劉嬌嬌，張慧變，于林

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

乳腺癌是常見嚴重危及女性生命的惡性腫瘤[1]，位居女性癌癥發(fā)病之首。人類高遷移率族蛋白A(HMGA)家族是一類非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，可與DNA結(jié)合導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)改變，和招募其他轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄增強復(fù)合體，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄，因而也被稱為“構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子”。最初，因HMGA在SDS-PAGE膠中具有高遷移率而得名。HMGA可廣泛參與染色體的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、DNA的損傷修復(fù)、病毒的基因調(diào)控、逆轉(zhuǎn)錄病毒整合至染色體、維持干細胞的分化和自我更新、誘導(dǎo)腫瘤的形成、促進癌細胞代謝等細胞生命活動[2]。HMGA2是HMGA蛋白家族的成員之一，正常體細胞中表達量很低，但在胚胎發(fā)育早期和多種惡性腫瘤中均呈高表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。研究[4]表明，HMGA2的表達與乳腺癌的臨床病理分級呈正相關(guān)，與乳腺癌患者的生存率和預(yù)后均呈負相關(guān)，且HMGA2的異常表達可促進乳腺癌細胞的侵襲、遷移。目前實驗室尚未有穩(wěn)定表達HMGA2蛋白的乳腺癌細胞株。2017年9月～2018年1月，我們構(gòu)建了過表達人HMGA2基因的慢病毒載體，并將其感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，篩選MDA-MB-231細胞HMGA2穩(wěn)定表達株，為進一步研究HMGA2在乳腺癌中的作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro、包裝質(zhì)粒1和包裝質(zhì)粒2由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室石磊教授惠贈；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購于北京全式金公司；MDA-MB-231購于ATCC細胞庫；人腎上皮細胞系293T為本實驗室保存。EcoR1和BamH1限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司；Prime STAR?Max DNA Polymerase購于Takara公司；Ampicillin和SYBR Green購自羅氏公司；Trans 2K PlusⅡ DNA Maker購于北京全式金公司；Puromycin、小量DNA快速回收試劑盒、質(zhì)粒及快速小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自 Pierce 公司；BeyoECL Plus超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于碧云天公司?？贵w：Anti-HMGA2兔源多克隆抗體購于Abcam公司。辣根過氧化氫酶標(biāo)抗鼠IgG、抗兔IgG為美國KPL公司產(chǎn)品。由蘇州金唯智公司完成所有引物合成和基因測序工作。

2 方法及結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體pLVX-HMGA2的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 HMGA2蛋白CDS片段獲取 取適量對數(shù)生長期MDA-MB-231，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA；以cDNA為模板，根據(jù)HMGA2的CDS序列(NM_003483.4)設(shè)計含有EcoR1和BamH1限制性內(nèi)切酶位點的引物序列。上游引物5′-CCGGAATTCATGAGCGCACGCGGTGAGGG-3′；下游引物5′-CGCGGATCCCTAGTCCTCTTCGGCAGACTC-3′。PCR反應(yīng)體系及條件參照Prime STAR?Max DNA Polymerase說明書。擴增并回收的HMGA2蛋白CDS片段長度約為327 bp。

2.1.2 pLVX-HMGA2重組質(zhì)粒構(gòu)建與擴增 采用EcoR1、BamH1酶對純化后的HMGA2蛋白CDS片段及pLVX-IRES-puro-FLAG-SND1質(zhì)粒進行雙酶切，電泳分離，回收酶切后產(chǎn)物。線性pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒載體與酶切后的HMGA2基因CDS片段具有相同黏性末端，加入T4 DNA連接酶25 ℃連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，于含有氨芐青霉素抗性的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆物，搖菌擴增并提取pLVX-HMGA2重組質(zhì)粒。最終挑取14個陽性克隆菌株，菌液PCR電泳條帶均位于327 bp左右，初步證明重組質(zhì)粒PLV-HMGA2構(gòu)建成功。

2.1.3 pLVX-HMGA2重組質(zhì)粒鑒定 挑取1、2、3號菌落搖菌，200 rpm，37 ℃過夜。以HMGA2特異性引物為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，將提取克隆物進行菌液PCR鑒定，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段長度。采用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH1對pLVX-HMGA2重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，并以1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小。同時對重組質(zhì)粒進行基因測序鑒定。酶切后兩條帶分別位于8 140 bp左右和327 bp左右，證明HMGA2蛋白CDS序列成功插入載體。質(zhì)粒PCR結(jié)果條帶均位于327 bp左右，基因測序結(jié)果與HMGA2蛋白CDS序列完全一致。

