劉寶玉 劉軍化 杜 丹 閆 萌 鄭麗媛 吳 雪 桑賢春 張長(zhǎng)偉

?

水稻類病斑突變體的鑒定與基因精細(xì)定位

劉寶玉 劉軍化 杜 丹 閆 萌 鄭麗媛 吳 雪 桑賢春 張長(zhǎng)偉*

西南大學(xué)水稻研究所 / 轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400716

利用化學(xué)誘變劑EMS處理秈型水稻恢復(fù)系“縉恢10號(hào)”, 從其后代中篩選到1個(gè)遺傳穩(wěn)定的類病斑突變體。該突變體于分蘗后期在下部葉片的葉鞘上開(kāi)始出現(xiàn)褐色的類病斑, 隨后沿著中脈擴(kuò)散至整個(gè)葉片, 成熟期擴(kuò)散至整個(gè)植株。相比于野生型, 該突變體的株高顯著變矮, 穗長(zhǎng)顯著變短, 穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重極顯著降低。遮光試驗(yàn)和組織化學(xué)分析表明, 突變體類病斑的形成受光誘導(dǎo), 在類病斑形成部位發(fā)生大量過(guò)氧化氫沉積和細(xì)胞程序性死亡。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 在紫外光照射下突變體產(chǎn)生的熒光較野生型弱。與野生型相比, 突變體的H2O2和O2-含量較高, 而CAT、POD和T-SOD等保護(hù)酶的活性顯著降低; 稻瘟病抗性無(wú)明顯差異或略顯降低。遺傳分析表明, 突變體的表型受1對(duì)隱性核基因控制?；蚨ㄎ唤Y(jié)果表明, 該基因定位于第4染色體的LR49和LR52兩個(gè)分子標(biāo)記之間, 物理距離為200 kb。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)的候選基因的第3449位堿基發(fā)生突變(G3449T), 導(dǎo)致色氨酸替換為半胱氨酸。qRT-PCR結(jié)果表明該基因在突變體內(nèi)表達(dá)量降低, 而部分病程相關(guān)基因的表達(dá)量則升高。

水稻; 類病斑突變體;; 基因; 精細(xì)定位

植物類病斑突變體是指植物在未受到外界逆境脅迫、傷害或病原菌侵染的情況下, 在其葉片、葉鞘等部位自發(fā)形成各種類似于壞死病斑的一類突變體[1]。根據(jù)類病斑突變體表型特征及類病斑分布情況, 可將其分為起始型和擴(kuò)散型, 起始型具有大小及分布位置較穩(wěn)定的斑點(diǎn), 而擴(kuò)散型的斑點(diǎn)在形成后會(huì)擴(kuò)散到葉片其他部位甚至葉鞘和莖稈[2-3]。類病斑突變體的發(fā)生機(jī)制主要有抗病抗逆相關(guān)基因的突變或缺失、活性氧及羥自由基在植物體內(nèi)的積累、正常代謝途徑的紊亂和外界條件(如光照、溫度)的影響等[4]。植物類病斑的產(chǎn)生與植物受到環(huán)境脅迫或病原菌侵害時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)類似, 都取決于植物的基因型和所處的環(huán)境條件, 因此可用于研究植物對(duì)環(huán)境脅迫和病原菌入侵的反應(yīng)[5]。

迄今在擬南芥[6]、玉米[7]、番茄[8]、水稻[9]等植物中均有類病斑突變體報(bào)道。水稻中已報(bào)道的類病斑突變體很多與其抗性有關(guān)[10-11], 如突變體[12]、[13][14]、[15]等對(duì)稻瘟病和白葉枯病的抗性均增強(qiáng); 突變體[16]對(duì)稻瘟病的抗性增強(qiáng), 對(duì)白葉枯病的抗性則無(wú)影響; 突變體[17]和[18]對(duì)白葉枯病的抗性增強(qiáng), 對(duì)稻瘟病的抗性影響則尚不明確; 而[19]對(duì)稻瘟病的抗性降低或不變。在這些水稻類病斑突變體中, 第一個(gè)被克隆的類病斑突變基因是[2,19], 該基因位于第5染色體上, 編碼一個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子蛋白; 其余已克隆的水稻類病斑突變體基因有[15]、[20][21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[12]、[16]、[14]、[28]、[29]、[13]、[30]、[31]、[32]和[33], 但相比于發(fā)現(xiàn)的突變體數(shù), 目前已被克隆的類病斑體基因數(shù)還比較少。

我們通過(guò)EMS誘變秈稻“縉恢10號(hào)”, 從其后代中篩選出1個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的類病斑突變體。與野生型相比, 該突變體苗期和分蘗前期表型正常, 從分蘗后期開(kāi)始倒三、倒四葉的葉鞘出現(xiàn)褐色斑點(diǎn), 隨后斑點(diǎn)先沿著中脈向上部擴(kuò)散, 再由中脈向葉片兩側(cè)擴(kuò)散, 至成熟期褐色斑點(diǎn)分布于整個(gè)植株的葉片及葉鞘, 這與已報(bào)道的水稻類病斑突變體表型不同。因此, 本文從遺傳特性、農(nóng)藝性狀、組織化學(xué)分析、稻瘟病抗性鑒定及基因定位等方面對(duì)類病斑突變體進(jìn)行系列試驗(yàn), 以期為研究和應(yīng)用控制該突變體性狀的相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

利用EMS化學(xué)誘變劑誘變秈型水稻恢復(fù)系“縉恢10號(hào)”獲得突變體, 經(jīng)過(guò)連續(xù)4代種植, 發(fā)現(xiàn)該突變體表型穩(wěn)定遺傳。將與秈稻不育系“西農(nóng)1A”雜交獲得F1和F2種子用于遺傳分析, 利用F2群體對(duì)突變體基因進(jìn)行分子定位。用于稻瘟病菌生理小種鑒別的7個(gè)供試品種分別為T(mén)etep、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18和麗江新團(tuán)黑谷。供試穗頸瘟標(biāo)樣采集自四川省的敘永縣、冕寧縣, 及重慶市的黔江、合川、南川、永川等地的一些主栽或新推廣品種。

