梁小娟，徐海霞，李 瑞，張朋朋，徐永杰*

(1. 信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，信陽 464000； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3. 信陽師范學(xué)院大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院，信陽 464000)

c-Src作為非受體型酪氨酸蛋白激酶的一員，能專一性磷酸化蛋白底物中的Tyr殘基，幾乎存在于所有多細胞動物體內(nèi)。c-Src蛋白的結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守，主要包含N末端的肉豆蔻酰基的膜結(jié)合序列、2個介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域(SH3和SH2)、1個保守的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(PTK)以及負責(zé)調(diào)控c-Src激酶活性的C-末端[1]。SH3可以與富含脯氨酸序列的靶蛋白互作，影響靶蛋白的結(jié)合與定位，同時對c-Src自身的催化能力的調(diào)節(jié)有重要作用；SH2能識別并結(jié)合含磷酸化酪氨酸的短序列，是c-Src蛋白調(diào)控磷酸化酪氨酸信號通路的重要元件[2-3]。SH2和SH3結(jié)構(gòu)域以及自身的Tyr416/527磷酸化一起調(diào)節(jié)c-Src的催化活性。在正常細胞和腫瘤細胞中，c-Src直接與多種生長因子、細胞因子、激素受體以及涉及細胞黏附和遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和激活劑發(fā)生作用，參與激活或抑制p38 MAPK、Grb2-Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K/AKT、FAX-paxillin-p130-Cas以及STAT等信號通路，調(diào)節(jié)細胞生長、骨架改變、分化、生存、黏附以及遷移等[4-7]。

hnRNPK (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)是一個多功能蛋白，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、特定mRNA的翻譯，或作為支架蛋白整合不同信號傳導(dǎo)通路的信號級聯(lián)，在骨骼肌發(fā)育過程中亦起著重要作用[8-10]。hnRNPK蛋白主要包含3個可以結(jié)合RNA或DNA的KH (K-homology domain)結(jié)構(gòu)域和1個與蛋白質(zhì)結(jié)合的KI (K protein interactive region)結(jié)構(gòu)域，而在N端和C端分別有1個NLS(Nuclear localization sequence)和KNS(Nuclear shuttling domain)結(jié)構(gòu)域[11]。在這些結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)下，hnRNPK可以在核與胞漿間穿梭，通過與RNA、DNA及蛋白質(zhì)的相互作用而參與多個細胞過程，在生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[12-14]。其中，hnRNPK蛋白KI結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸富集區(qū)(RXXPXXP和PXXPXR)可以特異地與SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，尤其是酪氨酸激酶Src家族蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域，從而影響激酶活性[15]；而c-Src能磷酸化hnRNPK位于KH3結(jié)構(gòu)域上的Tyr458位點，磷酸化后將阻礙KH3結(jié)構(gòu)域與RNA‘UCCC’Motif 的結(jié)合，從而影響其對mRNA翻譯水平的調(diào)控[16]。因此，hnRNPK蛋白和c-Src蛋白間的相互作用對二者生物學(xué)功能有著重要影響。

目前，關(guān)于豬hnRNPK和c-Src蛋白的研究還很少，本研究分離克隆豬hnRNPK和c-Src基因，利用酵母雙雜交和GST-Pull down技術(shù)從體內(nèi)外研究它們的互作關(guān)系，為進一步揭示hnRNPK和c-Src在豬中的分子功能提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組織樣品：淮南豬6月齡背最長肌組織，樣品放入RNase Free的1.5 mL離心管中后迅速投于液氮中，而后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株：E.coliDH5α、E.coliBL21和酵母AH109菌株由本實驗室保存。

載體：酵母雙雜交載體(pGBKT7 BD 和pGADT7 AD)、酵母雙雜交陽性對照載體(pGBKT7 BD-p53和pGADT7 AD-SV40)、酵母雙雜交陰性對照載體(pGBKT7 BD-lam和pGADT7 AD-SV40)和GST pull-down 載體(pGEX-6p1 和pET28a)為本實驗室保存。

