王 哲 薛 敏 孟子暉 吉田田 謝騰升

(北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 102488)

1 引 言

蛋白-蛋白相互作用是生命體新陳代謝的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方向之一。蛋白抗原-抗體反應(yīng)是典型的蛋白-蛋白相互作用，即蛋白抗原和相應(yīng)的抗體在一定條件下特異性結(jié)合形成可逆的抗原-抗體復(fù)合物的過程。在此過程中，構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽鏈會發(fā)生疏水塌縮、空間盤曲、側(cè)鏈聚集等折疊過程，因此蛋白構(gòu)象具有柔性的特點(diǎn)[1]。生物大分子間(如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間)的作用力包括靜電作用力、親水/疏水作用力以及范德華力。近年來報道了許多根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)表面性質(zhì)合成的對其有親和作用的納米級聚合物材料[2,3]，如分子印跡技術(shù)[4,5]。針對目標(biāo)多肽或者蛋白質(zhì)設(shè)計并合成出表面具有正/負(fù)電荷、親水/疏水基團(tuán)的水凝膠納米顆粒，理論上應(yīng)對構(gòu)象靈活的多肽或者蛋白質(zhì)有親和性。

水凝膠作為一種新型的柔性聚合物材料[6,7]，由于其具有獨(dú)特的親水性、刺激響應(yīng)性、環(huán)境友好和生物相容性等特點(diǎn)，廣泛用于給藥系統(tǒng)[8]、醫(yī)學(xué)診療[9]、生物傳感器[10,11]、環(huán)境友好器件[12]、吸附分離[13]、生物材料[14]等方面。水凝膠納米顆粒(NPs)是通過沉淀聚合法得到的水凝膠聚合物[15]。Conde等[16]制備了含有納米顆粒和納米棒的水凝膠貼片，并用于腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)局部腫瘤的消除并預(yù)防復(fù)發(fā)。Shea等模擬天然抗體制備出尺寸與免疫球蛋白相當(dāng)[17]的聚合物納米粒子“塑料抗體”[18]，并成功用于體內(nèi)外毒素消除[19,20]。天然抗體及通過基因工程得到的人工抗體制備分離過程復(fù)雜，價格昂貴，在疾病診斷治療中有一定限制，而“塑料抗體”的應(yīng)用為疾病的治療提供了一條新途徑。利用溫敏性水凝膠聚合物的溫敏特點(diǎn)，可以避免蛋白在高溫下變性，Beierle等[21]測試了此類材料在85℃下對蛋白質(zhì)的保護(hù)作用，表明該材料可以有效保護(hù)蛋白活性。

溶菌酶是一種堿性蛋白，分子量約為14 kDa，是具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)。通常采用親和層析法、離子交換柱法、鹽析法等從蛋清中提取溶菌酶，過程較繁瑣[22]。 本研究基于溶菌酶的內(nèi)疏水、外親水結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成一種納米顆粒，通過優(yōu)化N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(Aac)和N-叔丁基丙烯酰胺(tBAM)等功能單體的配比，并調(diào)節(jié)制備過程中的表面活性劑含量，得到系列NPs，用于對溶菌酶親和性研究，初步探究其吸附機(jī)理，利用其溫敏性實(shí)現(xiàn)對溶菌酶簡單快速的吸附分離。

2 實(shí)驗部分

2.1 儀器與試劑

Zetasizer Nano-ZS型動態(tài)光散射激光粒度儀(英國Malvern公司)； FDU-2100型冷凍干燥儀(北京優(yōu)萊博技術(shù)有限公司)； MS-100型恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)； 1-14型臺式離心機(jī)(德國Sigma公司)； UV-1600型紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)； AWL-0502-U型艾科浦超純水機(jī)(重慶臺浦有限公司)； Nanosep?300K型超濾管(美國Pall公司)。

丙烯酸(Aac，純度99%)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm，純度99%)、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis，純度98%)、丙烯酰胺(AM，純度98%)、溶菌酶(來源于雞蛋, ≥20000 U/mg)和三氟乙酸(TFA，純度97%)購于北京百靈威科技有限公司；N-叔丁基丙烯酰胺(tBAM，純度97%，阿拉丁試劑有限公司)； 十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)； 過硫酸銨(APS，分析純，北京化工廠)； 2,2-乙氧基苯乙酮(DEAP，純度99%，阿法埃莎試劑公司)； 二甲基亞砜(DMSO，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)； 乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技公司)。