1.2 農(nóng)藝性狀考察

將野生型“縉恢10號(hào)”和突變體種植于田間小區(qū), 3次重復(fù), 每個(gè)重復(fù)10行, 每行10株。至成熟期, 隨機(jī)從小區(qū)中央選取10株考察株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等農(nóng)藝性狀, 并作檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 遮光試驗(yàn)

在田間條件下, 用約2 cm長(zhǎng)的錫箔紙分別對(duì)處于抽穗期即將出現(xiàn)表型的野生型和突變體葉片進(jìn)行包裹遮光處理, 1周后揭掉錫箔紙對(duì)葉片進(jìn)行復(fù)光處理, 復(fù)光處理時(shí)間也為1周; 期間分別對(duì)遮光處理和復(fù)光處理的葉片跟蹤拍照記錄。

1.4 光合色素含量測(cè)定

參考Lichtenthaler[34]的方法, 分別測(cè)定野生型和突變體抽穗期的倒一、倒二和倒三葉的光合色素含量。8:30—9:00在小區(qū)中間選取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的野生型和突變體植株各5株, 稱取0.05 g葉片將其剪碎后浸泡于25 mL體積比為乙醇∶丙酮=1∶1的溶液中, 設(shè)置3個(gè)重復(fù), 暗處理24 h, 期間振蕩數(shù)次; 然后用分光光度計(jì)測(cè)定663、645和470 nm波長(zhǎng)下的吸光值, 計(jì)算光合色素含量, 并作檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 葉綠體的熒光顯微鏡觀察

抽穗期, 分別剪取野生型和突變體倒二葉中部約1 cm長(zhǎng)葉片包埋于包埋劑(Tissue-Tek, SAKURA)中, 然后-20°C冷凍至包埋劑凝固后用冷凍切片機(jī)切成8 μm厚的切片, 取沖洗干凈的載玻片粘取切片, 用生理鹽水將切片清洗3次, 把切片周?chē)陌駝┣逑锤蓛艉笊w上蓋玻片, 最后在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的熒光現(xiàn)象。

1.6 突變體的組織化學(xué)分析

為檢測(cè)突變體在類病斑形成過(guò)程中是否存在細(xì)胞死亡和過(guò)氧化氫積累, 在抽穗期分別取野生型和突變體相同部位的葉片, 參照Bowling等[35]的方法進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和參照Thordal-Christensen等[36]的方法進(jìn)行DAB染色。

1.7 生理指標(biāo)測(cè)定

在抽穗期, 分別取野生型和突變體各3株, 用南京建成科技有限公司提供的試劑盒, 按其說(shuō)明書(shū)測(cè)定倒一、倒二、倒三葉過(guò)氧化氫、羥自由基和超氧陰離子的含量, 以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性等生理生化指標(biāo), 并進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.8 稻瘟病菌抗譜測(cè)定和抗性鑒定

在西南大學(xué)水稻研究所歇馬基地溫室內(nèi)進(jìn)行抗譜測(cè)定和苗瘟抗性鑒定, 在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所敘永稻瘟病病圃進(jìn)行葉瘟和穗頸瘟抗性鑒定。參照黃富等[37]的方法, 進(jìn)行單孢分離純化、產(chǎn)孢培養(yǎng)和制備孢子懸浮液, 共分離了56個(gè)單孢菌株。參照張長(zhǎng)偉等[38]的方法進(jìn)行稻瘟病菌抗譜測(cè)定和苗瘟、葉瘟、穗頸瘟的抗性鑒定。按全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組[39]的方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)供試菌株進(jìn)行生理小種劃分和命名。以抗病頻率作為野生型和突變體的抗譜評(píng)價(jià)指標(biāo), 抗病頻率越高, 表明該材料對(duì)稻瘟病菌群體的抗譜范圍越寬, 廣譜抗性越強(qiáng)。

抗病頻率(%) = (對(duì)該供試材料非致病菌株數(shù)/測(cè)試有效菌株總數(shù))×100

按國(guó)際水稻研究所(IRRI)水稻標(biāo)準(zhǔn)評(píng)級(jí)系統(tǒng)(0~9級(jí))標(biāo)準(zhǔn)(IRRI, 2002)[40], 以苗瘟病情指數(shù)、葉瘟病情指數(shù)分別作為野生型和突變體的苗瘟、葉瘟抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

病情指數(shù)(%) = ∑(病害某一級(jí)別的植株數(shù)×病害的相對(duì)病級(jí)數(shù)值)/(病害的最高病級(jí)數(shù)值×調(diào)查總株數(shù))×100。

另外, 以病穗率作為野生型和突變體的穗頸瘟抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.9 基因定位

根據(jù)F2群體中正常植株和突變體植株的比值, 選取F2中突變體植株用于基因定位, 采用CTAB法[41]提取親本和基因定位群體的基因組DNA。首先隨機(jī)選取F2中正常植株和突變體植株各10株, 剪取葉片等量混勻構(gòu)建正?；虺睾屯蛔凅w基因池。用本實(shí)驗(yàn)室已備好的96對(duì)均勻分布于水稻12條染色體上的多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)基因池進(jìn)行擴(kuò)增, 將具有偏態(tài)的標(biāo)記用單株進(jìn)行驗(yàn)證, 以確定分子標(biāo)記與突變位點(diǎn)是否連鎖。再在連鎖標(biāo)記位點(diǎn)兩側(cè)自行設(shè)計(jì)InDel標(biāo)記對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行初步定位。分子標(biāo)記由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR體系為12.5 μL, 含1.25 μL 10 × PCR buffer、0.5 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、正反引物各0.5 μL、1.0 μL模板DNA、0.1 μL 5 U rDNA聚合酶、8.65 μL ddH2O。PCR程序?yàn)轭A(yù)變性94°C 5 min; 變性94°C 30 s, 退火55°C 30 s, 延伸72°C 30 s, 35個(gè)循環(huán); 再延伸72°C 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染后記錄帶型。