試劑：構(gòu)建載體所需限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；Glutathione MagBeads、Ni-Chraged Magbeads購自南京金斯瑞生物科技有限公司；鮭魚精DNA、聚乙二醇3350購自Sigma公司；一抗(hnRNPK、c-Src和GST)購自Santa Cruz公司；HPR標(biāo)記的二抗、BeyoECL Plus購自碧云天公司。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法(RNAiso Plus，TaKaRa，No. 9109 ) 從肌肉提取RNA，用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(No. 6110A)對提取的RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參照說明書進行。

1.3 利用PCR和酶切連接法構(gòu)建酵母雙雜交質(zhì)粒

通過對GenBank公布的豬c-Src基因(XM_021077973.1)和hnRNPK基因(XM_021064018.1)的mRNA序列進行分析，用 Premier 5.0 軟件設(shè)計1對引物(pGBKT7-hnRNPK，表1)用于擴增豬hnRNPK基因的完整編碼區(qū)，設(shè)計5對引物(表1)用于擴增豬c-Src基因的完整編碼區(qū)及不同結(jié)構(gòu)域缺失片段。根據(jù)酵母質(zhì)粒載體pGPBKT7與pGADT7上的限制性酶切位點，擴增hnRNPK基因，引物上下游分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點；而擴增c-Src基因引物上下游分別加入EcoR I和XhoI酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、雙酶切后分別克隆至pGBKT7及pGADT7中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。菌液 PCR 篩選陽性克隆并測序驗證，獲得序列正確的載體質(zhì)粒即為重組載體pGBKT7-hnRNPK、pGADT7-c-Src、pGADT7-ΔSH3、pGADT7-ΔSH2、pGADT7-ΔPTKc和pGADT7-SH3。

1.4 利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建GST pull-down質(zhì)粒

對c-Src和hnRNPK基因序列進行分析，與酵母雙雜交相同，均采用編碼區(qū)作為插入目的片段，用 Premier 5.0 軟件設(shè)計1對引物(pET28a-hnRNPK，表1)用于擴增豬hnRNPK基因的完整編碼區(qū)，設(shè)計5對引物(表1)用于擴增豬c-Src基因的完整編碼區(qū)及不同結(jié)構(gòu)域缺失片段(引物同酵母雙雜交pGADT7質(zhì)粒構(gòu)建)。根據(jù)GST pull-down所需質(zhì)粒pET28a和pGEX-6p1的限制性酶切位點，擴增hnRNPK基因，引物上下游分別加入BamH I和XhoI酶切位點，而擴增c-Src基因引物上下游分別加入EcoR I和XhoI酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后雙酶切并克隆至pET28a和pGEX-6p1中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α中，菌液PCR篩選陽性克隆并測序驗證，獲得序列正確的載體質(zhì)粒即為重組載體pET28a-hnRNPK與pGEX-6p1-c-Src、pGEX-6p1-ΔSH3、pGEX-6p1-ΔSH2、pGEX-6p1-ΔPTKc和pGEX-6p1-SH3。

1.5 酵母雙雜交檢測

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast Two-hybrid System，Y2H)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別融合到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子(如GAL4等)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(Transcription-activating domain，AD)上，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，是一種在活細胞體內(nèi)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的有效方法[17-19]。采用醋酸鋰法制備酵母AH109感受態(tài)細胞，首先從凍存的酵母菌種刮取接種于YPDA(全營養(yǎng)培養(yǎng)基)平板培養(yǎng)，挑單個菌落接種于3 mL YPDA培養(yǎng)基中，30 ℃，200～220 r·min-1培養(yǎng)8 h；然后接5 μL培養(yǎng)物于50 mL YPDA培養(yǎng)基中，30 ℃，200～220 r·min-1培養(yǎng)16～20 h；OD600 nm達到0.2～0.3后，離心收集細胞并重懸浮于100 mL YPDA，然后30 ℃，200～220 r·min-1培養(yǎng)3～5 h；OD600 nm達到0.4～0.6，離心收集細胞，用60 mL滅菌水重懸，然后再次離心收集并重懸于3 mL 1.1×TE-LiAc中，轉(zhuǎn)入離心管，高速短暫離心15 s，重新懸浮于600 μL 1.1×TE-LiAc中，即為酵母感受態(tài)細胞。