2.2 實(shí)驗方法

2.2.1水凝膠納米顆粒的制備采用沉淀聚合法合成水凝膠納米顆粒(NPs)[23]。將適量Aac、tBAM(溶解于乙醇中)、Bis、NIPAm溶于水后加入到100 mL三口瓶，再加入0～1 mg/mL SDS溶液，混合均勻后，配制成50 mL 65 mmol/L單體溶液，通氮?dú)獬?0 min后，加熱； 體系溫度升高到65℃，加入30 mg (0.1110 mmol)引發(fā)劑APS，反應(yīng)3 h。反應(yīng)過程中，溶液體系顏色由無色透明變?yōu)榈{(lán)色，最終得純白色溶液。將所得溶液裝入透析袋中(MWCO 14000)，用純水透析純化5天。

2.2.2水凝膠納米顆粒的表征用動態(tài)光散射粒徑儀對所制備的聚合物溶液在25℃測定粒徑和Zeta電位，在Trend模式下調(diào)整溫度2.5℃～35℃，測定樣品在不同溫度下粒徑變化，溫度梯度為使用Zetasizer Nano軟件分析結(jié)果。取5 mL水凝膠納米顆粒溶液經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)凍干后，用稱重法測其濃度。

2.2.3水凝膠納米顆粒對溶菌酶的親和作用將適量NPs溶液與溶菌酶溶液在35 mmol/L PBS緩沖溶液中35℃混合振蕩，得到的混合液用離心超濾管(MWCO 300 kDa)13000 r/min離心10 min，檢測濾液281 nm處吸光度，計算得溶菌酶濃度及吸附率。平行測定3次取平均值。吸附率(A)通過公式(1)計算:

A=(C0-C1)/C0(1)

其中，C0是吸附前溶液的濃度，C1是吸附后溶液的濃度。

2.2.4水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附分離將0.15 mg/mL溶菌酶與5.96 mg/mL NPs溶液混合(35 mmol/L PBS緩沖液)在35℃下振蕩10 min，用離心超濾管常溫離心后取濾液，測定其吸光度，計算溶菌酶濃度。平行測定3次。然后將濃縮溶液用PBS溶液稀釋至1 mL，混勻后置于0℃中30 min，4℃離心后測定濾液中釋放的溶菌酶吸光度，計算濾液中的溶菌酶濃度。用PBS溶液將脫附溶菌酶后的濃縮液淋洗3次，并最終稀釋至500 μL，用于下一次吸附。如此反復(fù)3次，過程如圖1所示。

圖1 水凝膠納米顆粒對溶菌酶吸附分離過程示意圖。 Filtrate a， 吸附后的濾液; Filtrate e, 低溫洗脫后的濾液Fig.1 Schematic illustration of adsorption and separation of hydrogels on lysozyme. Filtrate a, filtrate after the adsorption; Filtrate e, filtrate after cold elution

3 結(jié)果與討論

3.1 水凝膠納米顆粒的合成與表征

由NIPAm、Aac、tBAM和交聯(lián)劑Bis聚合制備NPs。通過改變單體及表面活性劑用量，合成一系列的NPs，利用掃描電鏡(SEM)對NPs形貌進(jìn)行表征。以NIPAm-Aac-tBAM-Bis(38∶20∶40∶2,n/n)配方的水凝膠納米顆粒為例，由圖2A可見，合成的樣品呈球形，分散均勻，粒徑均一，約為105 nm。從圖2B可見，聚合物粒徑分布范圍較窄，聚合物分散性指數(shù)PDI=0.043，粒徑均勻。由于水化層的存在，測得粒徑略大于掃描電鏡所測粒徑，微球在溶液中的粒徑為138 nm。

圖2 水凝膠納米顆粒的表征: (A) SEM圖, (B) DLS粒徑分布圖Fig.2 Characterization of hydrogel nanoparticles (NPs). (A) Scanning electron microscopy (SEM) image, (B) Dynamic light scattering (DLS) characterization

3.2 水凝膠納米顆粒單體配方對蛋白的親和作用的影響

NIPAm系水凝膠作為一種響應(yīng)性材料，通過施加外部刺激可以調(diào)控與生物分子之間的作用力，并且NIPAm可與功能單體共聚，通過配體與生物分子間的相互作用，如氫鍵、靜電作用、疏水作用、范德華力和π-π鍵等，實(shí)現(xiàn)聚合物對目標(biāo)分子的特異性結(jié)合。而不同的單體配比影響聚合物的表面電荷和疏水性?？疾炝梭w系中電負(fù)性單體和疏水性單體的摩爾含量對NPs吸附溶菌酶的影響。

圖3 水凝膠納米顆粒中Aac摩爾含量對溶菌酶吸附性能的影響Fig.3 Effect of acrylic acid (Aac) concentration in hydrogel NPs on lysozyme adsorption properties

