間充質(zhì)干細胞在骨折愈合中作用的研究進展

魏 娜，張 萍，于 莉，徐建江

骨折愈合是指骨折、截骨、關節(jié)融合和骨移植術后的自然骨連接的過程。其最終結局是損傷的骨組織恢復正常的結構及生物力學功能，涉及到多種細胞的增殖、分化和細胞外基質(zhì)的合成與鈣化等修復過程。骨折愈合有“一期愈合”及“二期愈合”兩種形式。一期愈合是指在完全解剖復位和絕對固定的條件下，骨折斷端之間發(fā)生直接愈合；而二期愈合則是在非絕對固定的情況下的間接愈合。骨折二期愈合以骨痂生長橋愈合為主，是臨床常見并一直推崇的骨折愈合方式，主要包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種，膜內(nèi)成骨的機制為骨化部位的間充質(zhì)干細胞直接分化為成骨細胞，常見于顱頂骨和面顱諸骨以及鎖骨。軟骨內(nèi)成骨是先由間充質(zhì)干細胞分化形成軟骨細胞，軟骨細胞終末分化和凋亡，骨基質(zhì)鈣化，再以鈣化的骨基質(zhì)為模板開始延伸完成骨化過程，主要發(fā)生在長骨、短骨及部分不規(guī)則骨中。骨組織的再生能力較強，骨折后，在骨折處先形成肉芽組織，然后出現(xiàn)軟骨細胞、成骨細胞與破骨細胞，形成新生的骨小梁，連接填充于斷端之間，稱為骨痂。此后幾經(jīng)反復重建修復，可能會恢復骨的原有結構及生理功能。骨折愈合的機制探索越來越吸引廣大研究者目光，骨折愈合相關的基礎認識也在逐漸形成共識，也一直是骨科領域的研究熱點。筆者綜述了骨折愈合的相關影響因素和間充質(zhì)干細胞相關的機制研究進展，力求為進一步研究探索以啟發(fā)。

1 骨折愈合的影響因素

骨折愈合是一個非常復雜的病理生理過程，涉及多種細胞及細胞因子的共同作用，影響骨折愈合的因素也是多方面的。

1.1 影響骨折愈合的細胞因子 骨折區(qū)域內(nèi)血管的重塑、再生是啟動骨折愈合的關鍵性因素之一，血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前為止唯一發(fā)現(xiàn)的能直接作用于血管內(nèi)皮細胞，有效促進血管再生的細胞生長因子［1］；并且與膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨等成骨反應關系密切，在骨折愈合、骨不連及骨缺損的修復中起到正性調(diào)節(jié)的作用［2］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）存在于骨基質(zhì)中，是一種具有很強的成骨誘導作用的酸性蛋白，能夠促進骨折的愈合和修復［3-5］。β-轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β），能夠促進成骨細胞的增殖以及膜內(nèi)成骨過程，在細胞和組織中的分布較為廣泛。Wildemann等將髓內(nèi)針涂上TGF-β涂層，用以治療大鼠脛骨骨折，實驗結果顯示TGF-β可促進骨折的愈合［6，7］。另外，在骨折愈合的急性反應期，損傷之后，外周血細胞、骨髓內(nèi)血細胞以及骨髓細胞在損傷部位共同形成血腫，骨折引起的急性反應對于骨折的愈合是十分必要的。

在炎性期，腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、IL-6、IL-11 及 IL-18 分泌增多，這些細胞因子能夠募集炎性細胞并促進血管再生［8］。其中，TNF-α在損傷反應的24 h內(nèi)濃度達到最高，72 h后又降回到基線。在這個時間段內(nèi)，巨噬細胞及其他炎癥細胞表達TNF-α，并認為能誘發(fā)繼發(fā)性炎癥信號以及募集損傷修復所必需的細胞［9］。另外，體外實驗顯示TNF-α能夠促進MSCs的成骨分化［10］。而在所有的白介素中，對骨折影響最重要的是IL-1和IL-6。IL-1在炎癥急性期由巨噬細胞激活，在成骨階段誘導產(chǎn)生IL-6，并促進原始軟骨骨痂的形成，并促進骨折區(qū)新生血管的形成［11，12］。 另一方面，IL-6 只在急性期生成，能夠刺激血管生成，促進產(chǎn)生VEGF，以及成骨細胞和破骨細胞的分化［13］。

此外，近來有報道缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在骨修復中的重要作用，它能影響VEGF對血流的重建，并能調(diào)節(jié)MSCs的遷移［14］。