表1 載體構(gòu)建引物信息

Table 1 Primers used for vector construction

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物大小/bpProductsizepET28a-hnRNPKF:CGGGATCCATGGAAACGGAACAACCAGAR:CCGCTCGAGTTAGAATCCTTCAACATCTG581392pGBKT7-hnRNPKF:CGGAATTCATGGAAACGGAACAACCGGAR:CGGGATCCTTAGAATCCTTCAACATCTG581392c-SrcF:CGGAATTCATGGGCAGCAACAAGAGCAAGR:CCGCTCGAGCTATAGGTTCTCTCCGGGCT601629c-Src-ΔSH3F:CGGAATTCATGGACTCCATCCAAGCTGAGR:CCGCTCGAGCTATAGGTTCTCTCCGGGCT601182c-Src-ΔSH2F:CGGAATTCATGTGCCCCACGTCCAAGCCGR:CCGCTCGAGCTATAGGTTCTCTCCGGGCT60870c-Src-ΔPTKcF:CGGAATTCATGGGCAGCAACAAGAGCAAGR:CCGCTCGAGCTAGGCATCCTTGGCCAGG60804SH3F:CGGAATTCATGACCTTTGTAGCCCTCTATR:CCGCTCGAGCTAGGAAGGTGCCACGTAGT60168

下劃線表示添加的限制性酶切位點

The underlines are the sites of restriction enzyme digestion

利用PEG-LiAc法轉(zhuǎn)化AH109細胞，在1.5 mL離心管中加入0.1 μg質(zhì)粒DNA、0.1 mg蛙魚精DNA、0.1 mL酵母感受態(tài)細胞和0.6 mL PEG-LiAc溶液，混合均勻；30 ℃水浴30 min，然后加入70 μL DMSO，輕輕混勻，42 ℃水浴熱激15 min后，12 000 r·min-1離心15 s，去上清，加入1 mL YPDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)60 min；再次12 000 r·min-1離心15 s，去上清，加入1 mL無菌水懸浮細胞，取100 μL細胞懸液平鋪于相應(yīng)的SD選擇性培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d；挑取單克隆并接種于5 mL液體雙缺培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)至OD600 nm=1.0，3 000 r·min-1離心5 min收集酵母菌體，加入1 mL無菌水重懸，測定OD600 nm值，并根據(jù)具體濃度將其稀釋到OD600 nm=1.0；最后將酵母菌液按10-1、10-2和10-3濃度梯度稀釋，并將不同濃度的酵母菌液滴在雙缺和四缺SD培養(yǎng)基上，30 ℃生長4～5 d。根據(jù)酵母生長情況判斷其自激活活性及蛋白之間的相互作用，而后進一步通過檢測β-半乳糖苷酶活性來檢測相互作用的強弱。

1.6 GST pull-down檢測

GST pull-down(GST融合蛋白沉降技術(shù))是靶蛋白與GST融合表達，利用GST對谷胱甘肽(GSH)偶聯(lián)磁珠的親和性，將GST融合蛋白固化在谷胱甘肽親和樹脂上，經(jīng)層析從目的蛋白溶液中捕獲與之相互作用的蛋白，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，是體外研究蛋白質(zhì)互作的主要手段[20]。融合蛋白的提取，將在16或37 ℃用100 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達8 h的細菌培養(yǎng)物于5 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，收集細胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS重新懸浮細胞，然后5 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，收集細胞；把細胞放于-80 ℃凍1 h，再解凍細胞，用預(yù)冷的PBS重懸，然后超聲波破碎，直到細胞不黏稠；12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，將上清移到一個新的預(yù)冷的離心管，用預(yù)冷的PBS重懸沉淀物；最后將等量的10 μL樣品(可溶的和難溶的)，加等量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，用于SDS-PAGE分析。

