段方猛 羅秋蘭 魯雪莉 齊娜偉 劉憲舜 宋雯雯, *

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玉米油菜素甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及其對逆境脅迫的響應(yīng)

段方猛1羅秋蘭2魯雪莉3齊娜偉1劉憲舜1宋雯雯1, *

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 山東青島 266109;2深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 / 深圳市海洋藻類開發(fā)與應(yīng)用工程實驗室 / 深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東深圳 518060;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 山東青島 266101

油菜素甾醇作為一類重要植物激素, 在植物生長發(fā)育和抵御逆境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用?；蚓幋a酶是其合成途徑中關(guān)鍵限速酶。本研究針對迄今有關(guān)玉米基因應(yīng)答逆境脅迫特征尚未見報道現(xiàn)狀, 采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù), 從玉米中克隆了油菜素甾醇生物合成關(guān)鍵基因(GenBank登錄號KY242373)。全長2058 bp, 開放閱讀框為1518 bp, 編碼506個氨基酸。ZmCYP90B1蛋白預(yù)測分子量為57.66 kD, 等電點為9.54, 含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域及1個p450保守結(jié)構(gòu)域。序列比對表明, ZmCYP90B1與其他物種CYP90B1蛋白高度相似, 但在單雙子葉植物中進(jìn)化上具有明顯差異。實時熒光定量PCR結(jié)果表明, 非生物脅迫(干旱、高鹽、低溫和脫落酸)、蟲害(甜菜夜蛾取食)和茉莉酸甲酯均誘導(dǎo)表達(dá), 表明該基因響應(yīng)多種非生物脅迫, 參與植物對蟲害和茉莉酸甲酯的響應(yīng)。進(jìn)一步構(gòu)建過量表達(dá)1基因的煙草株系并檢測表明該煙草株系抗旱性增強(qiáng), 葉片失水率下降, SPAD值增大。此外, 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性以及游離脯氨酸(Pro)的積累量均顯著高于野生型, 丙二醛(MDA)和脫落酸(ABA)含量明顯低于野生型。通過檢測下游脅迫響應(yīng)基因表達(dá), 表明提高植物抗旱性可能不依賴ABA途徑, 而與其對抗氧化相關(guān)途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。

油菜素甾醇;基因; 實時熒光定量PCR; 逆境脅迫

油菜素甾醇(brassionsteroids, BRs)是植物體內(nèi)一類重要的甾醇類激素。BRs不僅在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[1-3], 同時還參與植物逆境的響應(yīng)[4]。BRs可以通過改善植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)、增強(qiáng)植物體內(nèi)多種保護(hù)酶的活性、提高植物光合速率, 以及與其他激素相互作用共同調(diào)節(jié)植物在非生物脅迫下的抗性[5-6]; 生物脅迫方面, 外施BRs能夠誘導(dǎo)水稻對水稻白葉枯病菌、稻瘟病菌以及煙草花葉病毒產(chǎn)生廣譜抗性[7], 噴施EBR具有緩解番茄和黃瓜根結(jié)線蟲病害的效應(yīng)[8-9]。以上研究都僅限于外源BRs調(diào)控植物抗逆性的報道。

內(nèi)源BRs生物學(xué)功能的探索, 主要是通過基因工程技術(shù)調(diào)控BRs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量來實現(xiàn)的。在BRs的生物合成途徑中,基因編碼的酶是BRs整個生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶[10], 作用于C-22α位點的羥基化, 過量表達(dá)該基因可以有效地調(diào)控BRs的生物合成量[11-12], 進(jìn)而改善玉米[13]和擬南芥的產(chǎn)量相關(guān)的性狀[14-16], 并且增強(qiáng)了擬南芥的抗旱性[11]。此外, 高溫也可誘導(dǎo)擬南芥基因的上調(diào)表達(dá)和內(nèi)源BRs含量的增加[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)油菜基因顯著增強(qiáng)了擬南芥對干旱和真菌病原物的抗性[11]。上述報道證實了基因通過調(diào)控內(nèi)源BRs的生物合成量, 進(jìn)而作用于植物的生長發(fā)育、抵御非生物脅迫以及病原菌的侵害。

玉米()作為重要的糧食作物和工業(yè)原料, 在生長過程中不可避免地遭受逆境脅迫, 影響其產(chǎn)量和品質(zhì), 因此明確玉米BRs合成途徑關(guān)鍵基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)具有重要意義。然而, 玉米基因在逆境脅迫下的相關(guān)研究還未見報道。因此, 本研究首先采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù), 從玉米中克隆基因全長, 并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析; 通過實時熒光定量PCR, 研究基因在非生物脅迫(干旱、高鹽、低溫和脫落酸)、蟲害(甜菜夜蛾)和茉莉酸甲酯脅迫處理下的表達(dá)特性; 并通過檢測干旱脅迫前后野生型和過量表達(dá)煙草植株的生理指標(biāo)和下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量, 研究其在響應(yīng)干旱脅迫下的作用機(jī)制, 為深入研究玉米基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 選用玉米自交系LN287。將種子催芽后播種于塑料盆缽(6.7 cm × 7.0 cm)中, 每盆1粒, 置光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 溫度25°C, 濕度60%, 光照強(qiáng)度36 μmol m–2s–1, 16 h光照/8 h黑暗; 煙草(L.)品種為Havana 425。