3.2.1電負(fù)性單體Aac對吸附的影響由于溶菌酶帶有正電荷，帶負(fù)電基團(tuán)的聚合物可與之結(jié)合。Aac是電負(fù)性單體，其含量會影響NPs對溶菌酶的吸附能力。不同Aac含量的NPs對溶菌酶的吸附率如圖3所示，Aac含量的對NPs親和力的影響較大，Aac含量越高，親和力越強(qiáng)，當(dāng)Aac含量>20%(n/n)時，吸附率達(dá)到60%，且增速變緩。除靜電作用外，聚合物中的Aac含有羧基，可通過離子鍵與胺發(fā)生作用，也可與酰胺、羧基產(chǎn)生氫鍵作用，對生物分子有許多作用位點(diǎn)，所以Aac含量增大可以增強(qiáng)NPs對溶菌酶的親和力。但當(dāng)Aac含量>25%(n/n)時，合成的NPs分散性較差，且久置易團(tuán)聚，因此后續(xù)實(shí)驗不采用Aac含量>20%(n/n)的NPs用于吸附。

圖4 水凝膠納米顆粒中tBAM摩爾含量對溶菌酶吸附性能的影響Fig.4 Effect of N-tert tutyl acrylamide (tBAM) concentration in hydrogel NPs on lysozyme adsorption properties

3.2.2疏水單體tBAM對吸附的影響溶菌酶帶有正電荷，也含有疏水基團(tuán)，tBAM是疏水性單體，可以為聚合物提供疏水作用位點(diǎn)。不同tBAM含量的NPs對溶菌酶的吸附率如圖4所示，當(dāng)tBAM含量為40%(n/n)時親和力最強(qiáng)。tBAM摩爾含量從10%增加至40%(n/n)，吸附率呈緩慢增大的趨勢，這是因為tBAM含量增加，疏水作用位點(diǎn)增多，有利于NPs與生物分子間的相互作用。繼續(xù)增加tBAM含量，NPs對溶菌酶的親和力反而下降。這是因為聚合物中疏水單體含量增大時，不僅會增強(qiáng)聚合物與目標(biāo)多肽的作用力，同時也會增大水凝膠納米顆粒之間的排斥作用，當(dāng)tBAM含量>40%(n/n)時，水凝膠納米顆粒間的斥力影響了總的吸附效果。

根據(jù)上述優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果，在制備NPs時，Aac和tBAM的含量分別采用20%(n/n)和40%(n/n)。此外，通過對比不同Aac和tBAM含量的兩種配方的水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附情況，發(fā)現(xiàn)Aac對溶菌酶吸附率的影響遠(yuǎn)高于tBAM，表明Aac含量是影響吸附的主要因素，即靜電作用在水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附起主導(dǎo)作用。這也與溶菌酶內(nèi)疏水外親水的結(jié)構(gòu)特征相符。

3.3 水凝膠納米顆粒粒徑對蛋白的親和作用的影響

在聚合反應(yīng)中，表面活性劑SDS的濃度會對粒子的成核、增長產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響NPs的粒徑。對于按照NIPAm-Aac-tBAM-Bis(38∶20∶40∶2,n/n)制備的NPs，調(diào)節(jié)聚合時SDS濃度，得到一系列粒徑的NPs。通過DLS測試其粒徑及其分布及表面電勢(表1)。

表1 SDS含量對水凝膠納米顆粒粒徑及表面電勢的影響

Table 1 Relationship between SDS concentration and size/zeta potential of NPs

序號NoSDS濃度SDSconcentration(mg/mL)平均粒徑AverageSize(nm)Zeta電勢Zetapotential(mV)聚合物分散指數(shù)PDI10386．20-22．90．11320．002290．00-23．30．12830．01241．70-25．60．10740．02224．20-28．10．06250．1170．56-30．20．04560．2133．87-31．40．06470．495．22-34．30．09781．077．25-36．90．060

圖5 NPs粒徑對吸附溶菌酶性能的影響Fig.5 Effect of NPs size on lysozyme adsorption properties

當(dāng)預(yù)聚溶液中，SDS濃度從0 mg/mL增大到1 mg/mL，NPs粒徑從386.20 nm減小至77.25 nm。聚合物顆粒形成的過程中，在引發(fā)劑的作用下，體系中的部分單體形成了帶自由基的膠束，膠束增長形成帶有自由基的不穩(wěn)定的初級粒子，初級粒子繼續(xù)增長至體系中的單體全部耗盡，形成最終的聚合物顆粒。一般情況下，初級粒子間容易結(jié)合并形成大的粒子，而初級粒子表面帶有負(fù)電，體系加入陰離子表面活性劑SDS后，初級粒子之間的靜電斥力增強(qiáng)，可以在溶液中均勻且穩(wěn)定分散而不易與其它初級粒子結(jié)合，即體系中形成的初級粒子數(shù)量增多，最終的納米顆粒粒徑減小。故SDS濃度越大，NPs粒徑越小，此結(jié)果與先前的報道一致[24]。且當(dāng)SDS含量大于0.1 mg/mL時，NPs在水溶液中的表面電勢ζ值<-30 mV，表明聚合物體系穩(wěn)定性較好。