融合蛋白的純化(親和層析法)，用前先把磁珠(Glutathione MagBeads或Ni-Chraged Magbeads)溶液混勻，取100 μL磁珠加入1.5 mL離心管，再加入1 mL PBS，上下顛倒混勻，用磁性分離架分離磁珠，棄上清液，重復(fù)此步驟3次以上；然后向離心管加入100 μL PBS重懸磁珠，再加入50～1 000 μL提取的蛋白樣品溶液，室溫振蕩孵育1 h后用磁性分離架分離磁珠；再加入1 mL PBS，充分混勻，磁性分離架分離磁珠，重復(fù)此步驟3次；最后向離心管中加入100 μL谷胱甘肽洗脫緩沖液，充分混勻，室溫孵育5 min，磁性分離架分離磁珠，將上清移入一新的預(yù)冷的離心管，保存?zhèn)溆谩?/p>

取GST-c-Src、GST-ΔSH3、GST-ΔSH2、GST-ΔPTKc、GST-SH3和GST標(biāo)簽蛋白各1 mg，在4 ℃條件下分別與5 mg His-hnRNPK融合蛋白在100 μL結(jié)合緩沖液中孵育1 h；然后向反應(yīng)混合物中加入20 μL Glutathione MagBeads，4 ℃冷室搖床上孵育1 h；用50倍體系預(yù)冷的PBS清洗Glutathione MagBeads 3次，再將磁珠用100 μL SDS-PAGE上樣緩沖液重懸，并在95 ℃處理10 min；最后取20 μL處理好的樣品用于10% SDS-PAGE分析和免疫印跡檢測。

1.7 數(shù)據(jù)分析

β-半乳糖苷酶活性測定時每個樣品重復(fù)3次，活性值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗數(shù)據(jù)通過 SPSS 18.0軟件進行顯著性分析，顯著性分析方法采用LSD法(最小顯著性差異法)，分別用“*”和“**”表示與對照相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 酵母雙雜交pGBKT7-hnRNPK和c-Src不同缺失體pGADT7質(zhì)粒構(gòu)建

以豬肌肉總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，通過PCR擴增，獲得目的基因片段hnRNPK的完整編碼區(qū)1 392 bp，包含兩個酶切位點；c-Src基因的完整編碼區(qū)及不同缺失體分別為1 629 bp(全長)、1 182 bp(SH3結(jié)構(gòu)域缺失)、870 bp(SH3和SH2結(jié)構(gòu)域缺失)、804 bp(PTKc結(jié)構(gòu)域缺失)和168 bp(SH3結(jié)構(gòu)域)，包含兩個酶切位點(圖略)。然后將這些片段分別克隆到pGBKT7和pGADT7酵母雙雜交載體中(圖1A和1B)。經(jīng)測序驗證插入序列的正確性后，利用質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒。以上結(jié)果表明，酵母雙雜交pGBKT7-hnRNPK和c-Src不同缺失體pGADT7載體構(gòu)建成功，可以用于酵母雙雜交試驗。

