (http://expasy.org/tools/)分析氨基酸的基本理化性質(zhì), 用在線網(wǎng)站Swiss-model (http:// swissmodel.expasy.org/)、SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)、PROSITE (http://www.expasy.org/ prosite)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、功能位點和保守結(jié)構(gòu)域。在線預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)和信號肽(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/), 用在線網(wǎng)站W(wǎng)OLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。用ClustalX軟件進行多序列比對分析, MEGA6.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 植物表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍遺傳轉(zhuǎn)化

將酶切位點H I引入引物, 載體構(gòu)建所用引物pcBoLH27見表1。用帶有H I酶切位點的引物擴增, 采用高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase (寶生物工程(大連)有限公司)。PCR程序為98°C預(yù)變性1 min; 98°C變性20 s, 62°C退火15 s, 72°C延伸60 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min。將全長用H I單酶切, 連接載體pBL525同時用H I單酶切, 把連接到載體pBL525上, 轉(zhuǎn)化DH5α后保存PCR檢測正向插入的菌液, 提取質(zhì)粒后用d III和R I雙酶切, 同樣用d III和R I雙酶切植物表達載體pCAMBIA1300, 連接后轉(zhuǎn)化DH5α, 雙酶切驗證后送公司測序進一步驗證, 將構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pC35S-。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化方法, 利用根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染甘藍下胚軸。組培所用培養(yǎng)基參考何紹敏等[23]并做了修改, 甘藍預(yù)培養(yǎng)基含MS+3 mg L–16-BA+0.25 mg L–1NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂; 甘藍篩選培養(yǎng)基含MS+3 mg L–16-BA+0.25 mg L–1NAA+5 mg L–1PPT+500 mg L–1Carb+3%蔗糖+0.8%瓊脂; 甘藍生根培養(yǎng)基含MS+0.25 mg L–1NAA+5 mg L–1PPT+500 mg L–1Carb+3%蔗糖+0.8%瓊脂。篩選抗性植株在育苗室內(nèi)培養(yǎng)成活后轉(zhuǎn)入室外培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)基因甘藍的PCR檢測及熒光定量PCR檢測

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因甘藍葉片總DNA。采用Master Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司)進行PCR檢測, 委托成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司對PCR產(chǎn)物測序。取3株T2代8葉片幼苗期的超表達轉(zhuǎn)基因植株葉片(每株3片葉作為生物學(xué)重復(fù)) 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 參照SYBRPremix ExII (寶生物工程(大連)有限公司)試劑盒說明書進行熒光定量PCR, 配制20 μL反應(yīng)體系, 在熒光定量PCR儀CFX96 (Bio-Rad, 美國)上進行, 反應(yīng)體系為1.6 μL cDNA模板, 10 μL SYBR Premix, 0.8 μL正向引物, 0.8 μL反向引物(表1中的qBoLH27), 加ddH2O至總體積20 μL。定量PCR條件為95°C預(yù)變性30 s; 95°C變性5 s, 58°C退火30 s, 40個循環(huán)。以上反應(yīng)每個樣品的技術(shù)重復(fù)3組。采用非轉(zhuǎn)基因甘藍519作為參照比對超表達植株的基因表達情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因甘藍的主莖葉間距的測量

隨機取T2代生長健壯的3個株系每株系3株24片葉的蓮座期超表達轉(zhuǎn)基因甘藍, 從根部向上數(shù)第16片葉的葉柄處開始計數(shù), 向上連續(xù)測量5片葉的葉柄長度, 測量這5片葉在主莖的葉柄著生點的間距, 并以同樣物候期的未轉(zhuǎn)化甘藍519為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoLH27基因的序列分析

以甘藍結(jié)球期莖尖cDNA為模板, PCR擴增出約800 bp條帶。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)該cDNA序列長度為795 bp, 包含一個完整的編碼框, 將其命名為。推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1, 分子量為3.0 kDa, 理論等電點為4.82, 編碼264個氨基酸。不穩(wěn)定系數(shù)為57.47, 推測為不穩(wěn)定蛋白, 親水性為–0.583, 是親水性蛋白。其二級結(jié)構(gòu)由27.65%的α-螺旋、12.88%的β-折疊和59.47%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明BoLH27為非跨膜蛋白, SignalP信號肽預(yù)測顯示該蛋白不含信號肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞核。

表1 試驗使用的引物

下畫線為酶切位點。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.

