李衛(wèi)峰 楊秋霞 林澤鵬 王李平 郭鵬然

(廣東省測(cè)試分析研究所，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心，廣州 510070)

1 引 言

食用油是食品中脂肪的重要來(lái)源，全球每年消耗的食用油超過(guò)1.7億噸[1]，但攝入不當(dāng)會(huì)引發(fā)諸多疾病，如肥胖癥、心血管疾病[2]、肝功能異常[3]等。食用油中主要成分是甘油三酯(TAG)，因甘油鏈上脂肪酸的碳數(shù)或飽和度不同而種類繁多。不同種類的食用油因含有的TAG種類不同而使其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功效有著很大的差異。此外，由于不同種類食用油相似度高，難以區(qū)別，食用油摻假問(wèn)題日趨嚴(yán)重。因此，發(fā)展一種食用油中TAG的快速、直接的分析方法在食品安全領(lǐng)域具有重要價(jià)值。

目前，食用油的分析方法種類很多，包括色譜法[4,5]、核磁共振波譜法[6]、紅外光譜法[7]和基于質(zhì)譜的分析方法[8]等。質(zhì)譜由于具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、優(yōu)異的檢出限等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用更為廣泛?；谫|(zhì)譜建立的方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9,10]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[11～13]和直接進(jìn)樣質(zhì)譜法。與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法相比，直接進(jìn)樣質(zhì)譜技術(shù)避免了色譜分離或衍生化的過(guò)程，具有樣品分析速度快、通量高、易操作等特點(diǎn)，是當(dāng)前分析技術(shù)的熱點(diǎn)[14]。目前，用于食用油中TAG的直接進(jìn)樣質(zhì)譜離子源技術(shù)主要包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)等[14～16]。其中，ESI源主要適用于測(cè)定其中的脂肪酸、酚類等極性成分，且有時(shí)需鹽離子輔助才能獲得好的信噪比譜圖。而APCI源則用于測(cè)定中等極性或弱極性的組分，由于APCI源獲得的譜圖有3種特征的碎片離子，根據(jù)碎片離子的信息可推斷TAGs的組成及脂肪酸的?；恢肹17]。與ESI源和APCI源溶液進(jìn)樣方式相比，MALDI源可直接作用于固體樣品，具有樣品制備方便、易操作、耐鹽度好的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于油品的快速定性分析[18～20]。

本研究利用MALDI-FTICR-MS對(duì)食用油中的TAG進(jìn)行了定性分析，建立了一種簡(jiǎn)便、快速分析食用油中TAG的方法。根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖可初步區(qū)別不同種類的食用油，利用主成分分析軟件(PCA)可高效區(qū)分34種不同種類的食用油，并應(yīng)用于橄欖油中摻雜菜籽油的識(shí)別分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

SolariX XR 7.0T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR-MS，美國(guó)Bruker公司)，配有電噴霧電離源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)等。其中MALDI源的Smartbeam II固態(tài)激光器的能量在0～300 μJ可調(diào)，頻率在0～1 kHz可調(diào)，激光波長(zhǎng)為355 nm，激光光斑可調(diào)。WH-3微型漩渦混合儀(上海瀘西分析儀器有限公司)。

丙酮、二氯甲烷(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；三氟乙酸鈉(NaTFA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB, 純度≥99%)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；除豬油自制外，不同品牌的花生油、菜籽油、橄欖油、玉米油、大豆油、向日葵油等共34種食用油均購(gòu)自本地超市。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品制備(1)食用油樣品制備 準(zhǔn)確移取4 μL樣品，分別溶于1 mL二氯甲烷，混勻待測(cè)。(2)摻雜食用油制備 將菜籽油與橄欖油按不同體積比(0%、5%、10%、20%、40%、60%)配制成系列混合食用油樣品，然后準(zhǔn)確移取4 μL樣品分別溶于1 mL二氯甲烷后，混勻待測(cè)。(3) DHB基質(zhì)制備 將1 mg DHB溶于500 μL丙酮溶液。(4) MALDI點(diǎn)樣 先移取1 μL基質(zhì)溶液于MALDI樣品靶上，待基質(zhì)自然晾干形成結(jié)晶層，再移取1 μL制備好的食用油樣品點(diǎn)于結(jié)晶層上，待進(jìn)樣分析。