1.10 候選基因分析及測(cè)序

利用GRAMENE、國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心和NCBI等網(wǎng)站查閱定位區(qū)間內(nèi)的基因注釋并分析, 遴選候選基因。為候選基因設(shè)計(jì)引物, 以野生型和突變體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR, 產(chǎn)物用于測(cè)序。用VectorNTI軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.11 總RNA提取及qRT-PCR

抽穗期取野生型的正常葉片、葉鞘和突變體有類病斑的葉片和葉鞘, 按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA, 試劑盒由北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司提供。參照TAKARA的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL, 含10 μL 2 × SYBR Premix ExII, 0.4 μL 50 × ROX Reference Dye, 2 μL cDNA模板, 正、反引物(10 μmol L–1)各0.6 μL, 6.4 μL RNase-free H2O。在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴(kuò)增后, 利用CFX-Manager軟件收集和整理數(shù)據(jù), 并進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型及主要農(nóng)藝性狀

整個(gè)生育期野生型植株未出現(xiàn)類病斑, 而在分蘗后期突變體下部葉片的葉鞘上開(kāi)始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn), 隨后褐色斑點(diǎn)向植株上部擴(kuò)散, 至成熟期整個(gè)植株的葉片和葉鞘均分布有褐斑(圖1-A, B, C)。成熟期突變體的株高、穗長(zhǎng)較野生型顯著降低, 每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重較野生型極顯著降低, 但兩者的有效穗數(shù)則無(wú)顯著差異(表1)。

2.2 對(duì)遮光處理的響應(yīng)

對(duì)野生型的葉片和突變體即將出現(xiàn)類病斑的葉片用錫箔紙進(jìn)行遮光處理1周后顯示, 突變體被錫箔紙遮蓋的部位不出現(xiàn)或只出現(xiàn)極少量的類病斑, 而葉片其他部位出現(xiàn)大量的類病斑。遮光處理的部位復(fù)光1周后出現(xiàn)明顯的類病斑(圖2)。說(shuō)明突變體的類病斑受光誘導(dǎo)。

表1 野生型(WT)和spl34的主要農(nóng)藝性狀

*在0.05水平上差異顯著;**在0.01水平上差異顯著。

*Significantly different at<0.05;**significantly different at<0.01.

圖1 分蘗期、成熟期野生型(WT)和突變體spl34的表型

A: 分蘗期野生型(WT)和突變體植株; B: 成熟期野生型(WT)和突變體植株; C: 成熟期野生型(WT)和突變體的葉片。

A: plants of the wild type (WT) and themutant at tillering stage; B: plants of the wild type (WT) and themutant at mature period; C: leaves of the wild type (WT) and themutant at mature period.

圖2 遮光對(duì)野生型和突變體spl34葉片的影響

A: 野生型遮光處理后; B: 野生型遮光處理后復(fù)光1周; C: 突變體遮光后; D: 突變體遮光處理后復(fù)光1周后。

A: leaf of the wild type after shading; B: leaf of wild type regained normal light for one week after shading; C: leaf ofafter shading; D: leaf ofregained normal light for one week after shading.

2.3 光合色素含量的變化

抽穗期突變體的倒一葉光合色素含量均略高于野生型, 但未達(dá)到顯著差異水平; 而倒二葉和倒三葉光合色素含量均較野生型低, 且分別達(dá)到了顯著和極顯著差異水平(圖3), 這與突變體在抽穗期倒一葉還未出現(xiàn)類病斑, 倒二葉出現(xiàn)類病斑但較倒三葉少有關(guān)。

圖3 野生型(WT)和突變體spl34抽穗期光合色素含量

*在0.05水平上差異顯著; **在0.01水平上差異顯著。A~C: 抽穗期野生型(WT)和突變體的倒一葉(A)、倒二葉(B)和倒三葉(C)光合色素含量。

A-C: photosynthetic pigments contents of the flag leaves, second leaves, third leaves respectively in the wild type and themutant at heading stage. * Significantly different at<0.05; ** significantly different at<0.01.

2.4 突變體熒光顯微鏡觀察結(jié)果

抽穗期取野生型的葉片及突變體有類病斑的葉片制作冷凍切片, 于熒光顯微鏡下觀察顯示, 突變體的葉綠體產(chǎn)生的紅色熒光弱于野生型, 且突變體中出現(xiàn)類病斑的部位(圖4-D中白色箭頭處)葉綠體產(chǎn)生的紅色熒光也較未出現(xiàn)類病斑的部位弱(圖4-D中黃色箭頭處), 說(shuō)明突變體產(chǎn)生類病斑的部位發(fā)生了葉綠素降解。

圖4 野生型和突變體spl34葉片的自發(fā)熒光

A, B: 野生型在自然光和紫外光下葉片橫切顯微結(jié)構(gòu); C, D: 突變體在自然光和紫外光下葉片橫切顯微結(jié)構(gòu); 標(biāo)尺: 100 μm。白色箭頭所指部位為類病斑形成部位, 黃色箭頭所指部位為未形成類病斑部位。

A, B: microstructure in cross section of wild type under natural light and UV light; C, D: microstructure in cross section ofmutant under natural light and UV light; Bar=100 μm. The positions pointed by white arrows are the lesion formation sites, those with yellow arrows are the sites without lesion mimic.

2.5 突變體葉片的細(xì)胞程序性死亡和H2O2積累

臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示, 突變體的葉片有類病斑的部位及其周?chē)蝗境缮钏{(lán)色, 說(shuō)明該部位存在細(xì)胞程序性死亡, 而野生型的葉片被染成均勻的淺藍(lán)色, 說(shuō)明其葉片上未發(fā)生細(xì)胞程序性死亡(圖5-A, B)。這可能是產(chǎn)生類病斑的部位發(fā)生了過(guò)敏性反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。DAB染色結(jié)果顯示, 突變體的葉片上有大量紅褐色斑點(diǎn), 而野生型的葉片上并未出現(xiàn)類似的斑點(diǎn)(圖5-C, D), 說(shuō)明突變體在類病斑產(chǎn)生的過(guò)程中伴隨著H2O2的積累。

圖5 野生型(WT)和突變體spl34的組織化學(xué)分析

A, B: 野生型(WT)和突變體葉片的臺(tái)盼藍(lán)染色; C, D: 野生型(WT)和突變體葉片的DAB染色。

A, B: leaves of the wild type (WT) and themutant stained by trypan blue; C, D: leaves of the wild type (WT) and themutant stained by DAB.