A. 瓊脂糖凝膠電泳檢測豬hnRNPK基因的BD融合重組質(zhì)粒載體；B. 瓊脂糖凝膠電泳檢測豬c-Src及缺失體的AD融合重組質(zhì)粒載體： M1. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；1. pGBKT7質(zhì)粒；2. pGBKT7-hnRNPK質(zhì)粒；3. pGBKT7-hnRNPK質(zhì)粒雙酶切；4、7、10、13和16. pGADT7質(zhì)粒；5. pGADT7-c-Src質(zhì)粒；6. pGADT7-c-Src質(zhì)粒雙酶切；8. pGADT7-ΔSH3質(zhì)粒；9. pGADT7-ΔSH3質(zhì)粒雙酶切；11. pGADT7-ΔSH2質(zhì)粒；12. pGADT7-ΔSH2質(zhì)粒雙酶切；14. pGADT7-ΔPTKc質(zhì)粒；15. pGADT7-ΔPTKc質(zhì)粒雙酶切；17. pGADT7-SH3質(zhì)粒；18. pGADT7-SH3質(zhì)粒雙酶切A. Electrophoresis results of porcine hnRNPK BD recombinant plasmid on agarose gel; B. Electrophoresis results of porcine c-Src AD recombinant plasmid on agarose gel; M1. DL5000 DNA marker；M2. DL2000 DNA marker(2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp); 1. pGBKT7 plasmid; 2. pGBKT7-hnRNPK plasmid; 3. The double enzyme digestion of pGBKT7-hnRNPK plasmid; 4, 7, 10, 13, 16. pGADT7 plasmid; 5. pGADT7-c-Src plasmid; 6. The double enzyme digestion of pGADT7-c-Src plasmid; 8. pGADT7-ΔSH3 plasmid; 9. The double enzyme digestion of pGADT7-ΔSH3 plasmid; 11. pGADT7-ΔSH2 plasmid; 12. The double enzyme digestion of pGADT7-ΔSH2 plasmid; 14. pGADT7-ΔPTKc plasmid; 15. The double enzyme digestion of pGADT7-ΔPTKc plasmid; 17. pGADT7-SH3 plasmid; 18. The double enzyme digestion of pGADT7-SH3 plasmid圖1 豬hnRNPK基因和c-Src基因及缺失體的酵母雙雜交質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 The construction of yeast two-hybrid plasmids of porcine hnRNPK and different mutants of c-Src

2.2 酵母雙雜交分析豬hnRNPK和c-Src蛋白的相互作用

為了檢驗體內(nèi)條件下，hnRNPK和c-Src相互作用情況，我們進行了酵母雙雜交試驗，將轉(zhuǎn)化pGBKT7-hnRNPK質(zhì)粒的酵母AH109細胞和轉(zhuǎn)化c-Src不同缺失體pGADT7質(zhì)粒的酵母AH109細胞分別涂布在SD-Trp-Leu和SD-His-Ade平板上，結(jié)果不能生長，His、Trp、Ade、Leu是酵母體內(nèi)含有的特殊報告基因，說明pGBKT7-hnRNPK和c-Src不同缺失體pGADT7質(zhì)粒不具有自激活宿主菌的作用，表明構(gòu)建的pGBKT7-hnRNPK 和c-Src不同缺失體pGADT7質(zhì)粒能夠適用于酵母雙雜交系統(tǒng)進行蛋白相互作用的驗證。

將hnRNPK分別和c-Src的不同缺失體pGADT7質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入酵母AH109細胞中，再分別涂布在SD-Trp-Leu和SD-His-Trp-Leu-Ade平板上。在SD-Trp-Leu平板上均有酵母單菌落生長，表明AD和BD載體已成功轉(zhuǎn)入酵母中(圖2)；在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上，轉(zhuǎn)入陰性對照的酵母不能在平板上生長，轉(zhuǎn)入陽性對照的酵母生長良好，表明酵母雙雜系統(tǒng)可以正常工作。同時，轉(zhuǎn)入pGBKT7-hnRNPK與pGADT7-ΔSH3、pGBKT7-hnRNPK與pGADT7-ΔSH2的酵母也不能在平板上生長，表明c-Src蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域缺失以及SH3和SH2結(jié)構(gòu)域共同缺失都不能激活酵母雙雜交系統(tǒng)；轉(zhuǎn)入pGBKT7-hnRNPK與pGADT7-c-Src、pGBKT7-hnRNPK與pGADT7-ΔPTKc、pGBKT7-hnRNPK與pGADT7-SH3的酵母能正常生長，表明hnRNPK和c-Src之間存在蛋白互作，其中位于c-Src激酶N端的SH3結(jié)構(gòu)域在互作中起著關(guān)鍵作用，SH2結(jié)構(gòu)域與hnRNPK互作較弱或不存在互作(圖2)。為了確定hnRNPK和c-Src蛋白互作強度，進一步測定了β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果表明，陰性對照在本底水平上存在一定的β-半乳糖苷酶活性((0.80±0.09) Miller units)，陽性對照β-半乳糖苷酶活性最高為(10.84±1.01) Miller units，c-Src、SH3和ΔPTKc的活性較高分別為(3.96±0.43)、(2.51±0.26)和(1.96±0.15) Miller units，均極顯著高于陰性對照(P<0.01)；ΔSH3和ΔSH2的β-半乳糖苷酶活性均較低，表現(xiàn)為陰性對照相似的本底水平活性(圖2)。這些結(jié)果進一步表明，hnRNPK和c-Src之間存在直接的相互作用，互作區(qū)域主要標(biāo)記在c-Src激酶N端的SH3結(jié)構(gòu)域。