1.1.2 昆蟲材料 選用三齡期人工飼料喂養(yǎng)的甜菜夜蛾幼蟲。

1.1.3 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體pCAMBIA3301 均由本實驗室保存。

1.1.4 試劑 RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國); SMARTer-RACE試劑盒、cDNA Synthesis試劑盒、pMD18T載體、Ex酶、Marker、SYBR Premix Ex熒光定量試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)購自Sigma公司(美國)。

1.2 材料處理

1.2.1 玉米不同組織取材 將玉米培養(yǎng)至三葉期, 分別取根、莖和葉, 研究基因在不同組織中的表達(dá)情況。

1.2.2 非生物脅迫處理 將培養(yǎng)至三葉期的玉米植株分別進(jìn)行低溫(4°C)、干旱(20% PEG-6000)、高鹽(250 mmol L–1NaCl)以及脫落酸(100 μmol L–1ABA)脅迫處理, 分別于脅迫處理0.5、1、3、6、12、16和24 h取樣。

1.2.3 蟲害處理 參照徐濤等[18]的蟲害處理方法, 在每顆玉米苗的第2片葉上接種三齡期的甜菜夜蛾幼蟲3頭, 紗網(wǎng)密封并支撐牢固, 防止甜菜夜蛾取食其他葉片。取樣時間分別為接種夜蛾后0、3、6、12、24和48 h。

1.2.4 MeJA處理 將待處理的玉米幼苗置密閉容器中, 每顆幼苗中放置一濕潤的脫脂棉, 并在其上滴入6 μL的MeJA; 取樣時間同處理1.2.3。上述處理均取玉米第3片葉片, 液氮速凍后置-80°C冰箱, 以備RNA提取之用, 以未處理的玉米健康幼苗為對照, 上述的每個處理均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 ZmCYP90B1基因的克隆

取三葉期玉米葉片約100 mg, 液氮研磨至粉末狀, 轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中, 利用試劑盒提取總RNA。根據(jù)植物基因的保守序列設(shè)計簡并引物DP-F和DP-R (表1), 擴(kuò)增基因的部分片段并測序。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計RACE的“5￠和3￠”基因特異引物(5￠-GSP和3￠-GSP)(表1), 參照RACE試劑盒SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書進(jìn)行基因 cDNA的5′和3′末端的快速擴(kuò)增并分別測序。序列拼接獲得基因全長序列, 設(shè)計全長引物FP-F和FP-R (表1), 擴(kuò)增基因的開放閱讀框(ORF), 以葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 94°C預(yù)變性5 min; 94°C變性30 s, 60°C退火30 s, 72°C延伸2 min, 30個循環(huán); 72°C延伸7 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 ZmCYP90B1基因的生物信息學(xué)分析

將預(yù)測的基因利用DNAMAN軟件分析該基因開放閱讀框, 預(yù)測基因產(chǎn)物的長度、分子量、等電點、親疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu)。將所得基因的編碼產(chǎn)物在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BlastP, 下載Subjects氨基酸序列, 應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對, 并應(yīng)用MEGA 7.0的NJ算法生成系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列的理化性質(zhì)。

表1 克隆基因所用引物

1.5 ZmCYP90B1基因的表達(dá)分析

取脅迫處理前后的樣品, 加液氮迅速研磨成粉末, 根據(jù)試劑盒的操作步驟從玉米葉片中提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA (統(tǒng)一濃度為100 ng μL–1); 基因特異性引物(表2)由Primer 5.0設(shè)計和NCBI驗證完成。

使用TaKaRa SYBR Green PCR Master Mix試劑盒, 在德國耶拿的qTOWER實時定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行熒光定量PCR, PCR體系含5 μL SYBR Premix ExII (2×)、1 μL上下游引物 (10 μmol L–1)、1 μL cDNA (100 ng μL–1)和2 μL ddH2O。PCR程序為95°C 5 min; 95°C 10 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 共35個循環(huán)。以玉米為內(nèi)參基因, 每個樣品3個平行, 3次生物學(xué)重復(fù), 采用2–ΔΔCT法分析實驗結(jié)果[19]。

1.6 過量表達(dá)ZmCYP90B1基因煙草的構(gòu)建和分子檢測

構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-, 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404, 將重組載體通過煙草葉盤轉(zhuǎn)化方法[20], 獲得過量表達(dá)基因的煙草植株。利用經(jīng)典CTAB法提取煙草基因組DNA, 采用基因的特異性引物(正向引物5′-AGCTGAC CCTGAAGTTCATCTG-3′; 反向引物5′-ACTGGGT GCTCAGGTAGTGGTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為95°C 5 min; 95°C 30 s, 62°C 30 s, 72°C 40 s, 共30個循環(huán); 72°C 5 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶, 篩選出基因組中有基因整合的煙草植株。提取野生型和T2轉(zhuǎn)基因植株的葉片RNA, 進(jìn)行基因的熒光定量PCR, 檢測和計算方法同1.5。

