三氯乙烯和四氯乙烯的細(xì)胞毒性及氧化應(yīng)激機(jī)制研究

逯南南，許燕，趙清華，孫莉，石近淼，王明泉，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，濟(jì)南 250021

氯乙烯類(lèi)有機(jī)物廣泛用于工業(yè)、醫(yī)療、日用品等領(lǐng)域，隨著其生產(chǎn)和使用量的增長(zhǎng)，已成為重要的環(huán)境污染物之一，在空氣、水、土壤中均能檢測(cè)到氯乙烯類(lèi)污染物[1-5]，詳見(jiàn)表1。三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)是易揮發(fā)的不飽和脂肪組氯代烴，美國(guó)環(huán)保署(EPA)將三氯乙烯定性為人類(lèi)致癌物，國(guó)際癌癥研究中心(IARC)將三氯乙烯和四氯乙烯分別定義為I類(lèi)和2A類(lèi)致癌物[6-7]。鑒于TCE和PCE環(huán)境污染的普遍性、對(duì)人類(lèi)的危害性及其治理的復(fù)雜性，其生物毒性研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注的問(wèn)題。離體細(xì)胞測(cè)試技術(shù)由于其簡(jiǎn)便、快捷已被廣泛應(yīng)用于污染物的生物毒性評(píng)價(jià)中。TCE和PCE暴露被證實(shí)與職業(yè)性剝脫性皮炎、重癥多形紅斑、大皰性表皮壞死松解癥和多形紅斑等疾病有關(guān)[8-9]，因此目前關(guān)于TCE和PCE的細(xì)胞毒性研究主要以皮膚角質(zhì)細(xì)胞為主，其他體細(xì)胞的毒性研究相對(duì)較少。本研究以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞為受試細(xì)胞，利用離體細(xì)胞測(cè)試技術(shù)開(kāi)展三氯乙烯和四氯乙烯脅迫下細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激機(jī)制研究，為揭示其毒性作用提供理論依據(jù)，也為環(huán)境污染物安全性評(píng)價(jià)方法提供支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)購(gòu)自國(guó)家細(xì)胞資源共享平臺(tái)，使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)。

試驗(yàn)中所用乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒、總蛋白定量測(cè)試盒以及活性氧測(cè)試盒等購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為色譜純及以上。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞毒性測(cè)定

采樣MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5～1×104個(gè)·mL-1，接種100L細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h后，加入三氯乙烯和四氯乙烯進(jìn)行染毒，設(shè)置劑量組分別為50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、500 mg·L-1、1 000 mg·L-1、2 000 mg·L-1，每組設(shè)6個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔(加入相同體積的培養(yǎng)基)和溶劑對(duì)照孔(加入相同體積的二甲基亞砜)。染毒24 h后棄掉原培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)100L及50L 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150L 二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩15 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm下的吸光值(OD值)。細(xì)胞存活率按下列公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值對(duì)照組OD值)100%，用細(xì)胞存活率-染毒濃度作圖法求出半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.2 酶活性的測(cè)定

細(xì)胞接種及培養(yǎng)方法同1.2.1。在IC50值以下設(shè)置濃度進(jìn)行三氯乙烯和四氯乙烯進(jìn)行染毒，劑量分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1，染毒試驗(yàn)24 h后測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，測(cè)定過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用含1% DMSO的培養(yǎng)液作溶劑對(duì)照組，以染毒組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量與對(duì)照組的比值反映細(xì)胞毒性。每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)孔。

1.2.3 活性氧的定性觀察

2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)可被酯酶水解而生成2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH)。DCFH不能透過(guò)細(xì)胞膜，其在細(xì)胞內(nèi)可被活性氧(ROS)氧化為有熒光的2',7'-二氯熒光素(DCF)，故檢測(cè)DCFH的熒光強(qiáng)度可代表細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。細(xì)胞培養(yǎng)及接種方法同1.2.1。在IC50值以下設(shè)置濃度進(jìn)行三氯乙烯和四氯乙烯進(jìn)行染毒，劑量分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1，染毒試驗(yàn)24 h后，加入DCFH-DA 37 ℃孵育細(xì)胞60 min，胰蛋白酶消化、離心收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2～3次并重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。以活性氧供氫體(H2O2)為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 三氯乙烯和四氯乙烯的細(xì)胞毒性

倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞呈梭形或多角形，形態(tài)完整分布均勻；而高濃度TCE和PCE染毒24 h后細(xì)胞變形，貼壁率下降，密度明顯減少，培養(yǎng)液中出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞漂浮(圖1)；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TCE和PCE暴露能夠抑制CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，TCE 100 mg·L-1及以上和PCE 50 mg·L-1及以上試驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)。通過(guò)對(duì)數(shù)擬合計(jì)算得到兩者對(duì)CHO細(xì)胞24 h的IC50分別為590 mg·L-1、281 mg·L-1(圖2)。

2.2 三氯乙烯和四氯乙烯對(duì)細(xì)胞膜的損傷

與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中總LDH活性沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明使用DMSO作為助溶劑對(duì)TCE和PCE的細(xì)胞毒性作用沒(méi)有顯著影響。TCE和PCE暴露均導(dǎo)致體外培養(yǎng)的CHO細(xì)胞LDH釋放水平增加，隨著染毒濃度的增大，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性不斷增大，表明細(xì)胞膜受損程度越大。通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)，與溶劑對(duì)照組相比，TCE染毒濃度50 mg·L-1及以上，PCE染毒濃度20 mg·L-1及以上試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性變化顯著。

圖1 TCE和PCE對(duì)CHO細(xì)胞形態(tài)的影響(100倍)Fig. 1 Effects of TCE and PCE on cells morphology (×100)

圖2 TCE和PCE對(duì)CHO細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effects of TCE and PCE on cell viability

圖3 TCE和PCE對(duì)CHO細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響(100倍)Fig. 3 ROS production in CHO cells exposed to TCE and PCE (×100)

2.3 三氯乙烯和四氯乙烯對(duì)細(xì)胞的氧化損傷

對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生很少熒光，而經(jīng)TCE和PCE染毒后的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，且熒光強(qiáng)度的產(chǎn)生與染毒物的劑量存在相關(guān)性，高劑量組的熒光強(qiáng)度明顯高于低劑量組。同劑量組的TCE染毒組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于PCE染毒組，說(shuō)明TCE誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力更強(qiáng)(見(jiàn)圖3)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度的比較見(jiàn)圖4。

細(xì)胞培養(yǎng)至24 h后，與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組SOD、CAT活性無(wú)顯著差異。TCE和PCE染毒組細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性均有下降趨勢(shì)，且200 mg·L-1染毒組酶活性下降顯著；20 mg·L-1、50 mg·L-1染毒組細(xì)胞CAT酶活性有升高趨勢(shì)，且PCE 50 mg·L-1染毒組酶活性顯著升高，說(shuō)明較低的污染物濃度能夠激活CAT的活性，隨著染毒濃度的升高，CAT的活性逐漸下降，200 mg·L-1PCE染毒組CAT酶活性受到顯著抑制(圖5)。

3 討論(Discussion)

TCE和PCE的用途廣泛決定了它們的大量生產(chǎn)，由于生產(chǎn)、使用、儲(chǔ)存或處置不當(dāng)?shù)纫恍┰?，使其通過(guò)揮發(fā)、泄露、廢水排放、農(nóng)藥使用及含氯有機(jī)物成品的燃燒等途徑進(jìn)入大氣、土壤、地下水中[10-14]，對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境造成較大危害。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)此類(lèi)污染物的肝臟、中樞和末梢神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肺、心臟毒性等做了大量研究。其中離體細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)因簡(jiǎn)便、快速而成為一種常用的毒性評(píng)價(jià)手段。關(guān)于氯乙烯類(lèi)污染物對(duì)體外培養(yǎng)肺源細(xì)胞和皮膚膠質(zhì)細(xì)胞等類(lèi)型細(xì)胞的毒性已有相關(guān)報(bào)道，如王波等[15]采用MTT測(cè)試技術(shù)得到TCE對(duì)體外培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞的IC50值為368 mg·L-1；沈彤等[16]和丁銳等[17]的研究顯示TCE和PCE對(duì)體外培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中性紅半數(shù)抑制濃度分別為4.53 mmol·L-1(595 mg·L-1)和2.16 mmol·L-1(358 mg·L-1)。本研究顯示TCE和PCE對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞24 h的IC50值分別為590 mg·L-1、280 mg·L-1，與前期研究結(jié)果類(lèi)似。