圖2 hnRNPK與c-Src在酵母細胞中的相互作用Fig.2 Interaction between hnRNPK and c-Src in the yeast cells

2.3 豬hnRNPK和c-Src基因及缺失體重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

為了驗證hnRNPK與c-Src蛋白質(zhì)的體外互作，構(gòu)建了hnRNPK和c-Src基因及缺失體的原核表達載體，并進行誘導(dǎo)表達及純化。首先利用PCR擴增hnRNPK基因CDS和c-Src基因CDS及缺失體(c-Src、PTKc缺失、SH2缺失、SH3缺失和SH3結(jié)構(gòu)域)，分別克隆到pGEX-6p-1和PET28a原核表達載體中(圖3A和3B)。經(jīng)測序驗證插入序列的正確性后，將載體轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌，利用IPTG誘導(dǎo)表達重組目的蛋白(圖3D)。經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)各重組蛋白實際分子量和理論分子量大小一致，初步證明了目的蛋白的成功表達；進一步利用Western blotting驗證了誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白，用hnRNPK和c-Src特異抗體檢測到His-hnRNPK、GST-c-Src、GST-ΔSH3和GST-ΔSH2的表達，但沒有檢測到GST-ΔPTKc和 GST-SH3(c-Src抗體的抗原表位在c-Src的C端，由于它們的C端缺失，因此檢測不到)；而用GST標(biāo)簽抗體檢測c-Src及其缺失體的表達，GST、GST-c-Src、GST-ΔSH3、GST-ΔSH2、GST-c-Src-ΔPTKc和GST-SH3均能檢測到，表明這些融合蛋白均成功表達(圖3D)。

然后再利用GST融合蛋白純化介質(zhì)和Ni-IDA親和層析介質(zhì)分別純化帶GST和His標(biāo)簽重組蛋白，檢測發(fā)現(xiàn)，His-hnRNPK和GST-SH3有較少的雜帶，其他都較純，說明純化效果較好，可以用于后續(xù)的GST pull-down分析。

