裴佳，范文宏,2,*，董兆敏,2

1. 北京航空航天大學(xué)，空間與環(huán)境學(xué)院，北京 102206 2. 北京航空航天大學(xué)，醫(yī)工交叉北京市高精尖創(chuàng)新中心，北京 100191

水體中無機(jī)砷具有低濃度、高毒性、價態(tài)多變、難降解等特征，其會通過影響代謝酶、脂質(zhì)過氧化、基因損傷、基因表達(dá)等方面對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生危害。水生生物可以通過水相吸收和食物相暴露2種途徑對砷進(jìn)行富集[1]。現(xiàn)有研究已經(jīng)表明一些主要的水生動物類群，比如捕食者(魚類、腹足類)和食底泥動物，攝食已經(jīng)成為其富集砷的重要方式[2]。Cockell等[3-4]發(fā)現(xiàn)食物中較低濃度的砷(如100μg·g-1)就會對虹鱒魚幼魚(juvenile rainbow trout)的生長和營養(yǎng)鹽的吸收造成影響。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)無機(jī)砷食物相暴露黑鯛和花身鯻(seabreamAcanthopagrusschlegelii和gruntTeraponjarbua)28 d后肝臟中砷積累量增加，明顯高于肌肉和腸道中的積累量。并且食物相砷暴露能引起肝臟中谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和谷胱甘肽(GSH)含量發(fā)生改變，從而影響生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此研究水體中砷通過攝食途徑進(jìn)入生物體的積累和毒性效應(yīng)對砷生態(tài)風(fēng)險評估非常重要。

含砷食物進(jìn)入生物體后，可以經(jīng)消化系統(tǒng)吸收，隨血液分布到全身各組織和器官[6]。一系列研究表明無機(jī)砷暴露后肝臟是砷的主要負(fù)載器官，累積顯著高于其他組織[7-9]，同時肝臟是無機(jī)砷甲基化生成一甲基砷、二甲基砷，且進(jìn)一步生成砷甜菜堿的主要場所[10]，因此在無機(jī)砷暴露情況下肝臟是重要的研究對象。砷的毒性機(jī)制研究主要集中在甲基化代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞毒性等方面[11-13]，然而這些機(jī)制都與生物體的氧化與抗氧化平衡有關(guān)。生物體內(nèi)存在清除活性氧和自由基的抗氧化體系，包括酶系(如GST)和非酶系(如GSH)兩大類。有研究表明，金魚肝臟主要通過GSH和抗氧化酶的適應(yīng)性變化來應(yīng)對砷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[14]。GSH可直接與親電子劑反應(yīng)或作為輔助因子參與反應(yīng)，在砷解毒過程中發(fā)揮重要作用[15]。長期慢性砷暴露可引起機(jī)體GSH水平下降，而急性砷暴露則能夠引起GSH水平升高，表明生物體中GSH含量水平是決定其對砷敏感性的重要因素之一，但這種應(yīng)激性反應(yīng)的機(jī)制尚未完全闡明[16]。GST可通過催化降低砷的活性、加速其排泄，以達(dá)到解毒的效果，并且GST還能代謝小分子量的過氧化物，保護(hù)細(xì)胞不受活性氧自由基的損害[17-19]。另一方面污染物的脅迫可以影響生物體內(nèi)GST基因的表達(dá)，從而改變其活性[20]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣(oyster)暴露于無機(jī)砷一個月后，GST活性比空白組高。Ku等[21]的研究也表明當(dāng)黃鯰魚暴露于污染物時，GST等酶活性發(fā)生變化。目前大量的研究都主要集中在砷暴露過程中GSH含量和GST活性的研究，但對生物體內(nèi)砷的積累量與它們兩者之間的關(guān)系，以及GSH和GST在抗氧化反應(yīng)過程中的具體作用關(guān)注較少。

羅非魚作為一種重要的淡水產(chǎn)品，是我國的主要食用魚種之一。羅非魚通過食物相攝取砷在砷污染區(qū)是十分常見的[22]。因此本研究以羅非魚為模式生物，通過食物相暴露，測定分析食物相暴露過程中羅非魚肝臟中砷的累積量、GSH含量和GST活性，以探討砷在體內(nèi)的累積和GSH含量、GST活性的關(guān)系，從而為探究砷脅迫下體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的過程和機(jī)理提供數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 羅非魚暴露實(shí)驗(yàn)