1.2 骨折局部力學環(huán)境對骨折愈合的影響 骨折區(qū)的力學環(huán)境是影響骨折愈合一個極其重要的方面。早前德國外科醫(yī)師Julius Wolff最早提出力學環(huán)境對骨骼的改建和維持起重要作用。隨后的實驗研究和臨床實踐證明力學環(huán)境在骨折愈合中的重要地位。研究表明，高剛度的固定器械可以限制骨斷端相對位移 （interfragmentary movement，IFM）從而抑制骨痂形成；一定范圍內(nèi)的IFM能夠促進骨痂形成，但過量的IFM會抑制軟骨骨痂礦化，甚至造成骨不連的發(fā)生［15，16］。除了IFM的大小會影響骨痂形成外，IFM相對于骨折斷面的方向也是影響骨痂形成的重要因素。IFM相對于骨折斷面的方向主要有軸向擠壓、軸向牽拉、側(cè)向剪切和彎曲四種。研究證明，適度的軸向擠壓方向IFM能有效地促進骨痂形成并加速軟骨內(nèi)成骨的過程，從而使骨折能夠更快更好地愈合。同等大小的軸向牽拉方向的IFM則主要通過膜內(nèi)成骨的方式促進骨折愈合［17］。側(cè)向剪切和彎曲的IFM抑制骨痂形成，降低骨折愈合組織的強度，延遲骨折愈合時間［18］。應變?yōu)樵谕饬ψ饔孟拢瑔挝婚L度的材料所發(fā)生的形變，即δ=△L/L，一般用百分比表示。不同組織在功能正常的狀態(tài)下可耐受的應變范圍不同，完整骨骼所能承受的應變約為2%（骨折發(fā)生前），肉芽組織所能承受的應變則可達到100%。骨折愈合早期，骨折斷端以血腫和肉芽組織為主，可承受較大范圍的應變。隨著軟骨骨痂的形成和礦化，骨斷端的剛性強度逐漸加大，骨痂的應變逐漸減小，過大或過于頻繁的應力會對骨折愈合造成極為不利的影響。

如上所述，二期愈合是最常見的骨折愈合方式，它并不需要完全穩(wěn)定的微環(huán)境，相反，微動和應力反而促進其愈合。但是，如果微動和應力超過一定的幅度，則可能會導致骨折延遲愈合或者骨不連的發(fā)生［19］。

雖然骨折愈合期間，力學環(huán)境影響骨折修復的重要性已經(jīng)逐漸受到重視。但力學環(huán)境影響骨愈合過程的細胞生物學和分子生物學機制仍不甚清楚。適當?shù)臋C械牽張力可促使成骨細胞內(nèi)一些基因的表達增加。如上所述，這些基因在新骨生成過程中都起著重要作用，如早期反應基因 （c-fos、c-jun、cox-2）、BMP、 堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）及骨鈣素、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、膠原蛋白、TGF-β、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、VEGF、 胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）、血小板源性生長因子 （platelet-derived growth factor，PDG）等［20，21］。

1.3 影響骨折愈合的其他因素 生長激素能刺激骨和軟骨的生長和分化，增加骨密度。它能直接作用于成骨細胞，促進其增殖、分化，激活ALP，提高基質(zhì)中的Ca2+濃度。Fukuhara等發(fā)現(xiàn)無論是給予甲狀旁腺激素合成物的大鼠還是行甲狀旁腺切除術的大鼠，骨折愈合進度都有所延遲［22］。切除甲狀旁腺的大鼠，軟骨內(nèi)骨化和主要的松質(zhì)骨的二次重塑都有所延遲，因而導致骨折愈合過程的受損。而給予甲狀旁腺激素合成物的大鼠，在早期階段對骨吸收和形成顯示促進作用。在后期階段，骨形成良好但骨吸收較差，表明二次骨重塑降低了，愈傷組織有所受損。甲狀旁腺素可能是骨折愈合的重要因素之一。

2 間充質(zhì)干細胞在骨折愈合中的作用

2.1 間充質(zhì)干細胞 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類特殊的干細胞，來源于中胚層的成體干細胞，能夠自我增殖并具有多向分化潛能［23］，普遍存在于人體各組織器官中，以骨髓含量最豐富。而骨髓腔中的MSCs作為一種多能干細胞，是成骨細胞的體內(nèi)來源。間充質(zhì)干細胞的增殖能力決定著成骨分化能力。大量研究結果顯示，MSCs不僅能分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等中胚層細胞［24，25］，而且可以向神經(jīng)細胞、肝細胞、胰島素細胞等內(nèi)胚層或外胚層細胞轉(zhuǎn)化［24-27］。

2.2 間充質(zhì)干細胞的分化與調(diào)控 軟骨內(nèi)成骨是體內(nèi)主要的成骨方式，在MSCs分化為成熟軟骨細胞及成骨細胞的過程中，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的有序表達，其中 Runx2、Sox9家族是發(fā)揮主導作用的調(diào)節(jié)因子之一。Runx2是MSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化的主控轉(zhuǎn)錄因子，能激活與啟動MSCs向成骨細胞系分化并能調(diào)節(jié)成骨細胞的成熟［28，29］；Osterix（OSX）位于成骨細胞分化路徑中Runx2的下游，調(diào)控成骨細胞的生成［30，31］。Sox9 是 MSCs 向軟骨細胞系轉(zhuǎn)化的主控轉(zhuǎn)錄因子，對于軟骨細胞譜系的生成及軟骨特異性蛋白的表達是必不可少的［32］。Runx2、OSX、Sox9的表達水平可以作為MSCs分化方向的直接參考［33］。