2.2.2質(zhì)譜條件采用MALDI源正離子模式，激光能量為15%，光斑選擇為Medium模式，頻率為100 Hz，輻照次數(shù)為100 Shots，作用路徑為Random。質(zhì)量采集范圍m/z50～1500，采樣大小為1 M，累加次數(shù)為8，和諧阱累積時(shí)間設(shè)為2 ms。進(jìn)行二次質(zhì)譜測(cè)定時(shí)，隔離窗口(Isolation window)設(shè)為10，碰撞能量為25 eV。數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析采用儀器配有的DataAnalysis 4.4和ProfileAnalysis 2.2軟件進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的考察

對(duì)于MALDI源，基質(zhì)結(jié)晶質(zhì)量決定了質(zhì)譜信號(hào)的穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道，對(duì)于分析食用油中的TAG而言，當(dāng)采用DHB的丙酮溶液作為基質(zhì)時(shí)，先點(diǎn)基質(zhì)再點(diǎn)樣品的分步點(diǎn)樣方式可以獲得更為穩(wěn)定的質(zhì)譜信號(hào)和強(qiáng)的信噪比[21]。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用分步點(diǎn)樣方式進(jìn)行制樣。以往的文獻(xiàn)報(bào)道中多采用氯仿或者正己烷等毒性較低的溶劑來(lái)溶解食用油，本實(shí)驗(yàn)采用毒性更低的二氯甲烷作為溶劑進(jìn)行樣品制備。激光的相關(guān)參數(shù)(如激光頻率、激光能量、激光光斑等)是影響質(zhì)譜圖質(zhì)量的重要因素。在一定的激光光斑條件下，增加激光能量和頻率會(huì)增強(qiáng)離子流，但是如果離子流太強(qiáng)，過(guò)剩的離子會(huì)在質(zhì)量分析器中發(fā)生嚴(yán)重的電荷排斥現(xiàn)象，影響質(zhì)量軸的精度。為保證質(zhì)量軸精度，選擇激光能量為15%，激光頻率為100 Hz，輻照次數(shù)為100 Shots，光斑為Medium模式進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以4種不同的橄欖油作為代表進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)重復(fù)測(cè)定質(zhì)譜圖中m/z881.76081與m/z907.77650的峰強(qiáng)度比后，對(duì)4種橄欖油均可以獲得良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于9%，表明本方法的可行性良好。

3.2 食用油樣品分析

3.2.1不同種類食用油的分析為確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)之前均在ESI源正模式條件下用三氟乙酸鈉校正液對(duì)質(zhì)量軸校正。圖1A為玉米油樣品MALDI-MS的歸一化質(zhì)譜圖，其中青色區(qū)域代表TAG的鈉離子復(fù)合峰[TAG+Na]+，粉色區(qū)域代表甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)離子峰或TAG的碎片。由圖1A可知，DAG與TAG的比例與食用油本身含有的比例相差較大。這是因?yàn)榇蟛糠諨AG由TAG碎裂形成，所以在圖1A中將甘油二酯的區(qū)域標(biāo)記為DAG or fragments。圖1B是甘油二酯的局部放大圖，二酯類成分主要由含18個(gè)碳的脂肪酸，如亞麻酸(Ln，C18H30O2)、亞油酸(L，C18H32O2)和油酸(O，C18H34O2)兩兩組合而成。TAG的局部放大圖如圖1C所示， TAG共分兩類，一類只含單個(gè)的棕櫚酸(P，C16H32O2)，另一類不含棕櫚酸。通常，根據(jù)以上兩類TAG的含量或特征峰可初步識(shí)別不同類型的食用油。

圖1 玉米油的MALDI-FTICR-MS質(zhì)譜圖，質(zhì)荷比范圍分別為(A) m/z 400～1000，(B) m/z 596～605，(C) m/z 870～915。P: 棕櫚酸; Ln: 亞麻酸; L: 亞油酸; O: 油酸; S: 硬脂酸。Fig.1 Typical matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectra (MALDI-FTICR-MS) of corn oil at various mass-to-charge ranges: (A) m/z 400-1000, (B) m/z 596-605 and (C) m/z 870-915. P: palmitic acid; Ln: linolenic acid; L: linoleic acid; O:oleic acid; S: stearic acid.