2.6 突變體生理指標(biāo)的變化

抽穗期突變體的H2O2含量極顯著高于野生型, 而其O2-含量只有倒三葉較野生型極顯著升高, 倒一、倒二葉的O2-含量與野生型相比無(wú)顯著差異, 這可能與突變體孕穗期倒一葉無(wú)類病斑, 倒二葉剛出現(xiàn)類病斑, 倒三葉類病斑較明顯有關(guān); 突變體的?OH含量與野生型相比無(wú)顯著差異(圖6-A~C)。對(duì)CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果顯示, 突變體的抗氧化酶活性顯著或極顯著低于野生型(圖6-D~F), 說(shuō)明植株體內(nèi)的抗氧化酶活性降低使得突變體清除自由基能力下降, 導(dǎo)致突變體體內(nèi)的H2O2和O2-含量升高, 而?OH因其氧化能力很強(qiáng), 產(chǎn)生后便立刻與其他分子發(fā)生反應(yīng), 不需要專門(mén)的酶來(lái)清理, 因此突變體體內(nèi)的抗氧化酶活性降低對(duì)其含量影響不大。

2.7 突變體的稻瘟病菌抗譜測(cè)定和稻瘟病抗性鑒定

56個(gè)供試單孢菌株中有54個(gè)菌株對(duì)麗江新團(tuán)黑谷嚴(yán)重侵染, 為有效菌株。54個(gè)有效菌株經(jīng)7個(gè)中國(guó)鑒別品種鑒定劃分為6個(gè)中國(guó)生理群19個(gè)生理小種。ZB 群為優(yōu)勢(shì)種群, 小種出現(xiàn)頻率為61.11%; ZA群為重要種群, 小種出現(xiàn)頻率為20.37%; ZC、ZD、ZE和ZG等種群的小種出現(xiàn)頻率均較低, 分別為3.7%、3.7%、1.86%和12.96%。

圖6 抽穗期野生型(WT)和突變體spl34的生理指標(biāo)

*在0.05水平上差異顯著; **在0.01水平上差異顯著。

* Significantly different at<0.05; ** significantly different at<0.01.

表2顯示, 突變體對(duì)ZA生理群的抗病頻率比野生型升高15.38%, 而對(duì)ZB生理群的抗病頻率比野生型降低3.63%, 對(duì)ZC、ZD、ZE和ZG生理群的抗病頻率則與野生型相同, 特別是對(duì)總?cè)旱目共☆l率也與野生型相同。說(shuō)明與野生型相比, 突變體的抗譜并未明顯拓寬。

苗瘟、葉瘟和穗頸瘟的抗性鑒定結(jié)果(表3)顯示, 突變體苗瘟、葉瘟病情指數(shù)和穗頸瘟的病穗率均比野生型略高, 但差異并不顯著。說(shuō)明突變體與野生型的稻瘟病抗性差異也不明顯或略顯降低。

2.8 突變體的遺傳分析

以表型正常的“西農(nóng)1A”為母本, 突變體為父本雜交得到的F1表型正常, F1自交得到的F2出現(xiàn)性狀分離, 正常株1774株, 突變株562株, 經(jīng)卡方分析c2=1.06

4) 遙控停車(chē)。當(dāng)主機(jī)運(yùn)行、控制部位在集控臺(tái)時(shí)，將集控臺(tái)上的車(chē)鐘手柄扳至停車(chē)位置，系統(tǒng)向電噴控制系統(tǒng)發(fā)出停車(chē)指令，由電噴控制系統(tǒng)控制主機(jī)停機(jī)。

表2 野生型(WT)與突變體spl34對(duì)稻瘟病菌的抗譜

表3 野生型(WT)與突變體spl34的稻瘟病病情指標(biāo)

2.9 突變體的基因定位、候選基因分析及測(cè)序

將F2群體中的突變體植株用于基因定位。用本實(shí)驗(yàn)室已準(zhǔn)備好的96對(duì)均勻分布于12條染色體上的具有多態(tài)的引物對(duì)正?；虺睾屯蛔凅w基因池進(jìn)行擴(kuò)增, 發(fā)現(xiàn)位于第4染色體編號(hào)為ID40的分子標(biāo)記與突變基因連鎖, 在該分子標(biāo)記兩側(cè)開(kāi)發(fā)新的具有多態(tài)的InDel分子標(biāo)記(表4), 將目標(biāo)基因定位于LR7和LR14兩個(gè)分子標(biāo)記之間, 為了進(jìn)一步確定目標(biāo)基因的位置在LR7和LR40之間又開(kāi)發(fā)5對(duì)具有多態(tài)的InDel分子標(biāo)記(表4), 最終將目標(biāo)基因定位在LR49和LR52兩個(gè)分子標(biāo)記之間, 遺傳距離分別為1.07 cM和0.09 cM, 區(qū)間大小約為200 kb。

表4 新開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記

利用GRAMENE、國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心和NCBI等網(wǎng)站查閱定位區(qū)間內(nèi)的基因注釋, 發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)共包含了32個(gè)候選基因, 與類病斑突變有一定相關(guān)性的有:編碼富含半胱氨酸的類受體蛋白激酶前體編碼類受體激酶編碼pelota蛋白編碼過(guò)氧化物酶前體編碼AAA-ATP酶, 因此對(duì)這5個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示, 突變體中的基因發(fā)生了單堿基突變, 該基因的第3449位堿基, 即第5外顯子的第9位堿基由G突變?yōu)門(mén), 導(dǎo)致氨基酸替換, 由色氨酸突變?yōu)榘腚装彼?圖7), 因此初步推測(cè)該基因可能為控制類病斑產(chǎn)生的候選目的基因。根據(jù)GRAMENE的預(yù)測(cè), 該基因在植株的各個(gè)部位均有表達(dá), 其全長(zhǎng)7701 bp, 有2個(gè)轉(zhuǎn)錄, 第一轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)為2772 bp, 編碼1個(gè)長(zhǎng)為131 aa的蛋白; 第二轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)為1691 bp, 編碼1個(gè)長(zhǎng)為252 aa的蛋白。

