陳卓，劉勝楠，吳克儉，陳光俠，何曉華

(1徐州市第一人民醫(yī)院，江蘇徐州221000；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

山奈酚是一種黃酮類化合物，主要來源于山奈、藏紅花等藥用植物，此外還廣泛存在于西蘭花、葡萄、綠茶等多種植物中。既往研究證實(shí)，山奈酚可以在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中表現(xiàn)出誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤組織侵襲及轉(zhuǎn)移的作用[1, 2]，但至今為止，國內(nèi)外尚未見山奈酚對胰腺癌細(xì)胞影響的報(bào)道。胰腺癌是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，由于缺乏特異性的臨床癥狀和早期診斷方法，往往患者在就診時(shí)已經(jīng)處于腫瘤晚期，但是由于胰腺癌細(xì)胞獲得性或內(nèi)在的耐藥性，傳統(tǒng)化療藥物的效果也不甚理想[3]，因此繼續(xù)探索有效的抗胰腺癌藥物具有重要臨床意義。另有研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4(TLR-4)/NF-κB信號通路參與了包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的進(jìn)展[4]。本研究觀察了山奈酚培養(yǎng)的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布及其TLR-4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討山奈酚作為胰腺癌化療藥物的可能性及其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。山奈酚為購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社(純度>97%)。DEME高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司。胎牛血清(FBS)、二甲亞砜(DMSO)、NF-κB p65抗體購自美國Sigma公司。激活型Caspase-3抗體、TLR-4抗體、VEGF抗體購自美國Santa Cruz公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。細(xì)胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及山奈酚應(yīng)用方法 將人胰腺癌PANC-1細(xì)胞用含有10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DEME-高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待PANC-1細(xì)胞貼壁生長后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)對照組和觀察1、2、3、4組，觀察1、2、3、4組分別用20、40、80、160 μmol/L的山奈酚，對照組加等量生理鹽水。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，PANC-1細(xì)胞密度3×104/mL。待細(xì)胞貼壁生長后，棄上清，每孔加入100 μL不同濃度(0、20、40、80、160 μmol/L，即對照組、觀察1組、觀察2組、觀察3組、觀察4組)的山奈酚培養(yǎng)24、48、72，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。處理完畢后，每孔均避光更換為100 μL培養(yǎng)液加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處每孔的吸光光度值(OD)，根據(jù)OD值計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 各組細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。向6孔板中每孔加入2 mL密度為2×105/mL的PANC-1細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長后，更換含不同濃度(0、20、40、80、160 μmol/L，即對照組、觀察1組、觀察2組、觀察3組、觀察4組)的山奈酚溶液處理48 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3板。終止培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，離心(2 000 r/min，5 min)沉淀細(xì)胞，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，制備密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，取1 mL細(xì)胞懸液離心，棄上清后，用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，并迅速打入3.5 mL預(yù)冷的乙醇中，吹打均勻，4℃過夜。取乙醇固定過的細(xì)胞離心，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入100 μL RNase A，37℃水浴30 min，隨后加入400 μL碘化丙啶(PI)染色混勻，4℃避光保存30 min后，用流式細(xì)胞儀測算各期細(xì)胞百分比。

1.5 各組細(xì)胞凋亡率測算 用流式細(xì)胞術(shù)制備細(xì)胞密度為2×105/mL的PANC-1細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3板，待細(xì)胞貼壁生長后，更換含不同濃度(0、20、40、80、160 μmol/L，即對照組、觀察1組、觀察2組、觀察3組、觀察4組)山奈酚的培養(yǎng)液處理48 h。終止培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，離心(2 000 r/min，5 min)沉淀細(xì)胞，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，用500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC混勻，置于冰上，室溫、避光保存10 min，然后加入5 μL PI混勻，置于冰上，室溫、避光保存5 min，用流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

1.6 各組細(xì)胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白檢測 采用Western blotting法。對照組和觀察1、2、3、4組分別用0、20、40、80、160 μmol/L的山奈酚處理PANC-1細(xì)胞48 h，然后用4℃預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入蛋白裂解液，搖勻后于冰上裂解30 min，結(jié)束后用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，于4 ℃離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。在經(jīng)過蛋白提取及濃度檢測后，每泳道上樣50 μg蛋白，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。結(jié)束后膜上加入TLR-4、NF-κB、VEGF、Caspase-3一抗4 ℃繼續(xù)培養(yǎng)過夜，TBST洗膜3次，再加入二抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，加入電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光液，在暗室中顯影X線片，圖像掃描。以 β-actin 為內(nèi)參照。目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比表示，以對照組表達(dá)量為100%，計(jì)算觀察1～4組各蛋白表達(dá)量相對值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h各觀察組細(xì)胞增殖抑制率見表1。作用相同時(shí)間的情況下，隨著山奈酚藥物濃度的遞增，PANC-1細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)；在山奈酚濃度相同的情況下，隨著作用時(shí)間增加，PANC-1細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)山奈酚以時(shí)間-劑量依賴的方式對PANC-1細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h各觀察組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與觀察1組相比，bP<0.05；與觀察2組相比，cP<0.05；與觀察3組相比，dP<0.05；