圖1 甘藍BoLH27 cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列

黑色陰影示bHLH結(jié)構(gòu)域; 實線框示N-糖基化位點; 虛線框示cAMP磷酸位點; 下畫線示蛋白激酶C磷酸化位點; 波浪線示酪蛋白II磷酸化位點; 橢圓框示N-豆蔻?；稽c。

The black shadow shows bHLH domain; the full line box shows N-glycosylation site; the dotted line box shows cAMP phosphorylation site; the underline shows cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; the wavy line shows casein kinase II phosphorylation site; the oval box shows N-glycosylation site.

通過結(jié)構(gòu)域和功能位點分析發(fā)現(xiàn), BoLH27在50~99氨基酸處有一個典型bHLH結(jié)構(gòu)域, 多序列比對發(fā)現(xiàn), BoLH27所含的bHLH結(jié)構(gòu)域具有保守的氨基酸位點(圖2), 分別是13E-16R和Leu23, 13E-16R是結(jié)合下游基因啟動子E-box的2個關(guān)鍵位點[9], Leu23是bHLH功能域形成二聚體的關(guān)鍵位點[10]收集其他物種BoLH27的同源序列, 通過ClustalX軟件進行多序列比對后, 運用Mega6.0進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建, 從圖3可見BoLH27與白菜、蘿卜、遏藍菜bHLH27聚為一類; 醉蝶花、亞麻薺、白菜bHLH35聚為一類。與甘藍BoLH27親緣關(guān)系近的白菜、蘿卜、遏藍菜均為十字花科植物, 同科植物蛋白同源性較高, 基因很保守, 其中與白菜bHLH27親緣關(guān)系最近, 推測其蛋白質(zhì)有相似的功能。

圖2 BoLH27及其同源序列bHLH結(jié)構(gòu)域比對分析

星號表示bHLH結(jié)構(gòu)域保守的氨基酸位點; 三角表示參與二聚體形成的位點。

Stars indicate the conserved amino acids of bHLH domain; triangle indicates amino acid involved in dimer formation.

圖3 BoLH27及其同源氨基酸序列進化分析

2.2 轉(zhuǎn)基因甘藍的PCR檢測和熒光定量PCR檢測

甘藍下胚軸在篩選培養(yǎng)基上經(jīng)過3~4周的培養(yǎng)后, 少量獲得抗性的下胚軸可以存活, 在切口脫分化形成愈傷組織, 將長出不定芽的材料(圖4-A)多次轉(zhuǎn)到新鮮的篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng), 直至不定芽長至3 cm時, 切下不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng), 4~5周后長出白色的根(圖4-B, C)。在育苗室內(nèi)煉苗4~7 d后轉(zhuǎn)入試驗基地隔離網(wǎng)內(nèi)栽種(圖4-D)。

圖4 pC35S-BoLH27轉(zhuǎn)基因植株的獲得

A: 抗性芽的生長; B、C: 抗性苗生根; D: 抗性植株幼苗。

A: the growth of resistant bud; B, C: the rooting of resistant seedling; D: the seedling of transgenic cabbage.

通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法共獲得34株抗性植株, 在生長到8片葉的幼苗期時隨機取10株植株, 以葉片為材料提取基因組DNA, 之后以基因組DNA為模板進行PCR檢測, 以構(gòu)建成功的正義載體作為陽性對照, 非轉(zhuǎn)基因519甘藍為陰性對照, 野生型中沒有下游檢測引物的序列, 所以擴增不到產(chǎn)物。圖5表明, 10株抗性甘藍植株中的9株擴增到了預(yù)期的約1000 bp的條帶, 只有10號和陰性對照沒有檢測到, 把PCR產(chǎn)物送擎科公司測序, 結(jié)果顯示擴增序列與和基因片段序列完全一致, 說明植物表達載體已成功整合到轉(zhuǎn)基因植株1~9號中。隨后我們對目標(biāo)基因的表達情況進行了熒光定量PCR檢測, 從已經(jīng)鑒定的成功轉(zhuǎn)基因植株的T2代植株中隨機選取3株在8片葉的幼苗期葉片進行熒光定量, 從圖6看出, 3株超表達植株的基因相對表達量均高于野生型, 最高為2.5倍, 平均為2.07倍。