圖2 不同種類食用油中的TAGs的MALDI-FTICR-MS質(zhì)譜圖: (A)大豆油, (B)向日葵油, (C)花生油, (D)玉米油, (E)菜籽油, (F)橄欖油和(G)動(dòng)物油Fig.2 MALDI-FTICR-MS spectra of triacylglycerols (TAGs) from different edible oils: (A) soybean oil, (B) sunflower oil, (C) peanut oil, (D) corn oil, (E) canola oil, (F) olive oil, (G) animal oil.

圖2為7種不同類型食用油中的TAG的質(zhì)譜圖, 可見(jiàn)利用一級(jí)質(zhì)譜圖很容易區(qū)分植物油與動(dòng)物油，這主要是因?yàn)榕c植物油相比，動(dòng)物油中含有的棕櫚酸比例增加，其低質(zhì)荷比的TAG所占的比例升高[16]。根據(jù)此特點(diǎn)，可以快速區(qū)分植物油與動(dòng)物油。對(duì)于6種植物油來(lái)說(shuō)，雖然成分類似，但根據(jù)TAG的譜圖也可進(jìn)行初步的識(shí)別。由圖2可知，橄欖油主要由單一的不飽和脂肪酸油酸(O)構(gòu)成，譜圖簡(jiǎn)單，根據(jù)特征峰m/z881.76081(POO)與m/z907.77650(OOO)的比例即可與其它食用油進(jìn)行區(qū)分。與其它植物油相比，菜籽油低質(zhì)荷比的TAG(如m/z881.76150)所占的比例最小。與玉米油比，向日葵油的特征峰m/z877.73150(PLL)與m/z903.74614(LLO)峰值比例降低?；ㄉ椭杏退岢煞衷黾?，所以TAG中m/z879.74620(PLO)與m/z905.76158(LOO)變?yōu)樘卣鞣?。由于亞油酸含量增加，大豆油的TAG以m/z877.73201(PLL)與m/z901.73202(LLL)為最高含量，以上獲得的譜圖結(jié)果與之前報(bào)道的結(jié)果基本類似[1]。因此，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜可對(duì)不同種類的食用油進(jìn)行初步的定性分析。

圖3 不同種類食用油中不同類型TAG的碎片質(zhì)譜圖: (A)玉米油m/z 877.72547二級(jí)譜圖，(B)玉米油m/z 903.74150二級(jí)譜圖，(C) 橄欖油m/z 881.75700二級(jí)譜圖，D)橄欖油m/z 907.77253。Fig.3 Various TAG fragments mass spectra from different types of edible oils: (A) m/z 877.72547 in corn oil, (B) m/z 903.74150 in corn oil, (C) m/z 881.75700 in olive oil, (D) m/z 907.77253 in olive oil.

3.2.2不同種類食用油的二級(jí)譜圖為了進(jìn)一步對(duì)食用油中TAG的定性分析進(jìn)行探究，以玉米油和橄欖油為例對(duì)部分TAG進(jìn)行了二級(jí)譜圖比較。如圖3所示，當(dāng)選取玉米油中母離子m/z877.72547進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)時(shí)，碎片離子分別為m/z597.48529和621.48509。經(jīng)過(guò)計(jì)算推導(dǎo)得知，以上獲得的碎片峰是由TAG去掉一個(gè)亞油酸或棕櫚酸形成，即[PL+Na]+和[LL+Na]+。當(dāng)選取母離子(m/z903.74150)進(jìn)行二級(jí)實(shí)驗(yàn)時(shí)，碎片峰來(lái)源主要是通過(guò)脫掉一個(gè)亞油酸或亞油酸鈉后形成，分別為[LO+Na]+和[LO+H]+，主要以Na+復(fù)合峰為主[22]。此外，對(duì)于橄欖油，m/z881.75700的碎片是通過(guò)脫掉一個(gè)油酸分子(O)或者棕櫚酸分子(P)形成，即[PO+Na]+和[OO+Na]+。m/z907.77253的碎片則是脫掉一個(gè)油酸或油酸鈉后形成，具體信息見(jiàn)圖3C和3D。橄欖油和玉米油的二級(jí)譜圖說(shuō)明，二級(jí)譜圖為定性分析提供了更為豐富的信息?？傊?，低質(zhì)荷比的TAG的碎片峰斷鍵的方式有兩種，而高質(zhì)荷比的TAG斷鍵方式只有一種，根據(jù)二級(jí)圖譜碎片碎裂的信息，可以初步獲得所測(cè)樣品中TAG的脂肪酸組成及各個(gè)脂肪酸飽和度等定性分析的信息[21,23,24]。