A. 瓊脂糖凝膠電泳檢測豬hnRNPK重組載體；B. 瓊脂糖凝膠電泳檢測豬c-Src及缺失體重組載體；C. 融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測；D. 蛋白質(zhì)印跡：M1. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET28-a質(zhì)粒；2. pET28-a-hnRNPK質(zhì)粒；3. pET28-a-hnRNPK質(zhì)粒雙酶切；4. pGEX-6p1質(zhì)粒；5. pGEX-6p1-c-Src質(zhì)粒；6. pGEX-6p1-c-Src質(zhì)粒雙酶切；7. pGEX-6p1-ΔSH3質(zhì)粒；8. pGEX-6p1-ΔSH3質(zhì)粒雙酶切；9. pGEX-6p1-ΔSH2質(zhì)粒；10. pGEX-6p1-ΔSH2質(zhì)粒雙酶切；11. pGEX-6p1-ΔPTKc質(zhì)粒；12. pGEX-6p1-ΔPTKc質(zhì)粒雙酶切；13. pGEX-6p1-SH3質(zhì)粒；14. pGEX-6p1-SH3質(zhì)粒雙酶切；15. His-hnRNPK；16. His；17. GST-c-Src；18. GST-ΔSH3；19. GST-ΔSH2；20. GST-ΔPTKc；21. GST-SH3；22. GSTA. Electrophoresis results of porcine hnRNPK prokaryotic expression recombinant plasmid on agarose gel; B. Electrophoresis results of porcine c-Src and mutants prokaryotic expression recombinant plasmid on agarose gel; C. Detection of fusion protein by SDS-PAGE; D. Western bloting: M1. DL5000 DNA marker; M2. Protein marker; 1. pET28-a plasmid; 2. pET28-a-hnRNPK plasmid; 3. The double enzyme digestion of pET28-a-hnRNPK plasmid; 4. pGEX-6p1 plasmid; 5. pGEX-6p1-c-Src plasmid; 6. The double enzyme digestion of pGEX-6p1-c-Src plasmid; 7. pGEX-6p1-ΔSH3 plasmid; 8. The double enzyme digestion of pGEX-6p1-ΔSH3 plasmid; 9. pGEX-6p1-ΔSH2 plasmid; 10. The double enzyme digestion of pGEX-6p1-ΔSH2 plasmid; 11. pGEX-6p1-ΔPTKc plasmid; 12. The double enzyme digestion of pGEX-6p1-ΔPTKc plasmid; 13. pGEX-6p1-SH3 plasmid; 14. The double enzyme digestion of pGEX-6p1-SH3 plasmid; 15. His-hnRNPK; 16. His; 17. GST-c-Src; 18. GST-ΔSH3; 19. GST-ΔSH2; 20. GST-ΔPTKc；21. GST-SH3; 22. GST圖3 豬hnRNPK和c-Src基因及缺失體原核表達載體的構(gòu)建和重組蛋白的表達純化Fig.3 The construction of prokaryotic expression vector and the expression and purification of recombinant protein of porcine hnRNPK and different mutants of c-Src

2.4 GST pull-down驗證hnRNPK與c-Src蛋白的相互作用

c-Src含有SH3、SH2和PTKc等3個重要的功能性結(jié)構(gòu)域，通過構(gòu)建不同截短的缺失體，誘導(dǎo)全長及截短蛋白的表達，將純化好的帶His-hnRNPK融合蛋白與結(jié)合在GST親和樹脂(beads)上的c-Src及其缺失體GST融合蛋白一起孵育，然后用清洗液充分清洗，再經(jīng)SDS-PAGE膠分離結(jié)合在樹脂上的蛋白，通過考馬斯亮藍染色(CBB-R250)與免疫印跡檢測分析發(fā)現(xiàn)，GST-c-Src和GST-ΔPTKc在體外與His-hnRNPK較強相互作用，GST-ΔSH3、GST-ΔSH在體外與His-hnRNPK的相互作用則較弱，但作為陰性對照的GST標(biāo)簽蛋白則不能與His-hnRNPK相互作用(圖4)。以上結(jié)果表明，豬hnRNPK蛋白與c-Src的相互作用是特異的，互作的區(qū)域主要位于c-Src激酶的N端，這與酵母雙雜交結(jié)果是一致的。

1. His-hnRNPK純化產(chǎn)物； 2～7. GST pull-down試驗中SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫物1. The purified product of His-hnRNPK; 2-7. The SDS-PAGE loading buffer elution in GST pull-down assay圖4 GST pull-down驗證豬hnRNPK與c-Src體外蛋白相互作用Fig.4 Interaction between porcine hnRNPK and c-Src in vitro by GST pull-down analysis