1.7 過量表達(dá)ZmCYP90B1基因煙草的抗旱性分析

將6周苗齡的野生型和過量表達(dá)基因的煙草植株進(jìn)行20%PEG模擬干旱脅迫, 10 h后測定抗性生理指標(biāo)。參照Du等[21]的方法測定葉片失水率; 采用SPAD-502 葉綠素儀(Konica Minolta Sensing, Japan)測定葉綠素含量; 采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性; 采用可見光分光光度法測定過氧化氫酶(CAT)活性[22]; 采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)的活性; 采用磺基水楊酸法測定游離脯氨酸(Pro)含量; 采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)的含量; 采用高效液相色譜法測定脫落酸(ABA)含量。同時采用熒光定量PCR檢測干旱脅迫前后野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)變化, 檢測和計算方法同1.5?；蚝鸵镄蛄性斠姳?。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均由3次重復(fù)實驗獲得, 應(yīng)用SPSS 16.0軟件分析差異顯著性, 運用最小顯著性差數(shù)法(LSD)進(jìn)行單因素方差分析; Duncan’s多重比對分析, 差異顯著性水平均為<0.05。

表2 熒光定量PCR所需引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCYP90B1基因的克隆

通過簡并引物擴(kuò)增得到基因部分片段, 長度為527 bp。再根據(jù)NCBI和Primer 5.0軟件對克隆得到的基因部分片段設(shè)計“5￠和3￠RACE的基因特異引物, 進(jìn)行5￠-DNA和3￠-DNA序列的克隆, 得到片段的長度分別為1311 bp和1009 bp, 二者拼接得到全長基因。根據(jù)全長序列設(shè)計特異性引物, 克隆得到基因的ORF區(qū), 長度為1843 bp。將擴(kuò)增得到的ORF區(qū)連接到pMD18-T克隆載體上, 酶切鑒定表明已被成功克隆(圖1)。

2.2 ZmCYP90B1基因的序列分析

經(jīng)克隆測序得到基因全長為2058bp, GenBank登錄號為KY242373。從玉米基因組數(shù)據(jù)庫中查找CYP90B1基因, 該基因只有1個拷貝數(shù), 位于第1染色體, 遠(yuǎn)離中心粒, 定位于染色體的一端。包含一個1518 bp的開放閱讀框, 編碼506個氨基酸。該基因編碼產(chǎn)物的分子量為57.66 kD, 等電點約為9.54, 有1個跨膜結(jié)構(gòu)域及1個p450保守結(jié)構(gòu)域(圖2), 無信號肽。

2.3 ZmCYP90B1預(yù)測的氨基酸親水性和疏水性分析

如圖3所示, 該序列的第21位亮氨酸的疏水性最強(qiáng), 其次為第20位的亮氨酸、第297位的亮氨酸和第315位的異亮氨酸; 親水性最強(qiáng)的位點是第43位的谷氨酰胺, 其次是第213位的谷氨酸。結(jié)果表明該基因編碼的蛋白為疏水性, 與圖2預(yù)測該蛋白為跨膜蛋白的結(jié)果相一致, 進(jìn)一步推測ZmCYP90B1蛋白可能是一個與信號傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

圖1 ZmCYP90B1基因擴(kuò)增結(jié)果

A:部分片段擴(kuò)增結(jié)果; B:5′-RACE擴(kuò)增結(jié)果; C:3′-RACE擴(kuò)增結(jié)果; D:的ORF區(qū)擴(kuò)增結(jié)果; E: 重組載體雙酶切鑒定結(jié)果; M1: DL2000 marker; M2: 15000 marker。

A: The part fragment amplification ofB: The 5′-RACE amplification of; C: The 3′-RACE amplification of; D: The ORF amplification of; E: The identification of recombinant vector digested by double enzymes; M1: DL2000 marker; M2: 15000 marker.

(圖2)

下畫線部分為跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸位點: 12~31; 灰色陰影部分為p450保守結(jié)構(gòu)域位點: 2~491。

The underline is the amino acid site of the transmembrane domain: 12–31; The grey shaded part is p450 conserved domain site: 2–491.

圖3 ZmCYP90B1預(yù)測的氨基酸親水性和疏水性分析

2.4 ZmCYP90B1的多序列比對

以基因預(yù)測的氨基酸序列為探針, 在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到擬南芥、小麥、水稻等植物中多個類似的蛋白, 這表明了該基因蛋白普遍存在于高等植物中。利用DNAMAN軟件將該序列與稷草(, OEL34128.1)、水稻(, XP_006649668.1)、小麥(, EMS59113.1)、擬南芥(, AAC05093.1)、大豆(, KHN36124.1)、油菜(, CDY24488.1)、棉花(, NP_001313765.1)的CYP90B1序列進(jìn)行多重比對(圖4)發(fā)現(xiàn), 玉米ZmCYP90B1與稷草和水稻CYP90B1的同源性較高, 分別達(dá)到了94%和88%。由上述植物CYP90B1蛋白的多序列比對圖可知, 該基因編碼的蛋白與其他物種的CYP90B1蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性, 暗示其功能的高度保守。