3.2.3主成分分析通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜圖中TAG的分布可初步區(qū)別不同種類的食用油，但在實(shí)際分析中，食用油種類繁多，樣本復(fù)雜，應(yīng)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行快速篩選分類。本研究采用主成分分析方法對(duì)34種食用油進(jìn)行分類。在m/z860-920質(zhì)荷比范圍內(nèi)經(jīng)過(guò)歸一化處理后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析，結(jié)果如圖4和圖5所示(PCA圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品)。由圖4可知，在置信度為95%的條件下，同一類樣品得到了很好的歸類，且7類食用油得到很好分離，其中PC1和PC2的差異值分別為66.7%和80.6%(圖5)，表明MALDI-FTICR-MS技術(shù)能夠有效區(qū)分不同種類食用油，為食用油的篩查和鑒定提供了基礎(chǔ)。

圖4 34種食用油的主成分分析的得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.4 Principal component analysis (PCA) results of 34 kinds of edible oils: (A) scores plot and (B) loadings plot

圖5 不同主成分的差異值Fig.5 Variance value of different principal components

3.3 橄欖油中菜籽油摻雜量與峰強(qiáng)度比的關(guān)系

由于含有豐富的不飽和脂肪酸及其它多種易被人體消化吸收，且具有一定美容功效的緣由，橄欖油被人們譽(yù)為“液體黃金”，其價(jià)格長(zhǎng)期以來(lái)一直居高不下。一些不法分子常會(huì)在橄欖油中摻入其它低價(jià)格的食用油，由于摻入的食用油的脂肪酸成分與橄欖油高度相似，常規(guī)手段很難進(jìn)行快速識(shí)別。為驗(yàn)證MALDI-FTICR-MS方法對(duì)食用油快速準(zhǔn)確的識(shí)別能力，本研究在橄欖油中摻入了不同比例的菜籽油進(jìn)行分析，歸一化的質(zhì)譜結(jié)果如圖6所示。以往的文獻(xiàn)報(bào)道中，根據(jù)特征峰如低質(zhì)荷比的TAG(如m/z881.76)和高質(zhì)荷比的TAG(m/z907.78)的比例變化即可識(shí)別橄欖油中是否摻雜菜籽油[1]。本研究直接利用高質(zhì)荷比的TAG的變化進(jìn)行識(shí)別區(qū)分。由圖6可知，隨著菜籽油摻入比例的增加，相比于m/z907.77586，m/z903.74481的強(qiáng)度逐漸增加，因此通過(guò)m/z903.74481和m/z907.77586的相對(duì)強(qiáng)度也可對(duì)食用油摻雜進(jìn)行識(shí)別。每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定5次，以I903.74481/I907.77586或I901.72957/I905.76004強(qiáng)度的平均值與摻入的菜籽油比例作圖，在0%～60%含量范圍內(nèi)可以獲得良好的線性關(guān)系(圖7)。即使摻雜5%的菜籽油也可被直接快速識(shí)別。這些結(jié)果表明，當(dāng)采用高質(zhì)荷比的TAG的變化趨勢(shì)作為研究對(duì)象時(shí)，MALDI-FTICR-MS同樣具有食用油摻雜的快速識(shí)別能力。

圖6 m/z 903.74481和m/z 907.77586譜峰強(qiáng)度隨著橄欖油中菜籽油含量的變化趨勢(shì)Fig.6 Intensity of m/z 903.74481 and m/z 907.77586 as a function of canola percentage in olive

圖7 (A) I901.72957/I905.76004和(B) I903.74481/I907.77586強(qiáng)度比與菜籽油中摻雜橄欖油的含量線性圖Fig.7 Plot of intensity ratio of I901.72957/I905.76004 (A) and I903.74481/I907.77586 (B) against percentage of canola in olive oil

4 結(jié) 論

本研究建立了一種用于食用油中TAG的MALDI-FTICR-MS直接快速分析方法。結(jié)合一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖可以快速區(qū)分不同種類的食用油，并可提供脂肪酸組成及各個(gè)脂肪酸的飽和度信息。利用主成分分析法，可以明顯地將34種食用油分為7類，通過(guò)高質(zhì)荷比的TAG的變化趨勢(shì)可直接識(shí)別摻雜5%菜籽油的橄欖油。本方法簡(jiǎn)便、快速、可靠， 有望成為快速篩查食用油的有效分析方法。