2.3 間充質(zhì)干細胞與骨折愈合 MSCs的遷移對于骨折愈合來說是必要的。骨斷端募集的的MSCs的來源至今仍未明確，可能來自于周圍組織和/或循環(huán)當中，細胞可能的來源包括骨髓、骨膜、血管壁、肌肉、循環(huán)血和其他組織器官［34］。有研究顯示，當骨骼受損時一系列特殊的分子在受損部位釋放出來并進入循環(huán)，隨后受傷組織部位以及循環(huán)中的MSCs遷移至受損部位并向特定組織分化［35］。新近的研究［36］顯示，在骨折經(jīng)久不愈的患者中，采用異體皮質(zhì)人工骨復合物移植的方法進行治療，該方法的特色即在于首先提取患者自體髂骨紅骨髓分離間充質(zhì)干細胞并與骨形態(tài)發(fā)生蛋白共同培養(yǎng)，進一步以異體皮質(zhì)人工骨為支架材料，同時導入骨形態(tài)發(fā)生蛋白和間充質(zhì)干細胞，通過人工合成方式制成人工骨復合物，經(jīng)手術植入骨缺損患處，在此治療過程中，骨支架接種骨髓間充質(zhì)干細胞能促進骨愈合能力，在異位移植中也有成骨的特性，還有研究表明異體骨有良好誘導骨產(chǎn)生的特性，異體骨在軟組織中的組織相容性好，無炎癥細胞浸潤。但該過程具體涉及哪些分子的調(diào)節(jié)仍然存有爭議。

另外，MSCs屬于非造血系干細胞，表達CD105、CD73 及 CD44、CD29、CD90， 其中 CD44 是參與骨折愈合的重要因子之一。目前，普遍認為骨髓間充質(zhì)干細胞表面 CD44表達陽性，CD34表達陰性，實驗中即按照 CD44+/CD34-進行骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定，并移植入股骨骨折動物模型。CD44是一種透明質(zhì)酸受體［37，38］；早有研究［39］發(fā)現(xiàn)，CD44-透明質(zhì)酸相互作用與細胞遷移能力相關，如T細胞趨向炎癥部位和間充質(zhì)干細胞遷移向損傷部位等。Zhu等［40］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，與 CD44-/-的骨髓間充質(zhì)干細胞相比，CD44+/+細胞表現(xiàn)出了更強的遷移能力。新近的文獻［41］報道，在骨折中 CD44-透明質(zhì)酸對骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢作用影響明顯，發(fā)現(xiàn)CD44表達有助于骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移從而對損傷的修復作用，可以推測CD44可能是細胞具有高遷移能力的機制之一。

一直以來，BMP-2被認為對MSCs的募集有著重要的意義，但也有人認為BMP-2只是對骨折的愈合作用很大，而其他的BMPs比如 BMP-7卻在祖細胞的募集過程中發(fā)揮重大作用?，F(xiàn)有報道稱，在體內(nèi)，MSCs的遷移主要是通過SDF-1/CXCL12軸調(diào)節(jié)。 SDF-1α 顯著刺激 VEGF，ANG-1，HGF，TGF-β的表達，并受其受體激動劑AMD3100的抑制［42，43］。 近年來，SDF-1/CXCR4 在骨折愈合及 MSCs遷移過程中的作用逐漸被揭示。在骨骼損傷的急性期，SDF－1在骨膜表達，并使造血干細胞和表達CXCR4的間充質(zhì)干細胞在損傷部位聚集［28］。另外，Granero－Molto 等［44］研究發(fā)現(xiàn)移植的 MSCs 只有當其表達CXCR4時才會聚集到骨折部位，而不表達CXCR4者卻沒有這個能力。由此推測微動可能促進SDF－1和CXCR4等與MSCs遷移相關的分子在損傷部位的表達和釋放，從而導致MSCs大量遷移至骨折區(qū)，從而促進骨折的愈合。MSCs進入骨缺損區(qū)域后，不但細胞自身可以釋放出促進新骨生成的生物活性因子，還可以通過旁分泌機制間接促進新血管的生成與成熟，這一過程對于細胞生長和組織修復至關重要［45，46］。但目前對于力學環(huán)境影響骨折區(qū)MSCs募集的具體機制及其涉及的相關信號通路，尚需要進一步研究。

綜上所述，骨折愈合涉及多方面的因素，而隨著研究的不斷深入，對于間充質(zhì)干細胞的認識也越來越來越清晰，骨髓間充質(zhì)干細胞在骨折愈合中的作用也逐漸被揭示。目前，骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)開始用于臨床骨科疾病的治療中，例如在股骨頭壞死及骨折的延期愈合等疾病的治療中都取得了可喜的療效。與此同時，間充質(zhì)干細胞的體外移植的治療方法卻由于技術操作所局限，存在先天的不足，未能廣泛的應用于臨床。該綜述對骨折愈合的影響因素及骨髓間充質(zhì)干細胞在骨折愈合作用進行了總結，為骨折愈合的機制的進一步研究提供參考。

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