2.5 ZmCYP90B1的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI網(wǎng)站下載10種不同植物的CYP90B1氨基酸序列, 進(jìn)行CYP90B1的系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖5)表明, 單子葉植物和雙子葉植物的CYP90B1蛋白分別聚在一起。同為單子葉植物的玉米、稗草、水稻、山羊草和小麥聚在同一大的分支, 而同為雙子葉植物的6個蛋白同源物聚在另一大的分支; 在單子葉植物這一分支上, 玉米和稗草的親緣關(guān)系較近, 聚在同一分支上, 而山羊草和小麥親緣關(guān)系較近, 聚在另一分支上, 且分別向2個不同的方向進(jìn)化; 在雙子葉植物這一分支上, 擬南芥和油菜首先分化出來共同進(jìn)化, 接著煙草、大豆、棉花和可可分成相應(yīng)的3條分支后也各自進(jìn)化。

圖4 8種植物CYP90B1蛋白的多序列比對

圖5 ZmCYP90B1與其他植物CYP90B1蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析

2.6 ZmCYP90B1的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy Proteomics在線工具Protparam 分別對上述5個單子葉植物和6個雙子葉植物的CYP90B1氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析(表3)顯示, 5個單子葉植物的CYP90B1氨基酸殘基數(shù)均多于雙子葉植物同源物的殘基數(shù)(擬南芥除外); 單子葉植物的CYP90B1相對分子量集中在57~59 kD, 而雙子葉植物則分布在55~56 kD (擬南芥除外); 理論等電點最高的是單子葉植物玉米的CYP90B1蛋白(9.54), 最低的是雙子葉植物擬南芥的相關(guān)蛋白(6.62); 除擬南芥外, 其他植物CYP90B1蛋白的正電荷氨基酸比例均大于負(fù)電荷氨基酸比例; 這11種植物CYP90B1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40, 總平均親水性均小于1, 說明這11種蛋白均為不穩(wěn)定的疏水蛋白。

表3 不同植物來源的CYP90B1氨基酸理化性質(zhì)的比較

2.7 ZmCYP90B1基因的表達(dá)模式分析

2.7.1基因在不同組織中的表達(dá)

通過熒光定量PCR檢測表明,基因在不同組織中均表達(dá), 但表達(dá)量顯著不同。在根和葉片中的表達(dá)量較高, 約是莖的2倍(圖6)。

2.7.2基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式 低溫(4°C)、干旱(20% PEG-6000)、高鹽(250 mmol L–1NaCl)以及脫落酸(100 μmol L–1ABA)處理均可誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化(圖7)。低溫脅迫導(dǎo)致基因的表達(dá)量在前3 h降低, 但在第6 h時顯著上調(diào), 隨后降低再升高。在PEG-6000脅迫處理0.5 h時,基因的表達(dá)量就開始顯著升高, 在第3 h達(dá)到最大, 隨著脅迫時間的延長, 其表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢?；蛟贏BA脅迫下的表達(dá)模式與其在高鹽脅迫下類似, 分別在第6和第12 h的表達(dá)量升至最高, 之后明顯下降?？偠灾?基因在不同脅迫條件下的差異表達(dá)揭示了該基因以不同的方式響應(yīng)各種非生物脅迫。

圖6 ZmCYP90B1基因在不同組織中的相對表達(dá)水平

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

圖7 ZmCYP90B1在非生物脅迫下的表達(dá)模式

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

2.7.3基因在蟲害和茉莉酸甲酯脅迫下的表達(dá)模式 甜菜夜蛾取食和MeJA處理均可誘導(dǎo)玉米葉片基因的表達(dá)。甜菜夜蛾取食3 h后, 該基因表達(dá)量有所下降, 但變化不明顯。隨著取食時間的延長, 該基因的表達(dá)量顯著上升, 到12 h后達(dá)到最高, 是對照的3.5倍。隨后其表達(dá)量逐漸下降, 但都顯著高于對照; MeJA處理下基因的表達(dá)趨勢同甜菜夜蛾危害下的趨勢類似, 都是在處理的3 h后表達(dá)量下降, 而且MeJA處理下的變化顯著。但隨著處理時間的延長, MeJA對該基因的表達(dá)同對照相比, 無明顯的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果表明MeJA 處理6 h后對基因表達(dá)有一定誘導(dǎo)作用, 但誘導(dǎo)效應(yīng)沒有達(dá)到蟲害誘導(dǎo)的水平。

2.7.4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測 剪取煙草葉片, 提取基因組DNA, 采用載體上的GFP基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)目的條帶, 大小為492 bp (圖9), 表明基因已經(jīng)成功整合到煙草基因組中。提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片RNA, 進(jìn)行基因的RT-PCR檢測表明,基因能夠在煙草中正常轉(zhuǎn)錄。

圖8 ZmCYP90B1在甜菜夜蛾取食和茉莉酸甲酯下的表達(dá)模式

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

圖9 轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子鑒定

M: marker; P: 陽性質(zhì)粒; N: 空載體; W: 雙蒸水; WT: 野生型; 1~10: 轉(zhuǎn)基因株系。

M: marker; P: positive plasmid; N: empty vector; W: double distilled water; WT: wild types; 1–10: transgenic lines.