2.10 目的基因、病程相關(guān)基因和稻瘟病抗性基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR對(duì)野生型和突變體抽穗期的葉片和葉鞘進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示, 與野生型相比, 突變體的基因在葉片和葉鞘中表達(dá)量均降低(圖8)。說(shuō)明突變體類病斑的出現(xiàn)可能是由于該基因的表達(dá)量降低引起的。

圖7 突變體spl34的基因定位

圖8 目的基因spl34相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)病程相關(guān)基因和稻瘟病抗性基因的表達(dá)分析結(jié)果(圖9)顯示, 突變體的病程相關(guān)基因和的表達(dá)量顯著或極顯著高于野生型, 這可能是由于突變體類病斑的產(chǎn)生激發(fā)這些病程相關(guān)基因的表達(dá)量上升。但其余病程相關(guān)基因和稻瘟病抗性基因的表達(dá)量卻均未出現(xiàn)上升, 這也許是突變體的稻瘟病抗性并未增強(qiáng)的原因。

圖9 病程相關(guān)基因和稻瘟病抗性基因的表達(dá)分析

病程相關(guān)基因?yàn)椤?、、、、? 稻瘟病抗性基因?yàn)?、、、、和?/p>

The pathogenesis-related genes:,,,,,,; the rice blast resistance genes:,,,,,.

3 討論

類病斑突變體是研究植物細(xì)胞程序性死亡和植物對(duì)環(huán)境脅迫、病原菌入侵反應(yīng)的理想材料。目前已定位的類病斑突變體基因在水稻12條染色體上均有分布。在已報(bào)道的類病斑突變基因中主要編碼的蛋白有熱激轉(zhuǎn)錄因子蛋白、U-box/Armadillo 重復(fù)蛋白、假定糞卟啉原Ⅲ氧化酶、鋅指蛋白、?；D(zhuǎn)移酶、RAF-絲裂原活化蛋白激酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶家族的CYP71P1蛋白等。本研究報(bào)道的編碼pelota蛋白, 根據(jù)NCBI的預(yù)測(cè), 它是一個(gè)蛋白釋放因子(eRF1), 通過(guò)識(shí)別終止密碼和促進(jìn)肽酰-tRNA鍵的水解從而終止蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。該蛋白包含3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域, 其三維結(jié)構(gòu)與tRNA相似。測(cè)序結(jié)果顯示, 在突變體的第5外顯子的第9個(gè)堿基發(fā)生突變, 由原來(lái)的G突變?yōu)門(mén), 導(dǎo)致該位置的一個(gè)氨基酸被替換, 即由原來(lái)的色氨酸突變?yōu)榘腚装彼? 但是否就是控制突變體類病斑產(chǎn)生的目的基因還有待進(jìn)一步的功能互補(bǔ)驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果表明, 與野生型相比,在突變體內(nèi)表達(dá)量降低。

表型特征方面, 突變體從分蘗后期開(kāi)始在下部葉片的葉鞘上出現(xiàn)類病斑, 隨后先沿著葉片中脈向上擴(kuò)散, 最后再由中脈向葉片兩側(cè)擴(kuò)散, 至成熟期類病斑分布于整個(gè)植株的葉片和葉鞘上。雖然突變體與之前報(bào)道的[42]在定位區(qū)間上有重疊, 但它們的表型特征及出現(xiàn)時(shí)期并不完全相同,在播種后10 d便在第1張葉片的葉尖部位出現(xiàn)類病斑。此外,的分蘗數(shù)與野生型相比并沒(méi)有顯著變化, 而的分蘗數(shù)與野生型相比極顯著地減少, 但在株高、穗長(zhǎng)及千粒重方面突變體和一樣均較野生型顯著降低, 這可能是兩個(gè)突變體發(fā)生突變的位點(diǎn)不同導(dǎo)致的。

類病斑突變體上的類病斑產(chǎn)生受光照、溫度和濕度的影響, 且在類病斑產(chǎn)生部位及其周?chē)ǔ?huì)伴隨著細(xì)胞程序性死亡。Noutoshi等[43]報(bào)道的擬南芥類病斑突變體在低溫低濕的條件下才會(huì)出現(xiàn)類病斑; Arase等[44]在水稻中發(fā)現(xiàn)一類病斑突變體, 該突變體在氣溫高于25°C時(shí)不出現(xiàn)類病斑, 而當(dāng)氣溫低于20°C時(shí)類病斑明顯。Yamanouchi等[19]報(bào)道的突變體類病斑的產(chǎn)生與高溫和紫外光有關(guān); 邱潔華等[45]通過(guò)遮光試驗(yàn)證明水稻類病斑突變體的褐斑產(chǎn)生受光的誘導(dǎo)。在已報(bào)道的類病斑突變體中如[23][46]、[12]等, 均出現(xiàn)局部細(xì)胞程序性死亡; 而[22][15]、[20]等突變體則出現(xiàn)葉片早衰現(xiàn)象。本研究中的類病斑突變體在其類病斑產(chǎn)生部位也存在細(xì)胞程序性死亡。同時(shí)遮光試驗(yàn)結(jié)果也表明,上的類病斑產(chǎn)生受光照的誘導(dǎo)。此外, 在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)上類病斑的產(chǎn)生還可能與溫度有關(guān), 當(dāng)溫度低于20°C時(shí)類病斑產(chǎn)生的數(shù)量急劇減少甚至不產(chǎn)生, 即使有少量類病斑產(chǎn)生, 其產(chǎn)生的時(shí)期也有推遲現(xiàn)象, 具體情況還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