從北京市小湯山魚場購買體長(8.7～9.1 cm)、體重(20～22 g)的羅非魚(Oreochromisspp)魚苗，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用羅非魚專用飼料(友誼恒遠(yuǎn)科技有限公司)喂養(yǎng)，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，健康生長。飼養(yǎng)30 d饑餓48 h后，對它們進(jìn)行為期32 d的食物相暴露。用NaAsO2和Na2HAsO4·7H2O固體(優(yōu)級純，美國Sigma-Aldrich公司)配制As(III)和As(V)溶液，充分浸泡人工飼料，浸泡后放入真空干燥箱(DZF-6050，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，上海)內(nèi)60 ℃條件下烘干至恒重，使As(III)和As(V)標(biāo)記人工飼料中砷含量分別為(752.0±12.8)μg·g-1、(800.5±15.3)μg·g-1。將制得的人工飼料儲存在4 ℃的冰箱中備用。羅非魚暴露在3個體積為120 L的魚缸中，每缸50條，用加熱棒加熱使水體溫度保持在25 ℃，光照和黑暗的時間為12 h∶12 h，每天按照羅非魚體重的3%投喂人工飼料，2 h后進(jìn)行換水從而除去沒有被完全吃掉的食物，在第2天的早上清除羅非魚的排泄物。在暴露后的0、2、4、6、8、10、13、16、20、24、28和32 d，從各處理組中隨機(jī)取6只羅非魚，于低溫下解剖取出肝臟，用于后續(xù)的砷積累量、GSH含量以及GST活性測定。

1.2 羅非魚肝臟內(nèi)砷積累量的測定

取適量(0.5～1.0 g)上述羅非魚肝臟，利用冷凍干燥機(jī)(Christ ALPHA 1-2 LD plus，上海亙先實(shí)業(yè)有限公司，德國)干燥10 h至恒重后，稱量干重0.05～0.1 g并轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，依次加入2 mL濃硝酸和0.5 mL雙氧水，在120 ℃的條件下消解至澄清透明，冷卻至室溫后，使用超純水定容至5 mL。用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，Thermo iCAP Q，美國)測定消解液中砷的濃度。測定過程中采用BCR-627金槍魚標(biāo)準(zhǔn)物作為質(zhì)量控制樣品，其中含砷總量為(4.9±0.3)μg·g-1，回收率為94%～103%。

1.3 羅非魚肝臟中GSH含量和GST活性的測定

稱量濕重為0.01 g的羅非魚肝臟瀝干水分放入離心管中，向離心管中加入1.0 mL預(yù)冷的勻漿液(0.25 mo1·L-1蔗糖、0.l mo1·L-1Tris-HCl、pH=8.6緩沖液)，在冰浴中用超聲波勻漿破碎儀(新芝生物科技公司，SCIENTZ-II D)進(jìn)行破碎，高速冷凍離心機(jī)(CF16RX，HITACHI公司，日本)0 ℃、16 000 g離心20 min后，取上清液0.2 mL。采用南京建成生物工程研究所市售的GSH測試盒，根據(jù)GSH巰基可以與二硫代二硝基苯甲酸發(fā)生反應(yīng)，生成一種黃色的化合物，從而通過測定該物質(zhì)在420 nm處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對，得到樣品溶液中GSH的含量，GSH的含量以單位質(zhì)量蛋白(mg prot)的GSH質(zhì)量(mg)表示。用GST測試盒，根據(jù)GSH與1-氯-2,4-二硝基苯的結(jié)合反應(yīng)，在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，酶的活性與反應(yīng)前后底物的濃度變化顯著相關(guān)，從而通過測定412 nm波長下GSH的濃度來表示GST酶的活性，GST的活力以單位質(zhì)量蛋白(mg prot)的活力單位(U)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan檢驗(yàn)法在P=0.05的置信水平對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，并用回歸分析方法作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 羅非魚肝臟中砷的含量

As(III)和As(V)食物相暴露32 d過程中羅非魚肝臟中砷的積累量如圖1所示。經(jīng)As(III)和As(V)食物相暴露后，肝臟中的總砷含量均顯著增加，與空白組有顯著性差異。As(III)食物相暴露情況下，砷含量在2 d內(nèi)顯著增加達(dá)到(11.15±0.51)μg·g-1，而在隨后的30 d暴露期內(nèi)，其積累量無顯著性差異，趨于穩(wěn)定。As(V)食物相暴露的條件下，隨著時間的增長，羅非魚肝臟中砷含量逐漸增加，在20 d時達(dá)到最大值(26.2±0.48)μg·g-1，顯著高于As(III)的最高累積量。24 d時顯著下降為(14.39±3.18)μg·g-1，而后砷積累量無顯著性差異。在為期32 d的As(III)和As(V)食物相暴露過程中，肝臟中的積累量表現(xiàn)出了不同的趨勢，As(III)暴露情況下積累量快速達(dá)到平衡。在暴露初期，As(III)食物相暴露積累量高于As(V)，后期As(V)高于As(III)。

圖1 As(III)和As(V)食物相暴露32 d中羅非魚肝臟中砷的積累量注：圖中不同字母代表組間具有顯著差異。Fig. 1 Bioaccumulation of total arsenic in liver in different exposure time of tilapia during 32 d exposure to As(III) and As(V)Note: different letters represent significant differences between groups.