2.7.5 過量表達(dá)基因煙草植株的抗旱性表型鑒定 選取L4和L9這2個轉(zhuǎn)基因株系來進(jìn)一步分析基因在干旱脅迫下的功能。將6周苗齡的野生型和轉(zhuǎn)基因株系用20% PEG處理10 h, 發(fā)現(xiàn)野生型煙草植株葉片嚴(yán)重萎蔫, 而過量表達(dá)株系的葉片只出現(xiàn)輕度萎蔫(圖10-A)。葉片失水率野生型顯著高于過量表達(dá)株系(圖10-B); 干旱脅迫前, 野生型和過量表達(dá)株系的SPAD值差異不明顯; 干旱脅迫后, 過量表達(dá)株系的SPAD值均顯著高于野生型(圖10-C)。說明在干旱脅迫下過量表達(dá)株系比野生型含有更高的葉綠素。以上結(jié)果表明了過量表達(dá)基因的煙草植株具有較強(qiáng)的抗旱性。

圖10 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株在干旱脅迫下的功能鑒定

A: 干旱脅迫前野生型和轉(zhuǎn)基因株系(L4和L9)的表型; B: 20% PEG處理10 h后野生型和轉(zhuǎn)基因株系(L4和L9)的表型; C: 20% PEG處理10 h后野生型和轉(zhuǎn)基因株系(L4和L9)的葉片失水率; D: 20% PEG處理前后野生型和轉(zhuǎn)基因株系(L4和L9)的SPAD值。圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

A: The phenotype of WT and transgenic lines (L4 and L9) before drought stress; B: The phenotype of WT and transgenic lines (L4 and L9) after 20% PEG treatment for 10 h; C: The water loss rate of WT and transgenic lines (L4 and L9) after 20% PEG treatment for 10 h; D: The SPAD value of WT and transgenic lines (L4 and L9) before and after 20% PEG treatment. The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

2.7.6 抗性生理指標(biāo)的檢測 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化酶SOD、CAT和POD活性在正常澆水條件下差異不明顯; 干旱脅迫10 h誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因煙草的SOD和POD活性顯著升高, 兩個轉(zhuǎn)基因株系(L4和L9)分別高于野生型SOD活性的41.51%、50.65%, POD活性的24.50%、26.44%; 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的CAT活性在干旱脅迫后均顯著下降, 但是轉(zhuǎn)基因煙草的CAT活性明顯高于野生型, 是其2倍之多。

干旱脅迫前, Pro、MDA和ABA在野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中的含量均無明顯差異; 而干旱脅迫10 h后, 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的Pro含量均上升, 但后者顯著高于前者38.97%和43.14%; 干旱處理誘導(dǎo)了野生型MDA含量的顯著提高, 而轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量明顯低于野生型; 野生型的ABA含量在干旱脅迫后顯著增加, 轉(zhuǎn)基因株系的ABA含量雖略有增加, 但是明顯低于野生型的ABA含量(圖11)。

2.7.7 下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析 干旱脅迫后, 轉(zhuǎn)基因煙草中的6個脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量均上調(diào)。同野生型煙草相比, 轉(zhuǎn)基因煙草中的抗氧化酶基因(、和)、逆境響應(yīng)蛋白關(guān)鍵酶基因(和)的表達(dá)倍數(shù)顯著增加, 而ABA生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平變化不明顯(圖12)。

圖11 干旱脅迫前后野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

圖12 干旱脅迫前后脅迫相關(guān)基因的表達(dá)

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

The different lowercase letters in each column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

3 討論

BRs在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和非生物脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]?；蛴址Q基因, 其編碼的酶所催化的步驟是BRs整個生物合成途徑的限速步驟[11]。已證實基因調(diào)控玉米和擬南芥的生長發(fā)育, 同時參與擬南芥、油菜等植物對非生物脅迫響應(yīng)。但是關(guān)于玉米基因是否響應(yīng)非生物脅迫、抵抗蟲害脅迫的關(guān)系及其依賴的信號通路尚未明確。

3.1 獲得了更完整的ZmCYP90B1基因5′和3′端序列

本研究從玉米中克隆的基因全長2058 bp, ORF區(qū)為1518 bp, 編碼506個氨基酸。而申強(qiáng)[13]從玉米中克隆得到基因, 基因片段全長為1634 bp, ORF區(qū)為1524 bp, 編碼508個氨基酸。Liu等[23]克隆的基因ORF區(qū)為1515 bp, 編碼505個氨基酸。出現(xiàn)這種差異的原因歸結(jié)為兩點。一是選取的玉米自交系不同, 申強(qiáng)和Liu等選用的自交系分別是玉米自交系319和玉米自交系X178, 本研究選用的是玉米自交系LNH613。選材的不同可能導(dǎo)致不同品種的ORF區(qū)大小不一致。二是克隆基因使用的方法不同。申強(qiáng)和Liu等僅僅采用RT-PCR技術(shù); 而本研究利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù), 更完整地獲得了該基因的5￠和3￠端序列; 本次得到的全長基因比申強(qiáng)克隆的基因多出了5￠非編碼區(qū)126 bp堿基和3￠非編碼區(qū)298 bp堿基, 這為以后深入研究對該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明玉米的ZmCYP90B1與來自稗草、水稻、山羊草、小麥等的單子葉植物的CYP90B1親緣關(guān)系密切, 其次是擬南芥、油菜、大豆、可可、棉花等雙子葉植物的CYP90B1, 而單、雙子葉植物的CYP90B1蛋白分別聚在一起, 表明CYP90B1蛋白在單子葉作物和雙子葉植物的進(jìn)化上產(chǎn)生了明顯差異。