1 Ng T T, So P K, Zheng B, Yao Z P.Anal.Chim.Acta,2015, 884: 70-76

2 Jones P J H, MacKay D S, Senanayake V K, Pu S, Jenkins D J A, Connelly P W, Lamarche B, Couture P, Kris-Etherton P M, West S G, Liu X, Fleming J A, Hantgan R R, Rudel L L.Atherosclerosis,2015, 238(2): 231-238

3 Ma C, Kesarwala A H, Eggert T, Medina-Echeverz J, Kleiner D E, Jin P, Stroncek D F, Terabe M, Kapoor V, ElGindi M, Han M, Thornton A M, Zhang H, Egger M, Luo J, Felsher D W, McVicar D W, Weber A, Heikenwalder M, Greten T F.Nature,2016, 531(7593): 253-257

5 Janssen HG, Boers W, Steenbergen H, Horsten R, Fl?ter E.J.Chromatogr.A,2003, 1000(1): 385-400

6 Vigli G, Philippidis A, Spyros A, Dais P.J.Agric.FoodChem.,2003, 51(19): 5715-5722

7 Azizian H, Kramer J K G.Lipids,2005, 40(8): 855-867

8 HU Jun, WEI Fang, DONG Xu-Yan, LV Xin, LI Guang-Ming, CHEN Hong.J.Instr.Anal.,2012, 31(6): 749-756

胡 珺, 魏 芳, 董緒燕, 呂 昕, 李光明, 陳 洪. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012, 31(6): 749-756

9 Sales C, Cervera M I, Gil R, Portolés T, Pitarch E, Beltran J.FoodChem.,2017, 216(Supplement C): 365-373

10 Yang Y, Ferro M D, Cavaco I, Liang Y.J.Agric.FoodChem.,2013, 61(15): 3693-3702

11 HE Rong, SHAN Xiao-Lin, DONG Fang-Yuan, XU Xu.ChineseJ.Anal.Chem.,2015, 43(9): 1377-1382

何 榕, 山曉琳, 董方圓, 許 旭. 分析化學(xué),2015, 43(9): 1377-1382

12 Lerma-García M J, Simó-Alfonso E F, Méndez A, Lliberia J L, Herrero-Martínez J M.J.Agric.FoodChem.,2010, 58(5): 2771-2776

13 Fasciotti M, Pereira Netto A D.Talanta,2010, 81(3): 1116-1125

14 Wu Z, Rodgers R P, Marshall A G.J.Agric.FoodChem.,2004, 52(17): 5322-5328

15 Catharino R R, Haddad R, Cabrini L G, Cunha I B S, Sawaya A C H F, Eberlin M N.Anal.Chem.,2005, 77(22): 7429-7433

16 Lay J O, Liyanage R, Durham B, Brooks J.RapidCommun.MassSpectrom.,2006, 20(6): 952-958

17 ZHANG Yao-Li, PEI Xing-Li, GONG Can, HAN Yu-Liang, NI Tian-Qiang, WANG Fan, WANG Sheng-Jun, LU Hai-Peng, XU Xu.ChineseJ.Anal.Chem.,2017, 45(2): 183-190

張耀利, 裴興麗, 龔 燦, 韓玉良, 倪天強(qiáng), 王 帆, 王盛君, 盧海鵬, 許 旭. 分析化學(xué),2017, 45(2): 183-190

18 Ayorinde F O, Elhilo E, Hlongwane C.RapidCommun.MassSpectrom.,1999, 13(8): 737-739

19 Bail S, Stuebiger G, Unterweger H, Buchbauer G, Krist S.Eur.J.LipidSci.Technol.,2009, 111(2): 170-182

20 Saraiva S A, Cabral E C, Eberlin M N, Catharino R R.J.Agric.FoodChem.,2009, 57(10): 4030-4034

21 Asbury G R, Al-Saad K, Siems W F, Hannan R M, Hill H H.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,1999, 10(10): 983-991

22 Badu M, Awudza A M J.Int.J.FoodProp.,2017, 20(2): 271-280

23 Pittenauer E, Allmaier G.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2009, 20(6): 1037-1047

24 Kubo A, Satoh T, Itoh Y, Hashimoto M, Tamura J, Cody R B.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2013, 24(5): 684-689