表2 各劑量組TCE和PCE染毒后細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)與空白對(duì)照組的比值(%，x±s)Table 2 The ratios of lactate dehydrogenase (LDH) between TCE or PCE exposure groups and the control group (%, x±s)

注：* 與溶劑對(duì)照組比較，P<0.05。

Note: * represents a significant difference between exposed group and solvent control group,P<0.05.

圖4 TCE和PCE對(duì)CHO細(xì)胞密度的影響(100倍)Fig. 4 Cell density of CHO exposed to TCE and PCE (×100)

圖5 TCE和PCE對(duì)CHO細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT酶活性的影響Fig. 5 The effects of TCE and PCE on SOD and CAT activities in CHO cells

外源性化合物進(jìn)入生物體內(nèi)，經(jīng)代謝活化可產(chǎn)生各種類(lèi)型的活性氧自由基，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞具有毒性作用。ROS是氧的某些代謝產(chǎn)物及其衍生物質(zhì)，它們具有比氧活潑的化學(xué)性質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為活性氧，主要包括超氧陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫、脂類(lèi)過(guò)氧化物以及單線(xiàn)態(tài)氧等。正常條件下，自由基的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，促氧化水平的升高或者抗氧化能力的減弱都會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)ROS含量的升高，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、通透性改變、細(xì)胞免疫功能下降或者DNA鏈斷裂等[18-19]。TCE和PCE暴露條件下，細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯上升，胞內(nèi)能量代謝和抗氧化過(guò)程中一些關(guān)鍵酶的活性也受到影響。

LDH是細(xì)胞能量代謝過(guò)程中的關(guān)鍵性酶，如果細(xì)胞膜損傷破裂，LDH便會(huì)從胞漿中釋放出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液中，因此培養(yǎng)液LDH的活性可用于表征細(xì)胞膜的損傷程度。Lash等[20]使用0.2、0.5、1.0 mmol·L-1的PCE對(duì)體外培養(yǎng)的雄性大鼠腎臟皮質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)作用3 h后各濃度組與溶劑對(duì)照組間LDH釋放情況均有顯著性差異。丁銳等[21]研究發(fā)現(xiàn)三氯乙烯可以引起體外培養(yǎng)的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞膜損傷，接觸三氯乙烯時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高，細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重。本研究得到的結(jié)果與相關(guān)報(bào)道吻合。

抗氧化酶能清除在細(xì)胞內(nèi)生成的活性氧，構(gòu)成對(duì)活性氧的防御體系。SOD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中關(guān)鍵性酶能將超氧陰離子自由基分解為過(guò)氧化氫和水，之后CAT將過(guò)氧化氫分解為完全無(wú)害的水。丁銳等[21]研究TCE和PCE對(duì)體外培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，TCE和PCE染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨TCE和PCE濃度增加呈上升趨勢(shì)，而SOD酶活性呈下降趨勢(shì)，與溶劑對(duì)照組相比較差異有顯著性，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。CAT酶活性在低濃度組呈激活態(tài)勢(shì)，而隨著污染物濃度的升高而活性受到抑制。Lowry等[22]和Chen等[23]研究也證實(shí)了TCE和PCE可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)TCE和PCE染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升，而SOD和CAT酶活性的下降使得自由基清除能力減弱，進(jìn)一步加劇了活性氧的積累。ROS的不斷積累引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。