3.2 ZmCYP90B1基因響應(yīng)多種非生物脅迫并且過量表達(dá)該基因顯著提高煙草抗旱性

基因在植物抵御非生物脅迫的過程中具有重要的作用[11,24]。但是該基因在玉米中的這一作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)低溫、干旱、ABA和高鹽均誘導(dǎo)該基因的表達(dá)變化, 尤其以PEG和高鹽脅迫下的變化更為明顯, 這和王陽等[25]發(fā)現(xiàn)擬南芥基因提高煙草植株抗旱和耐鹽性的結(jié)果一致, 表明該基因可能在參與干旱和高鹽的脅迫中起重要作用。

玉米基因應(yīng)答非生物逆境隨時間進(jìn)程多呈雙峰曲線, 即低-高-低-高等表達(dá)模式, 由此我們可以推測該基因編碼的酶和催化合成的產(chǎn)物(油菜素內(nèi)酯, BL)之間可能存在反饋調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。當(dāng)該基因在最初受到非生物脅迫時, 其表達(dá)量逐漸增加(由低到高), 對應(yīng)的酶活力增強(qiáng), 使得BL含量升高。然而, 當(dāng)BL積累到一定程度, 開始負(fù)調(diào)控該基因的表達(dá), 導(dǎo)致其表達(dá)量下降(低)。隨著脅迫時間的延長, 植株受到非生物脅迫的影響嚴(yán)重, 體內(nèi)的BL含量也隨之減少, 對該基因的負(fù)調(diào)控作用減弱, 其表達(dá)量再次升高(高)。上述過程循環(huán)往復(fù)直至基因的轉(zhuǎn)錄水平和BL的含量達(dá)到動態(tài)平衡。這一推測還需要同時對二者進(jìn)行量化檢測來證實。

玉米基因的非生物脅迫結(jié)果表明,該基因在干旱脅迫下表達(dá)量的改變最為顯著, 為了進(jìn)一步驗證該基因的抗旱生理功能, 我們將該基因在煙草中過量表達(dá), 通過檢測干旱脅迫前后野生型和過量表達(dá)基因煙草植株的生理指標(biāo)和下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)變化, 深入探究該基因的作用機(jī)制。眾所周知, 植物在遭受干旱脅迫的損傷中, 進(jìn)化出復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng), 即SOD、CAT和POD等, 保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫[26]。本研究發(fā)現(xiàn), 干旱脅迫下的轉(zhuǎn)基因煙草SOD、CAT和POD活性顯著高于野生型, 這一結(jié)果同、和酶基因的顯著上調(diào)結(jié)果相一致, 表明這3個酶活性的升高是基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控對應(yīng)酶基因的表達(dá)量而實現(xiàn)的, 從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下的抗氧化能力。

為了深入揭示基因提高煙草抗旱性的作用途徑, 我們檢測了干旱脅迫前后野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的ABA含量, 值得注意的是轉(zhuǎn)基因煙草的ABA含量在干旱脅迫后雖有增加, 但并不顯著, 這同調(diào)節(jié)ABA生物合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平變化不明顯的結(jié)果相符合, 表明基因提高煙草抗旱性并不是通過依賴ABA的調(diào)節(jié)途徑實現(xiàn)的, 而基因是BRs生物合成的關(guān)鍵酶基因, 推測基因的過量表達(dá), 提高了煙草的BRs生物合成量, 從而增加了植物的抗旱性。這與Divi等[24]的研究結(jié)果相符: ABA不參與BRs調(diào)控植物的抗逆性。

3.3 ZmCYP90B1基因響應(yīng)蟲害和茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)表達(dá)

蟲害誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御作用已在雙子葉植物及其害蟲相互作用的研究中證實[27-28], 同時證實茉莉酸信號途徑在其中起信息傳遞作用[29]。但在單子葉植物玉米中是否具有相似的調(diào)控模式尚未明確。而且BRs對植物防御物質(zhì)的誘導(dǎo)作用是否與茉莉酸信號途徑有關(guān)還需要證實。本研究通過熒光定量PCR分析表明, 受蟲害誘導(dǎo)表達(dá)的BRs生物合成關(guān)鍵酶基因同時受MeJA的誘導(dǎo), 并首次揭示了內(nèi)源BRs生物合成關(guān)鍵酶基因參與植物對蟲害的響應(yīng), 可為研究內(nèi)源BRs抵御蟲害這一新功能和MeJA誘導(dǎo)蟲害應(yīng)答的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從玉米中克隆了油菜素甾醇生物合成關(guān)鍵基因, 并對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。序列比對表明, ZmCYP90B1在單雙子葉植物中進(jìn)化上具有明顯差異。該基因響應(yīng)多種非生物脅迫, 參與植物對蟲害和茉莉酸甲酯的響應(yīng)。過量表達(dá)基因煙草株系的抗旱性增強(qiáng), 葉片失水率下降, SPAD值增大, SOD、CAT和POD的活性以及游離Pro的積累量均顯著高于野生型, MDA和ABA含量明顯低于野生型。結(jié)合下游脅迫響應(yīng)基因的差異表達(dá), 表明提高植物抗旱性可能不依賴ABA途徑, 而與其對抗氧化途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。