3 討 論

c-Src可以通過胰島素和生長因子信號通路對細胞增殖分化、葡萄糖運輸、糖原合成、蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過程起著重要調(diào)節(jié)作用[21]。hnRNPK作為一個多功能蛋白，參與染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控以及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[22]。ERK介導(dǎo)的hnRNPK蛋白的絲氨酸磷酸化修飾可以促進其在細胞質(zhì)的集聚表達[23]。而在細胞質(zhì)中hnRNPK可以與c-Src特意結(jié)合并激活c-Src激酶活性，同時也可作為酪氨酸磷酸化底物，其中hnRNPK位于KH3結(jié)構(gòu)域上的Tyr458位點磷酸化后將阻礙KH3結(jié)構(gòu)域與RNA‘UCCC’模體的結(jié)合，從而影響其對mRNA的翻譯水平的調(diào)控[13,15]。hnRNPK與c-Src激酶均在動物肌肉發(fā)育中起著重要調(diào)控作用，例如，M. J. Lim等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，抑制c-Src的活性可以抑制Raf/MEK/ERK通路，卻激活了p38 MAPK通路，從而抑制了成肌細胞增殖并促進分化，而這種抑制隨著p38 MAPK通路的失活而解除；hnRNPK Ser284/353位點的磷酸化能促進hnRNPK在分化C2C12成肌細胞中特異集聚表達，并調(diào)節(jié)成肌分化[8]。因此，對hnRNPK蛋白與c-Src激酶的相互作用的分析有助于揭示hnRNPK與c-Src在骨骼肌成肌分化中相互調(diào)控的分子機制及其介導(dǎo)的復(fù)雜信號通路。D. Adolph等[26]運用體外BiFC(雙分子熒光互補技術(shù))和GST-pull down技術(shù)分析了人hnRNPK蛋白及不同缺失體與c-Src的在體內(nèi)外的互作情況，發(fā)現(xiàn)hnRNPK蛋白主要通過KI結(jié)構(gòu)域與c-Src相互作用，而位于KI結(jié)構(gòu)域中的富含脯氨酸模體(218-242位氨基酸)對互作及激活c-Src激酶活性至關(guān)重要。但c-Src激酶具有多個功能域，其中哪一段或哪一結(jié)構(gòu)域在與hnRNPK蛋白互作中發(fā)揮作用尚不清楚。

酵母雙雜交技術(shù)是一種在活細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，本研究運用該技術(shù)證實了多功能蛋白hnRNPK與c-Src激酶的相互作用，并分析了c-Src激酶主要功能域的不同缺失體與互作情況，結(jié)果表明，位于c-Src蛋白N-端的SH3結(jié)構(gòu)域是互作的關(guān)鍵，SH3結(jié)構(gòu)域和PTKc結(jié)構(gòu)域的互作效應(yīng)則比較弱。為了排除酵母雙雜交技術(shù)中的假陽性，進一步采用了GST pull-down的方法在體外對兩者之間的相互作用進行鑒定。通過分別將hnRNPK蛋白與c-Src蛋白及不同功能域缺失體用標(biāo)簽蛋白樹脂洗脫純化下來，在體外研究hnRNPK蛋白與c-Src蛋白不同缺失體的相互作用關(guān)系，結(jié)果與酵母雙雜交是一致的。因此，利用酵母雙雜交技術(shù)和GST pull-down技術(shù)從體內(nèi)外條件下證實了豬hnRNPK與c-Src互作，并將c-Src蛋白的互作區(qū)定位在c-Src蛋白N端的SH3結(jié)構(gòu)域，這些驗證了前期在小鼠和人中hnRNPK與c-Src蛋白互作的結(jié)果[15,26-28]，并加深了對二者相互作用的認識，也為進一步研究兩者協(xié)同表達具體的作用機制以及如何調(diào)控豬骨骼肌生長發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過酵母雙雜交和GST pull-down技術(shù)，從體內(nèi)外對豬hnRNPK蛋白與c-Src激酶之間的相互作用作了分析，不僅加深了蛋白質(zhì)之間相互作用方法的認識，而且將c-Src蛋白的互作區(qū)定位在c-Src蛋白N端的SH3結(jié)構(gòu)域，兩種技術(shù)互為補充，互相印證，更加確定了結(jié)果的真實可靠。但是兩者相互調(diào)控的具體作用機制以及如何調(diào)節(jié)骨骼肌成肌分化的問題還有待更深入一步的研究。

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