劉慶艾，馬恒，馬耀宏，楊俊慧，孟慶軍，楊艷，史建國

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

在淀粉及淀粉糖生產(chǎn)中多釆用濕磨工藝生產(chǎn)玉米淀粉[1]，其中浸泡是玉米淀粉濕法加工過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，玉米浸泡的質(zhì)量直接影響后道工序的正常生產(chǎn)以及淀粉的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-3]。因此，對玉米浸泡過程中的參數(shù)進(jìn)行控制具有重要意義。由于分析方法的不足，以往研究多局限于傳統(tǒng)控制參數(shù)，如溫度、pH值、浸泡時(shí)間、亞硫酸濃度等，對浸泡過程中重要生化參數(shù)的變化規(guī)律缺乏深入了解。其中乳酸、葡萄糖、還原糖是反映浸泡過程變化最重要的生化參數(shù)，不僅能直接反映出浸泡液中內(nèi)溶物的溶出程度和微生物的代謝活動，而且乳酸的含量對浸泡效果也起到重要作用[4-5]。因此，對乳酸、葡萄糖、還原糖的適時(shí)檢測是浸泡條件優(yōu)化及后續(xù)高品質(zhì)淀粉生產(chǎn)的重要保障。

在傳統(tǒng)的檢測方法中，乳酸采用中和滴定法或比色法[6]，葡萄糖采用碘量法進(jìn)行測定[7],還原糖則采用費(fèi)林試劑法進(jìn)行測定[8]，耗時(shí)、樣品消耗量大且穩(wěn)定性不好。本文采用生物傳感器分析方法，對酶法玉米浸泡工藝過程的乳酸、葡萄糖、還原糖進(jìn)行快速測定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米：含水量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))12.6%(菱花集團(tuán)有限公司玉米淀粉生產(chǎn)車間)；酸性蛋白酶：酶活50 000 U/g以上(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YP201N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；303A2電熱恒溫培養(yǎng)箱(南通宏大實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DHG系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；西廚多功能粉碎機(jī)(鉑歐五金廠)；HHS恒溫水浴鍋(江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；LXJ64-01離心機(jī)(河北省吳橋電機(jī)廠)；SBA-40D型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)；SGD- IV型全自動還原糖測定儀(山東省科學(xué)院生物研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米浸泡方法

準(zhǔn)確稱取400 g玉米于浸泡罐中，加入1 000 mL 0.6%的乳酸溶液，50±2 ℃浸泡20 h；將玉米粗破碎，以1 000 U/g(玉米)的加酶量向浸泡液中加入酸性蛋白酶，50±2 ℃浸泡30 h。每隔2 h取樣。

1.3.2 傳統(tǒng)測試方法

1.3.2.1 滴定法[6]測定乳酸含量

取浸泡液50 mL，5 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL于100 mL三角瓶中，加蒸餾水50 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH大于12，鈣黃綠素指示劑0.02 g，用0.05 mol/L EDTA·Na2溶液滴定至背光由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬珵橹?，并記錄消耗體積。

W=M*c*V/V0,

式中：W為乳酸含量，mg/L；V為滴定消耗EDTA·Na2的體積， L；V0為試樣體積，L；c為EDTA·Na2的濃度，mol/L；M為乳酸摩爾質(zhì)量，mg/mol。

1.3.2.2 碘量法[7]測定葡萄糖含量

準(zhǔn)確移取玉米浸泡液25.00 mL和碘標(biāo)準(zhǔn)溶液25.00 mL于碘量瓶中，慢慢滴加2 mol/L NaOH，將碘量瓶加塞搖勻，放置15 min使之完全反應(yīng)。加入2 mL 6 mol/L HCl，立即用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈淺黃色，加2 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失即達(dá)到滴定終點(diǎn)，記錄數(shù)據(jù)，平行滴定3次。

W1=(c1V1-0.5c2V2)*M1/V3,

式中：W1為葡萄糖含量，mg/L；V3為浸泡液試樣的體積，L；V1為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，L；c1為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V2為滴定消耗Na2S2O3的體積，L；c2為Na2S2O3的濃度，mol/L；M1為葡萄糖摩爾質(zhì)量，mg/mol。

1.3.2.3 費(fèi)林試劑法[8]測還原糖含量

移取浸泡液溶液50 mL于400 mL燒杯中，加入費(fèi)林試劑甲、乙液各25 mL。加蓋表面皿，置電爐上加熱，并在4 min內(nèi)沸騰，再煮沸2 min，趁熱用鋪有石棉的坩堝抽濾，并用60 ℃熱水洗滌燒杯和沉淀，至洗液不呈堿性為止。向坩堝中加入硫酸鐵溶液和水各25 mL，用玻璃棒攪拌，使氧化亞銅完全溶解，用前面使用過的燒杯收集溶液，以0.1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色。同時(shí)取水50 mL，加費(fèi)林試劑甲、乙液各25 mL，做試劑空白組。

X= (V4-V5)*c3*M2/V4,

式中：X為氧化亞銅濃度，mg/L；V4為試樣消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，L；V5為試樣空白消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，L；V4為試樣體積，L；c3為高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L；M2為氧化亞銅摩爾質(zhì)量，mg/mol。

由所得氧化亞銅質(zhì)量按GB/T 5513-2008[8]查出還原糖質(zhì)量。

1.3.3 生物傳感器測試方法

利用生物傳感器測定浸泡液中乳酸、葡萄糖、還原糖的含量，測定時(shí)每次取樣量為25 μL,響應(yīng)時(shí)間20 s，測定周期小于2 min,誤差小于2 %。樣品不需脫色、分離純化就可直接測定[9]。