[1] Arteca J M, Arteca R N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grownplants., 2001, 112: 104–112

[2] Hu Y X, Bao F, Li J Y. Promotive effect of brassinosteroids on cell division involves a distinct CycD3-induction pathway in., 2000, 24: 693–701

[3] Yu J Q, Huang L F, Hu W H,Zhou Y H, Mao W H, Nogués S. A role for brassinosteroids in the regulation of photosynthesis in., 2004, 55: 1135–1143

[4] Divi U K, Krishna P. Brassinosteroid: a biotechnological target for enhancing crop yield and stress tolerance., 2009, 26: 131–136

[5] Kurepin L V, Qaderi M M, Back T G, Reid D M, Pharis R P. A rapid effect of applied brassinolide on abscisic acid concentrations inleaf tissue subjected to short-term heat stress., 2008, 55: 165–167

[6] El-Mashad A A A, Mohamed H I. Brassinolide alleviates salt stress and increases antioxidant activity of cowpea plants ()., 2012, 249: 625–635

[7] Nakashitaetal H, Yasuda M, Nitta T, Asami T, Fujioka S, Arai Y, Sekimata K, Takatsuto S, Yamaguchi I, Yoshida S. Brassinosteroid function in a broad range of disease resistance in tobacco and rice., 2003, 33: 887–898

[8] 李艷楠. 油菜素內(nèi)酯處理對番茄根結(jié)線蟲的防治效果研究. 河南科技大學(xué)碩士學(xué)位論文, 河南洛陽, 2012 Li Y N. The Research of Control Effects of Brassinosteroids Treatment on Tomato Root-knot Nematode Caused by. MS Thesis of Henan University of Science and Technology, Luoyang, China, 2012 (in Chinese with English abstract)

[9] 張丹丹. 油菜素內(nèi)酯提高黃瓜對根結(jié)線蟲抗性的機(jī)制研究及田間效應(yīng). 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文, 浙江杭州, 2012 Zhang D D. Field Effect and Molecular Mechanisms of Brassinosteroids-increased the Resistance to Root-knot Nematode in. MS Thesis of Zhejiang University, Hangzhou, China, 2012 (in Chinese with English abstract)

[10] 孫超, 黎家. 油菜素甾醇類激素的生物合成、代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo). 植物生理學(xué)報, 2017, 53: 291–307 Sun C, Li J. Biosynthesis, catabolism, and signal transduction of brassinosteroids., 2017, 53: 291–307 (in Chinese with English abstract)

[11] Sahni S, Prasad B D, Liu Q, Grbic V, Sharpe A, Singh S P, Krishnaa P. Overexpression of the brassinosteroid biosynthetic geneinsimultaneously increases seed yield and stress tolerance., 2016, 6: 28298

[12] Shimada Y, Fujioka S, Miyauchi N, Kushiro M, Takatsuto S, Nomura T, Yokota T, Kamiya Y, Bishop G J, Yoshida S. Brassinosteroid-6-oxidases fromand tomato catalyze multiple C-6 oxidations in brassinosteroid biosynthesis., 2001, 126: 770–779

[13] 申強(qiáng). 過量表達(dá)基因改良玉米產(chǎn)量性狀的研究. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 山東泰安, 2011 Shen Q. Overexpression ofImproves Yield Traits in Maize. MS Thesis of Shandong Agricultural University, Tai’an, China, 2011 (in Chinese with English abstract)

[14] Choe S, Fujioka S, Noguchi T, Takatsuto S, Yoshida S, Feldmann K A. Overexpression ofin the brassinosteroid biosynthetic pathway results in increased vegetative growth and seed yield in., 2001, 26: 573–582

[15] 武海軍, 司建萍, 王新宇. 胡楊基因的克隆及其在擬南芥中的異源表達(dá)和功能分析. 見: 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會主編. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會論文摘要集. 湖北武漢: 2013. p 247 Wu H J, Si J P, Wang X Y. Cloning of thegene from, its heterologous expression and functional analysis in. In: Chinese Academy of Cell Biology, eds. Proceedings of Academic Conference of Chinese Academy of Cell Biology in 2013. Wuhan, China, 2013. p 247 (in Chinese)

[16] Wu C Y, Trieu A, Radhakrishnan P, Kwok S F, Harris S, Zhang K, Wang J L, Wan J M, Zhai H Q, Takatsuto S, Matsumoto S, Fujio-ka S, Feldmann K A, Pennella R I. Brassinosteroids regulate grain filling in rice., 2008, 20: 2130–2145

[17] Maharjan P M, Schulz B, Choe S. BIN2/DWF12 antagonistically transduces brassinosteroid and auxin signals in the roots of., 2011, 54: 126–134

[18] 徐濤, 王建斌, 洛世明. 玉米o(hù)xylipins信號途徑關(guān)鍵基因的克隆及其在蟲害誘導(dǎo)防御中的作用. 科學(xué)通報, 2005, 50: 2217–2225Xu T, Wang J B, Luo S M. Cloning of key genes involved in oxylipins signaling pathway and their roles in insect induced defense in maize., 2005, 50: 2217–2225 (in Chinese)