2.3 T2代轉(zhuǎn)基因甘藍表型分析

在10片葉幼苗期野生型甘藍519的葉片呈卵圓形, 葉柄較短, 葉柄及葉脈均為白色, 基本沒有葉耳(圖7-A: WT);超表達甘藍的葉片呈橢圓形, 但具有缺刻, 葉柄明顯拉長, 顯示輕微的紫色, 葉柄上著生的葉耳明顯, 葉耳多數(shù)左右對稱分布(圖7-A: BoLH27)。在24片葉蓮座期野生型甘藍519的葉片呈圓形, 葉片寬大, 葉柄急劇短縮, 幾乎無葉柄, 葉脈為白色, 無葉耳(圖7-C: WT); 轉(zhuǎn)基因甘藍的葉片呈橢圓形, 相比野生型更狹長, 葉柄伸長, 葉柄平均長15.5 cm (表2), 葉柄及葉脈明顯變紫, 葉柄基部有葉耳及贅生物,葉片平展(圖7-C: BoLH27);主莖呈紫色, 輪生葉在主莖著生點的間距比野生型明顯變大(圖7-B: BoLH27), 著生點的間距平均為1.7 cm (表2), 而野生型甘藍519緊湊, 幾乎沒有間距(圖7-B: WT)。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

M: DL2000; 1~10: 轉(zhuǎn)基因甘藍; +: 陽性對照; –: 非轉(zhuǎn)基因甘藍。

M: DL2000; 1–10: transgenic cabbage; +: positive plamid; –: non-transgenic cabbage.

圖6 BoLH27在野生型和轉(zhuǎn)基因甘藍中的表達分析

WT: 野生型株系; S13, S14, S33: 超表達株系。

WT: non-transgenic lines; S13, S14, S33: transgenic lines.

圖7 野生型株系和BoLH27超表達株系表型

A: 10片葉幼苗期; B: 24片葉蓮座期側(cè)視圖; C: 24片葉蓮座期俯視圖; WT: 野生型; BoLH27: 超表達株系; partial: 超表達株系局部放大。

A: seedling stage with ten leaves; B: side view of rosette stage with twenty-four leaves; C: top view of rosette stage with twenty-four leaves; WT: non-transgenic lines; BoLH27: overexpressed lines; partial: partial enlarged drawing of overexpressed lines.

表2 超表達株系平均葉柄長度和平均葉間距

3 討論

截至目前有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報道大多集中在擬南芥、玉米、水稻等模式作物上[7,24]。本研究克隆獲得了甘藍基因, 其蛋白包含典型的bHLH家族保守序列, 有堿性區(qū)域和α螺旋1-環(huán)-α螺旋-2, 與前人報道的一致[26-27], 功能域關(guān)鍵氨基酸位點保守, 與前人報道的相同。包括結(jié)合下游基因啟動子E-box的2個關(guān)鍵位點13E-16R[9], bHLH功能域形成二聚體的關(guān)鍵位點Leu23[10]。在系統(tǒng)進化中, 十字花科植物BoLH27較為保守。