NPs粒徑對溶菌酶吸附的影響如圖5所示，粒徑越小的NPs對溶菌酶的親和力越強(qiáng)，推測可能是小粒徑的納米顆粒具有較大的比表面積，提供了較多的吸附位點(diǎn)。而粒徑過小的NPs離心分離較困難，故選擇1 mg/mL SDS作為聚合時所用的濃度。

3.4 水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附性能研究

經(jīng)過優(yōu)化后的NPs用于對溶菌酶吸附性能的研究。將系列濃度的溶菌酶溶液與1.49 mg/mL NPs溶液于35 mmol/L PBS緩沖液中混合均勻，35℃下振蕩30 min后，離心后取濾液，用紫外分光光度計測定溶液中溶菌酶的吸光度，計算吸附量，并繪制平衡吸附量對平衡濃度的關(guān)系。由圖6可知，對于一定量的NPs，隨著吸附溶液中溶菌酶濃度的增大，NPs對溶菌酶的吸附量逐漸增大。當(dāng)溶菌酶濃度達(dá)到0.15 mg/mL時吸附達(dá)到飽和，吸附率可達(dá)到68.7%。

將0.15 mg/mL 溶菌酶與1.49 mg/mL NPs的混合溶液，35℃下振蕩不同時間后離心，測定濾液中溶菌酶的吸光度，計算吸附量，并繪制吸附量對時間的吸附動力學(xué)曲線, 結(jié)果如圖7所示。在初始的3 min內(nèi)，吸附量急劇增長，3min后吸附趨于平衡， NPs對溶菌酶的吸附在5 min內(nèi)即可達(dá)到平衡。

圖6 NPs對溶菌酶的靜態(tài)吸附曲線Fig.6 Static adsorption dynamics of hydrogel NPs on lysozyme

圖7 NPs對溶菌酶吸附的動力學(xué)曲線Fig.7 Adsorption kinetics of hydrogel NPs on lysozyme

3.5 水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附分離

NPs中含有溫敏性單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)，具有溫度敏感性。NIPAm系水凝膠的低臨界溫度(Lower critical solution temperature，LCST)為32 ℃，接近人體溫度，而加入電負(fù)性單體Aac和疏水性單體tBAM后，其LCST會發(fā)生改變。經(jīng)測量，NPs的LCST≈12℃，如圖8A所示。在此溫度以上NPs為收縮狀態(tài)，對溶菌酶有吸附作用； 在此溫度以下，NPs發(fā)生溶脹，將吸附的溶菌酶釋放到溶液中，如圖8B所示。為了研究NPs對溶菌酶的吸附和脫附性能，分別在0℃與35℃下處理混合溶液。

圖8C顯示了NPs對溶菌酶的吸附分離性能，經(jīng)吸附后，濾液中溶菌酶的含量可以降至母液濃度的22.8%以下，經(jīng)脫附后的濾液可以達(dá)到母液濃度的62.1%以上。即通過控制溫度變化，一定程度上可以實(shí)現(xiàn)對溶菌酶的富集。循環(huán)吸附和脫附3次后，NPs仍然具有較好的吸附分離性能。

圖8 水凝膠納米顆粒粒徑隨溫度的變化(A)，吸附示意圖(B)，NPs對溶菌酶吸附分離(C) 圖C中a為吸附后的濾液; e為低溫洗脫后的濾液Fig.8 (A) Size change of NPs with temperature, (B) scheme of adsorption and separation, and (C) adsorption and separation of hydrogels on lysozyme. a is the filtrate after the adsorption; e is the filtrate after cold elution in (C)

4 結(jié) 論

利用沉淀聚合法合成了一系列具有親電和疏水基團(tuán)的溫敏性水凝膠納米顆粒，具有性質(zhì)穩(wěn)定且粒徑均勻可控的特點(diǎn)。將水凝膠納米顆粒用于對溶菌酶的吸附，得到對溶菌酶吸附的最優(yōu)配方，并考察了吸附條件。水凝膠納米顆粒對溶菌酶的吸附表現(xiàn)出吸附時間短、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，對實(shí)際樣品中溶菌酶具有較好的吸附率。利用水凝膠納米顆粒的溫敏性特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對溶菌酶的吸附及脫附，在溶菌酶的分離提純中具有良好的應(yīng)用前景。

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