2 結(jié)果與討論

玉米酶法浸泡過程表現(xiàn)出復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物學(xué)變化，其中葡萄糖、還原糖的溶出與乳酸菌的產(chǎn)生有關(guān)[10]，而乳酸菌的生長又與乳酸的產(chǎn)生和葡萄糖、還原糖的消耗密切相關(guān)。

2.1 生物傳感器測試浸泡過程中葡萄糖的變化規(guī)律

2.2.1 葡萄糖含量的變化

如圖1所示，在開始乳酸浸泡的20 h內(nèi)，浸泡液中葡萄糖的含量持續(xù)上升；酸性蛋白酶作用階段，20～40 h這段時(shí)間內(nèi)，浸泡液中的葡萄糖含量開始下降，而在40 h后又有一定程度的反彈上升。這可能是因?yàn)椋诮莩跏茧A段，乳酸菌的生長不夠旺盛，處于遲緩期，對葡萄糖的消耗的速率低于葡萄糖的溶出速率，因而前20 h浸泡液中的葡萄糖含量持續(xù)上升；20 h后，乳酸菌的生長處于對數(shù)期，對葡萄糖的消耗的速率高于葡萄糖的溶出速率，因而浸泡液中的葡萄糖含量開始下降；40 h后，乳酸菌的生長趨于穩(wěn)定并開始衰亡，對葡萄糖的消耗量減少，因此浸泡液中的葡萄糖含量又有一定程度的上升。

圖1 玉米浸泡過程中葡萄糖含量的變化曲線Fig.1 The changing curve of glucose in corn steeping process

2.2.2 還原糖含量的變化

浸泡過程中還原糖的變化規(guī)律與葡萄糖類似，如圖2所示，在乳酸浸泡的20 h內(nèi)，浸泡液中還原糖的含量持續(xù)上升；酸性蛋白酶作用的20～40 h這段時(shí)間內(nèi)，還原糖含量開始下降，而在40 h后又有一定程度的反彈上升。這是由于浸泡液中還原糖主要是葡萄糖，因此浸泡過程中還原糖的變化規(guī)律與葡萄糖一致。

2.2.3 乳酸含量的變化

乳酸的產(chǎn)生與乳酸菌的生長有關(guān)，而乳酸菌的生長又與葡萄糖的溶出具有相關(guān)性。如圖3所示，在開始乳酸浸泡的20 h內(nèi)，隨著葡萄糖的浸出，乳酸菌開始生長，浸泡液中的乳酸含量持續(xù)上升；酸性蛋白酶作用階段，20～40 h這段時(shí)間內(nèi)，浸泡液中的葡萄糖含量開始下降，乳酸菌的生長變緩，同時(shí)玉米粗破碎之后乳酸更容易進(jìn)入籽粒內(nèi)部，使得溶液中的乳酸濃度有所下降；隨著浸泡的進(jìn)行，玉米籽粒對乳酸的吸收逐漸達(dá)到飽和，因此在40 h后浸泡液中的乳酸濃度又有一定程度的反彈上升。

圖2 玉米浸泡過程中還原糖含量的變化曲線Fig.2 The changing curve of reducing sugar in corn steeping process

圖3 玉米浸泡過程中乳酸含量的變化曲線Fig.3 The changing curve of lactic acid in corn steeping process

2.3 生物傳感器法與傳統(tǒng)方法結(jié)果對比

表1 生物傳感器方法與傳統(tǒng)方法結(jié)果對比Table 1 Comparison of results of biosensor methods and those of conventional methods

如表1所示，利用生物傳感器測定浸泡液中葡萄糖、還原糖、乳酸含量，其測試結(jié)果與傳統(tǒng)測試方法相差不大。

3 結(jié)論

在玉米酶法浸泡過程中，采用生物傳感器測定浸泡液中葡萄糖、還原糖、乳酸的變化規(guī)律， 具有響應(yīng)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、測試成本低等優(yōu)點(diǎn)，并且樣品不需要復(fù)雜的預(yù)處理就可直接測定，該研究為玉米淀粉生產(chǎn)過程優(yōu)化和控制提供了新的分析方法和理論依據(jù)。

[1]徐立新, 趙壽經(jīng), 何沐陽,等. 利用生物技術(shù)改進(jìn)玉米淀粉濕法生產(chǎn)工藝的研究[EB/OL] .[2017-03-12]. http://new.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=conference&id=7566394.

[2]袁鵬，潘琤，周林，等. 玉米淀粉深加工產(chǎn)品的應(yīng)用[J]. 糧食與食品工業(yè)，2010，17(4)：23-25.

[3]JOHNSTON D B, SINGH V. Use of proteases to reduce steep time and SO2requirements in a corn wet-milling process [J]. Cereal Chemistry, 2007, 78(4):405-411.

[4]史建國. 微生物發(fā)酵過程還原糖光度傳感器的研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2006.

[5]DU L, LI B, LOPESFILHO J F, et al. Effect of selected organic and inorganic acids on corn wet-milling yields [J]. Cereal Chemistry, 1996, 73(1):96-98.

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[8]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5513—2008 糧油檢驗(yàn) 糧食中還原糖和非還原糖測定[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[9]孟慶軍, 馮文紅, 付剛,等. 葡萄糖與乳酸生物傳感器在玉米浸泡工藝中的應(yīng)用[C]∥中國酶工程學(xué)術(shù)研討會.廣州：[s.n.], 2011.

[10]叢澤峰, 王宏齡, 張敬軍, 等, 嗜熱乳酸發(fā)酵法改進(jìn)玉米浸泡工藝的研究[J]. 廣州化工, 2015, 43(19)： 29-30.