2.2 MDA-MB-231細胞HMGA2穩(wěn)定表達株的構(gòu)建及鑒定

2.2.1 pLVX-HMGA2慢病毒質(zhì)粒包裝 待常規(guī)傳代培養(yǎng)的293T細胞匯合率為70%時，將2種包裝質(zhì)粒同pLVX-HMGA2重組質(zhì)粒在聚乙烯亞胺介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染6 h后換液，轉(zhuǎn)染24、48 h分別收集培養(yǎng)液上清，0.45 μm的濾器過濾，-80 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 MDA-MB-231細胞HMGA2穩(wěn)定表達株的構(gòu)建 取適量對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，待其匯合率達60%時，將細胞分為觀察組、對照組兩組，觀察組、對照組分別感染重組慢病毒Plv-HMGA2、空載慢病毒Plv-Vector，感染48 h加入1 μg/mL嘌呤霉素進行篩選，待MDA-MB-231野生型細胞全部死亡時停止加藥，獲得HMGA2慢病毒過表達穩(wěn)定株。

觀察組、對照組細胞HMGA2 mRNA相對表達量分別為10 273.93±4 290.77、1.18±0.81，二者比較，P<0.05。觀察組、對照組細胞HMGA2 蛋白相對表達量分別為1.570±0.080、0.110±0.002，二者比較，P<0.05。

3 討論

HMGA家族是一類通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，包括蛋白HMGA1a(HMGI,HMGI/Y)、HMGA1b(HMGY)、 HMGA1c(HMG-I/R)和蛋白HMGA2(HMGI-C)[5]。人類HMGA2蛋白與胚胎形成、智力發(fā)育、肥胖發(fā)生等多種生理學(xué)功能有關(guān)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有非常重要的作用。HMGA2蛋白在惡性腫瘤中高表達，且HMGA2蛋白表達程度與腫瘤分化程度和預(yù)后相關(guān)[6]。

編碼人類HMGA2蛋白的基因位于12q13-15，HMGA2基因含有5個獨立外顯子，均參與HMGA2蛋白的編碼。HMGA2蛋白由108個氨基酸殘基組成，同HMGA蛋白家族具有相同的特點，羧基端均含有酸性氨基酸殘基，氨基端含有三個被11～23個氨基酸隔開的重復(fù)并保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性地識別4～8對A、T堿基對長度的B型DNA區(qū)域，并與此AT富集區(qū)結(jié)合，因此被稱為AT-hook基序。AT-hook基序是由賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、色氨酸組成的十肽結(jié)構(gòu)，其核心結(jié)構(gòu)由精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(RGRP)組成，因此AT-hook基序也被稱為RGRP基序[7]。AT-hook基序是HMGA蛋白家族的重要組成結(jié)構(gòu)，是與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。按結(jié)構(gòu)可將AT-hook基序分為三部分，其核心是由精氨酸-甘氨酸-精氨酸組成的凹面結(jié)構(gòu)，能完美地嵌入DNA小溝的A、T堿基對中，核心結(jié)構(gòu)兩端具有帶正電荷的脯氨酸，能通過電荷作用與DNA骨架帶負電荷的磷酸基團相結(jié)合，進一步促進HMGA2蛋白與DNA的結(jié)合，核心結(jié)構(gòu)兩端的精氨酸和賴氨酸殘基，通過靜電作用力和疏水作用力與DNA骨架相結(jié)合[8]。AT-hook模體具有三種類型，不同類型的AT-hook模體與DNA的親和性不同，旁側(cè)序列也不同。在與DNA高親和的模體中，核心結(jié)構(gòu)的氨基端有一個含6個氨基酸的延伸結(jié)構(gòu)，與DNA小溝邊緣的糖-磷酸骨架相互作用，是提高HMGA蛋白與DNA親和性的重要結(jié)構(gòu)。