研究表明, bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在葉片發(fā)育和形態(tài)調(diào)控方面具有重要作用。HLH蛋白ILI1和PRE1能與bHLH蛋白IBH1結(jié)合, 在水稻中超表達基因能使葉片豎直生長; 在擬南芥中超表達該基因?qū)е轮仓臧27]。和可能通過形成異源二聚體的方式使轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用失活,或者的超表達能增加細(xì)胞的長度和抑制矮小的表型[27]。大豆隱花色素基因與bHLH類型轉(zhuǎn)錄因子在藍光下發(fā)生特異的相互作用, 在大豆中超表達基因使植株葉片早衰, 這種機制是由于能促進衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[28]。酵母雙雜交證實轉(zhuǎn)錄因子bHLH048可以與基因啟動子區(qū)域相互作用[29], LOB蛋白在葉片近-遠軸建立中起負(fù)調(diào)控作用, 超表達基因會使葉形變小, 子葉和葉片向上向內(nèi)彎曲[30]。TCP蛋白是一種具有bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白, TCP7/23可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖來調(diào)控葉片早期的發(fā)育, 酵母雙雜交證實TCP7和TCP23可以相互作用, 并可強增基因的表達,基因在植物頂端分生組織的維持上有重要作用[31]。在擬南芥的超表達造成了葉柄和叢生葉的伸長,TCP1能和油菜素內(nèi)酯合成的關(guān)鍵酶基因的啟動子相互作用, 此外TCP1能正向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄豐度[32]。在本研究中, 超表達的甘藍植株在幼苗期和蓮座期均觀察到了明顯的葉柄伸長, 這與在擬南芥中超表達基因造成葉柄伸長的表型極為類似。在擬南芥中超表達會降低五個基因的表達, 進而使植株形成卷縮葉[33], 與之相似的是本研究獲得的基因超表達的甘藍植株,在蓮座期后期其本應(yīng)向上向內(nèi)卷曲的葉片繼續(xù)平展生長, 由此表明, 在甘藍中可能起到了類似與擬南芥中同為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能, 在葉片卷曲過程中起負(fù)調(diào)控作用。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子還可以調(diào)節(jié)類黃酮生物合成, 而花青素是類黃酮中的一大類。玉米中的同源基因和參與紫色花青素合成的調(diào)節(jié)[34]。矮牽?；ㄖ衎HLH基因和能促進花青素合成基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控花的著色[35]。是擬南芥中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控類黃酮合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,的轉(zhuǎn)錄豐度受PAP1蛋白的負(fù)調(diào)控[36]。擬南芥中bHLH成員和相繼被發(fā)現(xiàn), 在其雙突變體中花青素的合成受到抑制[37]。在楊梅中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子, 通過煙草葉片的異源瞬時表達發(fā)現(xiàn)能與結(jié)合從而引起花青素合成的顯著增加, 用雙熒光素酶報告基因檢測的方法揭示了和能夠選擇性地激活五種特異的啟動子(、、、、)[38]。在十字花科植物花椰菜中發(fā)現(xiàn)一種()突變體,編碼一種轉(zhuǎn)錄因子, 上調(diào)表達的能特異地激活bHLH轉(zhuǎn)錄因子和幾個花青素結(jié)構(gòu)基因, 能在凝乳組織和其他組織中合成大量的青花素,使突變體呈現(xiàn)顯著的紫色表型[39]。與上述報道的情況類似, 本研究中通過在甘藍519材料中超表達bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因, 使轉(zhuǎn)基因植株的莖和葉脈呈現(xiàn)紫色(圖7-B: partial; 圖7-C: partial), 表明在甘藍中可能正向調(diào)控花青素的積累, 并在多序列比對中BoLH27和BobHLH1兩者均具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域(圖2), 然而是該蛋白直接調(diào)控花青素積累相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因的表達, 還是與其他轉(zhuǎn)錄因子一起共同參與調(diào)控等問題還有待進一步研究。

4 結(jié)論

從甘藍519材料中克隆了一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子BoLH27的編碼序列, 該蛋白具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域和完全保守的關(guān)鍵位點13E-16R和Leu23。獲得了超表達轉(zhuǎn)基因植株, 轉(zhuǎn)基因植物莖葉間距變大、葉柄伸長、葉耳明顯、葉片平展生長, 且植株莖和葉脈呈現(xiàn)紫色, 推測可能在甘藍形態(tài)建成和花青素積累過程中有調(diào)控作用, 該研究對于進一步研究植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能具有一定的科學(xué)意義。

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Cloning ofGene from Cabbage and Phenotype Analysis of Transgenic Cabbage

LIANG Yun-Fei1,**, ZHANG Lin-Cheng1,**, PU Quan-Ming2, LEI Zhen-Ze1, SHI Song-Mei1, JIANG Yu-Peng1, REN Xue-Song1, and GAO Qi-Guo1,*

1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400716, China;2Institute of Vegetables, Nanchong Academy of Agricultural Sciences, Nanchong 637000, Sichuan, China

bHLH transcription factor plays an important role in plant growth, development and morphological control. In order to exploregene regulatory function for leaf development and morphologic formation, thegene was cloned from cabbage (L.) variety 519. Sequence analysis indicated that the length ofgene was 795 bp, which encoded 264 amino acids. The BoLH27 protein contained conservative structure domains of the bHLH family. The sensegene was transformed into cabbage variety 519 bymediated method, PCR analysis exhibited thatwas genetically transformed into nine individual plants, qRT-PCR analysis revealed thathad higher expression level in T2transgenic cabbage than in wild type. The phenotype at rosette stage of transgenic cabbage grown in the test base was obvious, showing elongated the stems and leaves, elongated petiole, purple stems and petiole, and flat leaves without upward inward curling trend. It suggested thatmay play important roles in the control of leaves development.

; BoLH27; gene cloning; transgene; phenotype

2017-06-06;

2017-11-21;

2017-12-11.

10.3724/SP.J.1006.2018.00397

本研究由國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(2012CB113900)和國家自然科學(xué)基金項目(30900986)資助。

This study was supported by the National Program on Key Basic Research Project (973 program)(2012CB113900) and the National Natural Science Foundation of China (30900986).

Corresponding author高啟國, E-mail: gaoqg031@swu.edu.cn **同等貢獻(Contributed equally to this work).

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171211.0849.016.html