[19] Xu F, Zhao Y X, Wang F, Guo D L, Wei Y L, Huang X Z. Cloning of a vacuolar H+-pryophosphatase gene from emphemeral plant olimarabidopsispumila whose overexpression improve salt tolerance in tobacco., 2013, 12: 6817–6825

[20] Horsch R, Fry J, Hoffmann N, Eichholtz D, Rogers S A, Fraley R. A simple and general method for transferring genes into plants., 1985, 227: 1229–1231

[21] Du H, Wang N, Cui F, Li X, Xiao J, Xiong L. Characterization of the beta-carotene hydroxylase geneconferring drought and oxidative stress resistance by increasing xanthophylls and abscisic acid synthesis in rice., 2010, 154: 1304–1318

[22] 蒼晶, 趙會杰. 植物生理學(xué)實驗教程. 北京: 高等教育出版社, 2013. pp 151–153 Cang J, Zhao H J. Experimental Guide of Plant Physiology. Beijing: Higher Education Press, 2013. pp 151–153 (in Chinese)

[23] Liu T, Zhang J, Wang M, Wang Z, Li G, Qu L, Wang G. Expression and functional analysis of, an ortholog offrom maize (L.)., 2007, 26: 2091–2099

[24] Divi U K, Krishna P. Overexpression of the brassinosteroid biosynthetic geneinseeds overcomes abscisic acid-induced inhibition of germination and increases cold tolerance in transgenic seedlings., 2010, 29: 385–393

[25] 王陽, 陳永富, 常曉涵, 王璇, 李娜, 高永峰. 異源過量表達(dá)胡楊基因提高煙草對非生物脅迫的耐性. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2017, 36: 4242–4249 Wang Y, Chen Y F, Chang X H, Wang X, Li N, Gao Y F. He-terologous expression of() enhanced tolerance to abiotic stress in tobacco plants., 2017, http://kns.cnki.net/kcms/detail/45.1369.Q.2017 0223.1839.004.hyml (in Chinese with English abstract)

[26] Miller G, Suzuki N, Ciftci-Yilmaz S, Mittler R. Reactive oxygen species homeostasis and signaling during drought and salinity stresses., 2010, 33: 453–457

[27] Kessler A, Baldwin I T. Plant response to insect herbivory: The emerging molecular analysis., 2002, 53: 299–328

[28] Ryan C A. The systemin signaling pathway: differential activation of plant defensive genes., 2000, 1477: 112–121

[29] Li L, Li C, Lee G I, Howe G A. Distinct roles for jasmonate synthesis and action in the systemic wound response of tomato., 2002, 99: 6416–6421

Cloning of the Key Genein Brassinosteroids Biosynthesis fromand Its Response to Adversity Stresses

DUAN Fang-Meng1, LUO Qiu-Lan2, LU Xue-Li3, QI Na-Wei1, LIU Xian-Shun1, and SONG Wen-Wen1,*

1College of Plant Health and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China;2Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource and Eco-environmental Science / Shenzhen Engineering Laboratory of Marine Algal Biotechnology / College of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong, China;3Tobacco Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Brassinosteroids (BRs) as an important phytohormone, play essential roles in plant growth, development and responses to adversity stresses. The key enzyme encoded byis involved in the BRs biosynthesis. However, the characteristic ofgene response to stress has not been reported in maize. In this study, we clonedgene from, GenBank accession number KY242373,via RT-PCR in combination of RACE technique. The full-length sequence of this gene is 2058 bp and the the complete open reading frame is 1518 bp, encoding 506 amino acid peptides. The predicted protein has the molecular weight of 57.66 kD and isoelectric point of 9.54, containing one transmembrane domain and one conserved domain of p450. Multiple sequences alignment analysis indicated the predicted protein shared high similarities with CYP90B1 from other plant species. The phylogenetic tree revealed a notable difference in the evolution of CYP90B1 between dicotyledons and monocotyledons. The qRT-PCR result showed that the expression ofwas induced by drought, high salt, low temperature, ABA,attack, and methyl jasmonate (MeJA), suggesting thatwas involved in various abiotic stresses, insect resistance and response to MeJA. Overexpressingin tobacco seedlings could enhance drought resistance with less water loss rate and higher SPAD value in the transgenic lines. In addition, the activities of SOD, CAT, and POD and the content of proline increased significantly in all transgenic tobacco lines than in the wild type; both MDA and ABA contents were obviously lower in the transgenic lines than in the wild type. Through expression analysis of the down-stream stress-responsive genes, we demonstrated that drought tolerance enhancement by overexpressingmight be involved in ABA-independent pathway and related to transcriptional regulation of antioxidant- related genes.

brassionsteroids;gene; real-time quantitative PCR; adversity stresses

2017-07-05;

2017-11-21;

2017-12-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.00343

本研究由青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(16-5-1-54-jch), 山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2013CQ028), 深圳市科技計劃項目(JCYJ2015 0324141711583)和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)博士基金項目(663/1111316)資助。

This study was supported by Qingdao Applied Basic Research Project (16-5-1-54-jch), Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2013CQ028), Shenzhen Grant Plan for Science & Technology (JCYJ20150324141711583), and the Doctor Program of Higher Education (663/1111316).

Corresponding author宋雯雯, E-mail: songwenwen2002@163.com

E-mail: fmduan@hotmail.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171218.0926.014.html