植物的類病斑突變有時(shí)還會(huì)誘發(fā)其抗性的改變。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果顯示, 突變體的稻瘟病抗性并未增強(qiáng), 抗譜并未拓寬。qRT-PCR結(jié)果顯示, 突變體中稻瘟病抗性基因的相對(duì)表達(dá)量與野生型相比并未明顯升高, 稻瘟病抗性基因的表達(dá)是水稻對(duì)稻瘟病抗性的主要影響因素, 雖然在突變體中的和3個(gè)病程相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著高于野生型, 但病程相關(guān)基因不僅與水稻的稻瘟病抗性有關(guān), 而且還與水稻對(duì)其他逆境脅迫的抗性有關(guān), 其相對(duì)表達(dá)量升高可能誘導(dǎo)突變體對(duì)其他逆境脅迫的抗性增強(qiáng), 而對(duì)水稻的稻瘟病抗性增強(qiáng)影響不大或無(wú)影響。生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明, 突變體中的H2O2和O2-含量比野生型高, 且已經(jīng)產(chǎn)生類病斑部位的H2O2和O2-含量要比未產(chǎn)生類病斑的部位高, 說(shuō)明這兩類活性氧是隨著類病斑的產(chǎn)生而積累的。

研究植物類病斑突變體對(duì)了解植物的細(xì)胞程序性死亡和抗病機(jī)理有重要意義, 為育種方面抗病材料的篩選提供理論基礎(chǔ)。本研究從農(nóng)藝性狀、生理生化特性以及突變基因的定位和表達(dá)等方面對(duì)水稻類病斑突變體進(jìn)行系統(tǒng)地研究, 所得結(jié)果可為進(jìn)一步研究類病斑突變體的產(chǎn)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

水稻類病斑突變體表型受1對(duì)隱性核基因控制, 苗期和分蘗前期無(wú)類病斑, 從分蘗后期開(kāi)始在其下部葉片的葉鞘上出現(xiàn)類病斑, 隨后逐漸擴(kuò)散, 至成熟期分布于整個(gè)植株的葉片和葉鞘上。突變體的株高變矮, 產(chǎn)量降低, 葉綠素的熒光現(xiàn)象減弱, 對(duì)稻瘟病的抗性無(wú)明顯變化或略顯降低; 其體內(nèi)的H2O2和O2–含量在出現(xiàn)類病斑的部位顯著升高, 而?OH的含量變化不大; 保護(hù)酶CAT、POD和T-SOD的活性較野生型低。被定位于第4染色體LR49和LR52兩個(gè)分子標(biāo)記之間, 物理距離為200 kb; 突變體中的基因的編碼框發(fā)生單堿基替換突變, 導(dǎo)致編碼蛋白的氨基酸被替換, 初步推測(cè)該基因可能為候選目的基因。

致謝:

重慶市黔江區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)王海翔高級(jí)農(nóng)藝師提供部分穗頸瘟標(biāo)樣, 在此感謝。

[1] Hu G, Richter T E, Hulbert S H, Pryor T. Disease lesion mimicry caused by mutations in the rust resistance gene., 1996, 8: 1367–1376

[2] 黃奇娜, 楊楊, 施勇烽, 陳潔, 吳建利. 水稻斑點(diǎn)葉變異研究進(jìn)展. 中國(guó)水稻科學(xué), 2010, 24: 108–115 Huang Q N, Yang Y, Shi Y F, Chen J, Wu J L. Recent advances in research on spotted-leaf mutants of rice ()., 2010, 24: 108–115 (in Chinese with English abstract)

[3] Lorrain S, Vailleau F, Balagué C, Roby D. Lesion mimic mutants: keys for deciphering cell death and defense pathways in plants., 2003, 8: 263–271

[4] 孫惠敏, 張春嬌, 李保同, 潘曉華. 水稻類病斑突變體的研究進(jìn)展. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 142–147 Sun H M, Zhang C J, Li B T, Pan X H. Advances of study on rice lesion mimic mutants., 2014, 30(3): 142–147 (in Chinese with English abstract)

[5] Walbot V, Hoisington D A, Neuffer M G. Disease lesion mimic mutations. In: Kosuge T, Meredith C, eds. Genetic Engineering of Plants. Plenum, New York, 1983. pp 431–442

[6] Dietrich R A, Richberg M H, Schmidt R, Dean C, Dangl J L. A novel zinc finger protein is encoded by the Arabidopsisgene and functions as a negative regulator of plant cell death., 1997, 88: 685–694

[7] Shi L Y, Lv X L, Weng J F, Zhu H Y, Liu C L, Hao Z F, Zhou Y, Zhang D G, Li M S, Ci X K, Li X H, Zhang S H. Genetic characterization and linkage disequilibrium mapping of resistance to gray leaf spot in maize (L.)., 2014, 2: 132–143

[8] Spassieva S, Hille J. A lesion mimic phenotype in tomato obtained by isolating and silencing an, homologue., 2002, 162: 543–549

[9] Xiao G Q, Zhang H W, Lu X Y, Huang R F. Characterization and mapping of a novel light-dependent lesion mimic mutantin rice (L.).2015, 14: 1687–1696

[10] 潘璐琪, 陸雯, 李小白, 吳殿星, 王雪艷. 秈稻93-11類病斑突變體的特征研究. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 29: 413–420 Pan L Q, Lu W, Li X B, Wu D X, Wang X Y. Characteristics of lesion mimic mutants fromrice 93-11., 2015, 29: 413–420 (in Chinese with English abstract)

[11] Yin Z, Chen J, Zeng L, Goh M, Leung H, Khush G S, Wang G L. Characterizing rice lesion mimic mutants and identifying a mutant with broad-spectrum resistance to rice blast and bacterial blight., 2000, 13: 869–876

[12] Chen X F, Hao L, Pan J W, Zheng X X, Jiang G H, Jin Y, Gu Z M, Qian Q, Zhai W X, Ma B J., a cell death and defense-related gene, encodes a putative splicing factor 3b subunit 3 (SF3b3) in rice., 2012, 30: 939–949