2.2 肝臟中GSH含量及GST活性

32 d無機(jī)砷食物相暴露過程中羅非魚肝臟中GSH含量及GST活性如表1所示。GSH背景含量約為(25.44±3.46) mg·g-1prot。經(jīng)As(III)和As(V)暴露0～2 d后GSH含量分別增加為(33.77±3.35) mg·g-1prot和(38.77±3.11) mg·g-1prot，表明急性砷暴露能引起肝臟GSH含量的顯著升高。As(III)食物相暴露2～6 d后GSH含量降低到(21.22±2.03) mg·g-1prot，下降了37.1%；6 d后含量又逐漸升高，在13 d含量達(dá)到最大值(37.41±3.25) mg·g-1prot，13 d后GSH含量均低于空白組。As(V)食物相暴露2～4 d后GSH含量降低，4～16 d后GSH含量增加且16 d達(dá)到最大值(41.02±4.67) mg·g-1prot，16 d后GSH含量均低于空白組?？傮w而言，As(III)和As(V)食物相暴露過程中，GSH含量呈現(xiàn)了先增加后降低最后趨近穩(wěn)定的變化趨勢，表明在短期暴露內(nèi)GSH含量增加用來拮抗砷的毒性，隨著時間的增加，GSH被大量消耗，含量降低。

空白組GST活性為(114.94±14.54) U·mg-1prot。As(III)食物相暴露0～6 d后GST被誘導(dǎo)合成，其活性均大于空白組，6～8 d時GST活性降低，8 d后活性增加，32 d達(dá)到最大值(190.77±20.49) U·mg-1prot。As(V)食物相暴露0～8 d后GST被大量誘導(dǎo)合成，8～20 d后GST合成被抑制，20 d后活性增加，在32 d達(dá)到最大值(195.6±25.15) U·mg-1prot。無機(jī)砷食物相暴露過程中，GST活性呈現(xiàn)先增加后降低又增加的趨勢，表明在急性暴露過程中，GST被誘導(dǎo)合成來催化GSH與砷的結(jié)合，隨著暴露時間的增加，酶的活性受到了抑制，在暴露的后期生物體通過自身調(diào)節(jié)等的作用，GST活性增大。

2.3 砷累積量和肝臟中GSH含量及GST活性的關(guān)系

32 d的As(III)食物相暴露過程中，隨著羅非魚肝臟中砷積累量的增加，As(III)暴露組GSH含量升高，各時間點(diǎn)肝臟中砷的積累量與GSH含量之間呈正相關(guān)(y=1.492x+9.177)，如圖2(A)所示。而32 d的As(V)食物相暴露過程中，各時間點(diǎn)肝臟中砷的積累量與GSH含量之間沒有相關(guān)關(guān)系，如圖2(B)所示，原因可能是As(V)暴露時砷的累積量在暴露初期一直在緩慢上升，而對應(yīng)的GSH含量卻很快達(dá)到了高點(diǎn)，隨后緩慢下降。

表1 暴露過程中羅非魚肝臟中GSH含量和GST活性Table 1 The GSH content and GST activity in tilapia liver during exposure

注：GSH表示谷胱甘肽；GST表示谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶；*與空白組比較有顯著性差異。

Note: GSH represents glutathione; GST represents glutathione S-transferase; * represents significant differences compared with blank group.

圖2 三價砷(A)和五價砷(B)食物相暴露各時間點(diǎn)肝臟中砷的積累量與GSH含量的相關(guān)性Fig. 2 The relationship between arsenic accumulation and GSH content during 32 d As(III) exposure (A) and As(V) exposure (B)

圖3 三價砷食物相暴露各時間點(diǎn)肝臟中砷的積累量與GST活性的相關(guān)性(A)；五價砷食物相暴露各時間點(diǎn)砷的積累量與GST滯后一個時間點(diǎn)的活性相關(guān)性(B)Fig. 3 The relationship between arsenic accumulation and GST activity in same time point during 32 d As(III) exposure (A); the correlation between the arsenic accumulation and GST activity in next time point during 32 d As(V) exposure (B)

As(III)食物相暴露32 d內(nèi)各時間點(diǎn)肝臟中砷的積累量與GST活性呈顯著負(fù)相關(guān)，如圖3(A)所示。而對于As(V)食物相暴露，32 d內(nèi)各時間點(diǎn)肝臟中GST活性與積累量具有滯后一個時間點(diǎn)的負(fù)相關(guān)性，如圖3(B)所示。這兩者均表明GST對砷在生物體內(nèi)的積累轉(zhuǎn)化和解毒有著重要的作用。

3 討論(Discussion)