人類HMGA2蛋白作為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白,能使DNA發(fā)生彎曲等結(jié)構(gòu)改變，參與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工、DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑等多種生理活動，特別是在組裝形成多蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體中具有重要的作用[9]。HMGA2蛋白能夠直接與DNA結(jié)合，改變DNA的構(gòu)象，促進轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，形成更加穩(wěn)定的DNA-蛋白復(fù)合體[6]。HMGA2作為增強子結(jié)合蛋白，其本身并不具有轉(zhuǎn)錄活性，而是通過與其靶基因的AT-rich區(qū)結(jié)合，并招募其他轉(zhuǎn)錄因子，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究[10]發(fā)現(xiàn)，HMGA2蛋白能與靶基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而促進基因轉(zhuǎn)錄，如HMGA2與細胞周期調(diào)控基因cyclinA的啟動子區(qū)結(jié)合，促進cyclinA基因的表達。HMGA2也與靶基因的增強子區(qū)直接結(jié)合，在人類脂肪瘤中，HMGA2蛋白與IMP2基因第一個內(nèi)含子處的AT-rich區(qū)直接結(jié)合，和NF-κB因子共同調(diào)節(jié)IMP2基因的表達[11]。人類HMGA2蛋白在腫瘤細胞表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中也起著重要作用，它激活TGFβ信號通路，從而誘導(dǎo)人類上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。有研究表明，HMGA2在腎細胞癌中促進EMT,增強腫瘤細胞的侵襲遷移能力[13],HMGA2在惡性膠質(zhì)瘤中增強膠質(zhì)瘤細胞的多能性，促進癌細胞的增值、侵襲遷移能力，促進腫瘤的發(fā)生[14]。

HMGA2是LIN28/let-7通路重要的下游分子，let-7 是microRNA中的一個家族，具有抑制HMGA2蛋白表達的作用，HMGA2信使RNA(mRNA)的3′非編碼區(qū)(3′UTR)上有7個let-7的結(jié)合位點。在人類淋巴瘤和白血病中，HMGA2基因常發(fā)生重排，形成融合基因或者縮短形式的HMGA2基因，因此HMGA2基因轉(zhuǎn)錄的mRNA丟失了let-7結(jié)合位點[15]。有研究表明，在人類造血干細胞發(fā)育、分化和成熟的過程中，HMGA2存在不同的可變剪接體來維持造血干細胞自我更新等功能，這些可變剪接體具有不同的3′UTR，縮短形式的可變剪接體3′UTR較短且不含let-7的結(jié)合位點，在let-7高表達的臍血源性的造血干細胞中，CLK3激酶起到調(diào)節(jié)HMGA2基因mRNA可變剪接體表達的作用，促進丟失let-7位點的mRNA表達，使得縮短形式的HMGA2蛋白高表達。在人類脂肪瘤中，也存在縮短形式的HMGA2蛋白，同HMGA2蛋白一同促進IMP2基因的表達[11]。

蛋白酶激活受1(PAR1)被認為是在乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起重要作用的原癌基因，研究表明，HMGA2蛋白是PAR1的重要調(diào)節(jié)因子，在人類乳腺癌中增強腫瘤細胞的侵襲能力[17]。HMGA2蛋白可能是潛在的治療人類乳腺癌的作用靶點，Mansoori等[18]發(fā)現(xiàn)抑制HMGA2蛋白在人類乳腺癌細胞MDA-MB-468中的表達能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，HMGA2可能成為通過促進細胞凋亡和細胞周期阻滯治療人類乳腺癌的作用位點，研究[19]同時也發(fā)現(xiàn)以siRNA沉默HMGA2能夠增強紫杉醇的化療敏感性。本實驗以慢病毒為載體在人類乳腺癌細胞MDA-MB-231中導(dǎo)入外源性HMGA2基因，較用脂質(zhì)體導(dǎo)入普通質(zhì)粒更加高效和穩(wěn)定。慢病毒載體是通過人類免疫缺陷1型病毒進行改造所得，能夠?qū)⒛康幕蛘现良毎蚪M中，使轉(zhuǎn)染效果更穩(wěn)定，同時具有能夠轉(zhuǎn)染分裂和非分裂細胞、不表達病毒蛋白、能夠傳遞復(fù)雜的遺傳元件等優(yōu)點[20]。慢病毒載體在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床治療均具有較好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究采用重組慢病毒技術(shù)成功成功構(gòu)建HMGA2基因慢病毒表達載體pLVX-HMGA2，通過嘌呤霉素篩選得到MDA-MB-231細胞HMGA2穩(wěn)定表達株，為進一步研究HMGA2蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及臨床治療中的作用奠定基礎(chǔ)。