[13] Zeng L R, Qu S H, Bordeos A, Yang C W, Baraoidan M, Yan H Y, Xie Q, Nahm B H, Leung H, Wang G L., a negative regulator of plant cell death and defense, encodes a U-box/armadillo repeat protein endowed with E3 ubiquitin ligase activity., 2004, 16: 2795–2808

[14] Mori M, Tomita C, Sugimoto K, Hasegawa M, Hayashi N, Dubouzet J G, Ochiai H, Sekimoto H, Hirochika H, Kikuchi S. Isolation and molecular characterization of amutant by modified activation-tagging in rice., 2007, 63: 847–860

[15] Qiao Y, Jiang W, Lee J H, Park B S, Choi M S, Piao R, Woo M O, Roh J H, Han L, Paek N C, Seo H S, Koh H J.encodes a clathrin-associated adaptor protein complex 1, medium subunit μ1 (AP1M1) and is responsible for spotted leaf and early senescence in rice ()., 2010, 185: 258–274

[16] Wang L J, Pei Z Y, Tian Y C, He C Z. OsLSD1, a rice zinc finger protein, regulates programmed cell death and callus differentiation., 2005, 18: 375–384

[17] 陳紅霖, 向陽(yáng)海, 趙紀(jì)瑩, 尹德東, 梁國(guó)華, 翟文學(xué), 江光懷. 水稻類病變突變體的遺傳分析與目標(biāo)基因的精細(xì)定位. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39: 1148–1154 Chen H L, Xiang Y H, Zhao J Y, Yin D D, Liang G H, Zhai W X, Jiang G H. Genetic analysis and gene fine mapping of rice lesion mimic mutant, 2013, 39: 1148–1154 (in Chinese with English abstract)

[18] 鐘振泉, 羅文龍, 劉永柱, 王慧, 陳志強(qiáng), 郭濤. 一份新的水稻斑點(diǎn)葉突變體的鑒定和基因定位. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41: 861–871 Zhong Z Q, Luo W L, Liu Y Z, Wang H, Chen Z Q, Guo T. Characterization of a novel spotted leaf mutantand mapping ofgene in rice ()., 2015, 41: 861–871 (in Chinese with English abstract)

[19] Yamanouchi U, Yano M, Lin H, Ashikari M, Yamada K. A rice spotted leaf gene,, encodes a heat stress transcription factor protein., 2002, 99: 7530–7535

[20] Jiao B B, Wang J J, Zhu X D, Zeng L Z, Li Q, He Z H. A novel protein RLS1 with NB-ARM domains is involved in chloroplast degradation during leaf senescence in rice., 2012, 5: 205–217

[21] Tong X H, Qi J F, Zhu X D, Mao B Z, Zeng L J, Wang B H, Li Q, Zhou G X, Xu X J, Lou Y G, He Z H. The rice hydroperoxide lyase OsHPL3 functions in defense responses by modulating the oxylipin pathway., 2012, 71: 763–775

[22] Undan J R, Tamiru M, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Takagi H, Yoshida K, Kanzaki H, Saitoh H, Fekih R, Sharma S, Undan J, Yano M, Terauchi R. Mutation in, a gene encoding a protein with two double-stranded RNA binding motifs, causes lesion mimic phenotype and early senescence in rice (L.)., 2012, 87: 169–179

[23] Kim J A, Cho K, Singh R, Jung Y H, Jeong S H, Kim S H, Lee J, Cho Y S, Agrawal G K, Rakwal R, Tamogami S, Kersten B, Jeon J S, An G, Jwa N S. Rice(, accelerated cell death and resistance 1) is a potential positive regulator of fungal disease resistance., 2009, 28: 431–439

[24] Lin A H, Wang Y Q, Tang J Y, Xue P, Li C L, Liu L C, Hu B, Yang F Q, Loake G J, Chu C C. Nitric oxide and protein S-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide-induced leaf cell death in rice., 2012, 158: 451–464

[25] Sun C H, Liu L C, Tang J Y, Lin A H, Zhang F T, Fang J, Zhang G F, Chu C C., encoding a putative coproporphyrinogen III oxidase, is involved in lesion initiation in rice., 2011, 38: 29–37

[26] Takahashi A, Agrawal G K, Yamazaki M, Onosato K, Miyao A, Kawasaki T, Shimamoto S, Hirochika H. Rice Pti1a negatively regulates-dependent defense responses., 2007, 19: 2940–2951

[27] Fekih R, Tamiru M, Kanzaki H, Abe A, Yoshida K, Kanzaki E, Saitoh H, Takagi H, Natsume S, Undanet J R, Undan J, Terauchi R. The rice (L.) LESION MIMIC RESEMBLING, which encodes an AAA-type ATPase, is implicated in defense response., 2015, 290: 611–622

[28] Sakuraba Y, Rahman M L, Cho S H, Kim Y S, Koh H J, Yoo S C, Paek N C. The rice faded green leaf locus encodes protochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthesis under high light conditions., 2013, 74: 122–133

[29] Tang J Y, Zhu X D, Wang Y Q, Liu L C, Xu B, Li F, Fang J, Chu C C. Semi-dominant mutations in the CC-NB-LRR-type R, gene,, lead to constitutive activation of defense responses in rice., 2011, 66: 996–1007

[30] Fujiwara T, Maisonneuve S, Isshiki M, Mizutani M, Chen L T, Wong H L, Kawasaki T, Shimamoto K. Sekiguchi lesion gene encodes a cytochrome P450 monooxygenase that catalyzes conversion of tryptamine to serotonin in rice., 2010, 285: 11308–11313

[31] Chern M, Fitzgerald H A, Canlas P E, Navarre D A, Ronald P C. Overexpression of a ricehomolog leads to constitutive activation of defense response and hypersensitivity to light., 2005, 18: 511–520

[32] Zhao J Y, Liu P C, Li C R, Wang Y Y, Guo L Q, Jiang G H, Zhai W X.and, two eukaryotic translation elongation factor 1A-like gene family members, negatively affect cell death and disease resistance in rice., 2017, 44: 107–118