3.1 無機(jī)砷在肝臟中積累機(jī)制

3.2 肝臟中無機(jī)砷對GSH含量/GST活性的影響機(jī)制探究

從表1可以看出，無機(jī)砷暴露可以改變肝臟中GSH含量，從而拮抗無機(jī)砷對生物體的毒性作用，且隨著積累量的增加，暴露于As(III)的羅非魚肝臟中GSH含量增加。有研究發(fā)現(xiàn)1 000μg·L-1As(III)暴露48 h后，鯉魚肝臟中GSH的含量顯著增加[27]。另有研究顯示無機(jī)砷急性暴露后，隨著染毒時間的延長，小鼠肝組織內(nèi)GSH的含量整體呈先上升后下降的趨勢，并在染毒12 h達(dá)到最高值[28]。這些研究結(jié)果表明，砷暴露引起的機(jī)體GSH含量變化是一個復(fù)雜的過程。當(dāng)生物體受到砷的脅迫時，GSH中的巰基直接與親電子類物質(zhì)反應(yīng)，清除砷暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，同時與生物體內(nèi)積累的砷直接反應(yīng)，保護(hù)含有巰基的酶或者蛋白類物質(zhì)，以拮抗無機(jī)砷暴露對機(jī)體的損傷[29]。Wang等[30]以人肝細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)NaAsO2(0～30 μmol·L-1)處理24 h后，胞內(nèi)GSH含量隨染毒劑量增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。李富君等[31]的研究表明高濃度砷暴露后血液中GSH含量顯著增加，且不同劑量、不同染毒時間引起血液及組織中GSH含量變化不同。這表明As(III)在機(jī)體代謝過程中消耗了大量的GSH，同時為抵抗As(III)產(chǎn)生的毒性，機(jī)體又不斷產(chǎn)生GSH，故隨著肝臟中砷積累量的增加GSH含量也增加。對于As(V)，其進(jìn)入生物體后首先被還原為As(III)，然后再進(jìn)一步甲基化[6,32-33]。在As(V)還原成As(III)過程中GSH能作為重要的還原劑被大量消耗，這可能是造成砷積累量與GSH之間沒有明顯關(guān)系的原因，具體的原因還需要進(jìn)一步探究。

GST主要催化各種親電物質(zhì)與GSH的巰基結(jié)合，變成親水物質(zhì)，進(jìn)而排出體外。由圖3可以發(fā)現(xiàn)GST活性與肝臟中砷的積累量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Sinha等[27]發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉的暴露顯著降低了小鼠肝臟中GST的活力。姚琴[34]研究發(fā)現(xiàn)中、低濃度As(III)暴露可提高GST活性，但隨著As(III)濃度的增加，GST活性降低。這表明隨著As(III)染毒劑量和積累量的增加，一方面生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷加重，超過其限度，對GST活性表現(xiàn)出抑制作用；另一方面，GST作為一種球狀二聚體蛋白，As(III)可與酶蛋白分子上的巰基或羥基結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物或環(huán)狀化合物，當(dāng)生物體內(nèi)砷的積累量超過一定量時，導(dǎo)致GST活性降低甚至失活，故As(III)暴露隨著肝臟中積累量的增加，GST活性降低。一系列研究表明As(V)在生物體內(nèi)的代謝過程為：首先轉(zhuǎn)化成As(III)，然后再進(jìn)行甲基化，生成一甲基砷、二甲基砷，再與基團(tuán)結(jié)合形成砷甜菜堿、砷膽堿等物質(zhì)，肝臟是As(V)代謝的重要場所[33,35]。Zhang等[36]的研究表明當(dāng)褐籃子魚暴露于含1 500μg·g-1As(V)的人工飼料時，肝臟中As(III)的比例與As(V)相當(dāng)。這表明在肝臟中As(V)可大量轉(zhuǎn)化為As(III)，As(III)可以直接作用于酶活系統(tǒng)，更易與生物體內(nèi)GSH、酶類如GST以及組織蛋白中的巰基及羥基結(jié)合，故酶GST活性下降。As(V)不能與酶系統(tǒng)直接作用且As(V)代謝中形態(tài)的轉(zhuǎn)化可能是導(dǎo)致As(V)食物相暴露中GST活性與積累量的關(guān)系滯后一個時間點(diǎn)呈負(fù)相關(guān)的原因。

羅非魚受到無機(jī)砷暴露情景下，肝臟中GST活性和GSH含量發(fā)生改變，從而抵抗無機(jī)砷對魚體的毒性，且As(III)和As(V)對羅非魚GSH/GST的不同影響與其在羅非魚體內(nèi)的積累量有關(guān)。此研究為水生生物在砷暴露環(huán)境中機(jī)體的解毒機(jī)制提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，不同形態(tài)無機(jī)砷對水生生物的致毒及代謝機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。