2.2 各組細(xì)胞周期比較 各組細(xì)胞周期分布見表2。隨著山奈酚濃度的遞增，S期PANC-1細(xì)胞的比例逐漸上升(P均<0.05)，G0/G1期PANC-1細(xì)胞的比例逐漸下降(P均<0.05)。山奈酚以劑量依賴的方式將PANC-1細(xì)胞增殖阻滯在S期。

表2 各組細(xì)胞周期分布比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與觀察1組相比，bP<0.05；與觀察2組相比，cP<0.05；與觀察3組相比，dP<0.05；

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 對照組、觀察1組、觀察2組、觀察3組、觀察4組細(xì)胞凋亡率分別為6.5%±1.5%、8.5%±1.7%、17.4%±2.1%、38.3%±2.9%、73.1%±2.7%。隨著山奈酚濃度的增加，PANC-1細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)，隨著山奈酚濃度的增加，PANC-1細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)，山奈酚以劑量依賴的方式誘導(dǎo)了PANC-1細(xì)胞的凋亡。

2.4 各組細(xì)胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 各觀察組細(xì)胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相對表達(dá)量見表3。隨著山奈酚濃度的增加，PANC-1細(xì)胞中TLR-4、NF-κB、VEGF蛋白相對表達(dá)量逐漸下降(P均<0.05)，Caspase-3蛋白相對表達(dá)量逐漸上升(P均<0.05)。山奈酚以劑量依賴的方式抑制了TLR-4/NF-κB信號通路蛋白TLR-4、NF-κB的表達(dá)，并且下調(diào)了VEGF的表達(dá)，上調(diào)了Caspase-3的表達(dá)。

表3 各觀察組細(xì)胞中TLR-4、NF-κB、VEGF和Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與觀察1組相比，bP<0.05；與觀察2組相比，cP<0.05；與觀察3組相比，dP<0.05；

3 討論

山奈酚作為在多種食材和傳統(tǒng)中藥中提取的有效作用成分，已經(jīng)被證實(shí)在包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用[5～7]。如Halimah等[8]報(bào)道，山奈酚可以在乳腺癌中通過釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，最終通過激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用。也有研究顯示，山奈酚可以通過調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶-2等炎性介質(zhì)，進(jìn)而下調(diào)VEGF、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)等mRNA轉(zhuǎn)錄，降低VEGF蛋白表達(dá)，最終抑制腫瘤侵襲[9]。本研究結(jié)果顯示，山奈酚不僅可以以時(shí)間-劑量依賴的方式抑制PANC-1細(xì)胞的增殖，而且劑量依賴性誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。此外，山奈酚還可以將PANC-1細(xì)胞阻滯于S期，其通過影響腫瘤細(xì)胞周期也是其抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

TLR-4作為Toll樣受體家族中第一個(gè)被識別的受體，和家族成員一樣，在生物體先天性免疫反應(yīng)和后天炎癥反應(yīng)之間起重要的紐帶作用。越來越多的證據(jù)表明，TLR-4通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等方式，深度參與了包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如Yu等[10]在用黑靈芝多糖處理S-180肉瘤的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TLR-4蛋白表達(dá)量的降低與Caspase-3之間存在負(fù)相關(guān)性。事實(shí)上有研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4及其下游重要中轉(zhuǎn)因子NF-κB在胰腺癌癌灶和癌周呈現(xiàn)過度表達(dá)的現(xiàn)象，并且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，腫瘤組織中TLR-4表達(dá)缺失患者的生存期顯著高于腫瘤中TLR-4過表達(dá)的患者的生存期[11]。本研究結(jié)果顯示山奈酚以劑量依賴的方式下調(diào)TLR-4、NF-κB和VEGF蛋白表達(dá)，上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)。Caspase-3在Caspase凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起執(zhí)行者的作用[12]。VEGF通過刺激血管生成因子，促進(jìn)腫瘤組織中新生血管的形成，與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移之間密切相關(guān)[13]。這說明山奈酚可以劑量依賴性的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其侵襲，有可能是新的抗胰腺癌藥物。

綜上所述，山奈酚可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，阻滯細(xì)胞周期于S期，其機(jī)制可能與TLR-4/NF-κB信號通路及其下游蛋白VEGF、Caspase-3有關(guān)。

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