[33] Wang S, Lei C L, Wang J L, Ma J, Tang S, Wang C L, Zhao K J, Tian P, Zhang H, Qi C Y, Cheng Z J, Zhang X, Guo X P, Liu L L, Wu C Y, Wan J M., encoding an eEF1A-like protein, negatively regulates cell death and defense responses in rice., 2017, 68: 899–913

[34] Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes., 1987, 148: 350–382

[35] Bowling S A, Clarke J D, Liu Y D, Klessig D F, Dong X N. Themutant of Arabidopsis expresses both NPR1-dependent and NPR1-independent resistance., 1997, 9: 1573–1584

[36] Thordal-Christensen H, Zhang Z G, Wei Y D, Collinge D B. Subcellular localization of H2O2in plants. H2O2accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction., 1997, 11: 1187–1194

[37] 黃富, 程開(kāi)祿, 彭國(guó)亮, 羅慶明, 陳國(guó)華, 朱永昌. 四川省水稻品種抗稻瘟病性規(guī)范化鑒定評(píng)價(jià)體系. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 3(增刊-1): 23–26 Huang F, Cheng K L, Peng G L, Luo Q M, Chen G H, Zhu Y C. The standard evaluating system of rice resistance to blast in Sichuan province., 1998, 3(suppl-1): 23–26 (in Chinese with English abstract)

[38] 張長(zhǎng)偉, 凌英華, 桑賢春, 李平, 趙芳明, 楊正林, 李云峰, 方立魁, 何光華. 轉(zhuǎn)苦瓜幾丁質(zhì)酶基因水稻及其稻瘟病抗性. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37: 1991–2000 Zhang C W, Ling Y H, Sang X C, Li P, Zhao F M, Yang Z L, Li Y F, Fang L K, He G H. Transgenic rice lines harboringgene from Balsam Pear (L.) and their blast resistance., 2011, 37: 1991–2000 (in Chinese with English abstract)

[39] 全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組. 我國(guó)稻瘟病菌生理小種研究. 植物病理學(xué)報(bào), 1980, 10: 71–82 All China Coorporation of Research on Physiological Races of. Research on physiological races of rice blast fungus in China., 1980, 10: 71–82 (in Chinese with English abstract)

[40] International Rice Research Institute. Standard Evaluation System for Rice (SES). Los Ba?os, Philippines: IRRI, 2002. pp 14–18

[41] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues., 1985, 5: 69–76

[42] Feng B H, Yang Y, Shi Y F, Shen H C, Wang H M, Huang Q N, Xu X, Lu X G, Wu J L. Characterization and genetic analysis of a novel rice spotted-leaf mutantwith broad-spectrum resistance topv.., 2013, 55: 473–483

[43] Noutoshi Y, Ito T, Seki M, Nakashita H, Yoshida S, Marco Y, Shirasu K, Shinozaki K. A single amino acid insertion in the WRKY domain of the Arabidopsis TIR-NBS-LRR-WRKY-type disease resistance protein SLH1 (sensitive to low humidity 1) causes activation of defense responses and hypersensitive cell death., 2005, 43: 873–888

[44] Arase S, Zhao C M, Akimitsu K, Yamamoto M, Ichii M. A recessive lesion mimic mutant of rice with elevated resistance to fungal pathogens., 2000, 66: 109–116

[45] 邱結(jié)華, 馬寧, 蔣漢偉, 圣忠華, 邵高能, 唐紹清, 魏祥進(jìn), 胡培松. 水稻類病斑突變體的鑒定及其基因定位. 中國(guó)水稻科學(xué), 2014, 28: 367–376 Qiu J H, Ma N, Jiang H W, Sheng Z H, Shao G N, Tang S Q, Wei X J, Hu P S. Identification and gene mapping of a lesion mimic mutantin rice., 2014, 28: 367–376 (in Chinese with English abstract)

[46] Liu G, Wang L, Zhou Z, Leung H, Wang G L, He C. Physical mapping of a rice lesion mimic gene,, to a 70-kb segment of rice chromosome 12., 2004, 272: 108–115

Identification and Gene Mapping of a Lesion Mimic Mutantin Rice (L.)

LIU Bao-Yu, LIU Jun-Hua, DU Dan, YAN Meng, ZHENG Li-Yuan, WU Xue, SANG Xian-Chun, and ZHANG Chang-Wei*

Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crop, Chongqing 400716, China

A mutant() was screened from the progeny ofrestorer line Jinhui 10 treated with ethyl methane sulfonate (EMS). Brown lesions inexhibit on the sheath of lower leaves at the late tillering stage, then spred from the midrib to entire leaf and finally throughout the whole plant at maturity stage. Compared with the wild type, the plant height, ear length, grain number per panicle, seed setting rate and thousand-grain weight as well as the activities of protective enzymes (CAT, POD, and T-SOD) were all significantly decreased while the content of reactive oxygen species (ROS) increased in. The shading assay showed that the formation of lesions inwas induced by light. Histochemical analysis showed thathad excessive hydrogen peroxide (H2O2) deposition and programmed cell death in the position of lesions. In addition, the chlorophyll fluorescence was weaker inthan in the wild type under the fluorescence microscopy. There was no significant difference in blast resistance betweenand the wild type. Genetic analysis suggested that the phenotype ofwas controlled by a single recessive nuclear gene, which was mapped between InDel markers LR49 and LR52 on chromosome 4 with an interval of 200 kb. Sequencing analysis revealed that a single base substitution (G to T) occurred at 3449 bp in the DNA sequence of, resulting in an amino acid change from tryptophane to cysteine. The qRT-PCR results showed that the transcriptional level ofwas down-regulated in, while that of some pathogenesis-related genes was highly up-regulated when compared with the wild type.

rice; lesion mimic mutant;; gene; fine mapping

2017-05-22;

2017-11-21;

2017-12-04.

10.3724/SP.J.1006.2018.00332

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08001002-002)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08001002-002).

Corresponding author張長(zhǎng)偉, E-mail: 603519375@qq.com

E-mail: 673325435@qq.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171203.1645.002.html