張媛媛

( 四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，成都610041)

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病，主要臨床表現(xiàn)為食欲減退、惡心、上腹部不是、肝區(qū)痛、乏力等，隨病情進展可發(fā)展成肝硬化，少數(shù)可發(fā)展為肝癌。近年來，乙型病毒性肝炎的發(fā)病率逐年增高。探索具有實際應(yīng)用價值的HBV感染模型或功能基因表達模型，加快HBV致病機理探討、抗病毒藥物篩選和疫苗研究等進程，是當今乙型肝炎防治研究的重大課題。腺病毒載體是常用的病毒轉(zhuǎn)染載體，基因轉(zhuǎn)染效率高。含1.3拷貝的HBV復(fù)制水平高，是常用的實驗室HBV片段。目前關(guān)于腺病毒介導的HBV在體內(nèi)外的復(fù)制、表達情況相關(guān)報道較少。本研究構(gòu)建復(fù)制型HBV重組腺病毒Ad-HBV4.1[1～4]，觀察其在HepG2細胞中的復(fù)制情況及在BalB/C小鼠肝細胞內(nèi)的表達情況，為建立高效復(fù)制的HBV細胞模型和動物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑及儀器 人胚腎細胞系HEK293，人肝癌細胞株HepG2、HepG2.2.15，由四川大學肝病實驗室惠贈；雄性BALB/C小鼠30只購自四川大學實驗動物中心；質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒購自QIAGNE公司；鼠抗-HBs多克隆抗體、兔抗-HBc多克隆抗體、辣根酶標記標記的羊抗兔-IgG、辣根酶標記標記的馬抗鼠-IgG、鏈親和素標記的辣根酶購自北京中杉生物工程有限公司。

1.2 Ad-HBV4.1的構(gòu)建及感染復(fù)數(shù)測算 取適量HEK293細胞，37 ℃解凍、融化，含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。從含1.3拷貝HBV DNA片段的質(zhì)粒pTh-HBV4.1中，通過NotⅠ和KpnⅠ酶切獲取HBV4.1片段，插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HBV4.1。將pAdTrack-HBV4.1線性化后在大腸桿菌BJ5183內(nèi)與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進行同源重組，形成pAd-HBV4.1。將pAd-HBV4.1用pac Ⅰ酶切后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至HEK293細胞進行包裝和擴增，獲得Ad-HBV4.1，將病毒液Ad-HBV4.1感染90%融合的HEK293細胞，培養(yǎng)細胞，反復(fù)凍融4次裂解細胞，收集含Ad-HBV4.1的上清。擴增72 h時熒光顯微鏡下觀察HEK293細胞中Ad-HBV4.1的熒光情況。采用聚乙二醇法濃縮Ad-HBV4.1，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。用終點稀釋法計數(shù)熒光數(shù)測定病毒的滴度。將HEK293細胞以1×104/孔密度接種96孔板(100 μL/孔)，加入培養(yǎng)液做10-3～10-10系列稀釋，每一稀釋度占用一行，每一行的第1～10孔加入100 μL病毒稀釋液，第11、12孔加入100 μL 培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)24 h時在熒光顯微鏡下計數(shù)第1～10各孔發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)，計算病毒滴度。病毒滴度(efu/mL)=發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/0.1 mL。用感染復(fù)數(shù)(MOI)試驗測算感染細胞需要相應(yīng)MOI的病毒液體積。

1.3 Ad-HBV4.1感染的HepG2細胞復(fù)制情況觀察 ①采用免疫組化法檢測Ad-HBV4.1感染的HepG2細胞中HBsAg、HBcAg 取MOI為100的Ad-HBV4.1感染HepG2細胞。轉(zhuǎn)染72 h時后熒光顯微鏡下觀察，約有90%以上的細胞GFP表達陽性。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。顯微鏡下觀察Ad-HBV4.1感染的HepG2、HepG2細胞HBsAg、HBcAg表達。HBcAg胞質(zhì)為棕黃色或胞質(zhì)含有棕黃色顆粒信號的細胞為HBsAg陽性細胞；胞質(zhì)或胞核為棕黃色或胞質(zhì)含有棕黃色顆粒信號的細胞為HBcAg陽性細胞。細胞之間染色強度相同，且累積一片細胞，提示反應(yīng)為非特異性。切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域的細胞區(qū)，不能判為陽性。②采用Southern吸印雜交法檢測細胞HBV DNA復(fù)制中間體取適量d-HBV4.1感染的HepG2細胞、HepG2細胞，提取細胞HBV DNA復(fù)制中間體，電泳后用毛細管法轉(zhuǎn)印至尼龍膜，以地高辛標記探針預(yù)雜交及雜交過夜，化學發(fā)光法檢測復(fù)制中間體[5]。

1.4 Ad-HBV4.1在BalB/C小鼠肝細胞內(nèi)的表達情況觀察 取BalB/C小鼠30，分為5組，每組6只。一組1 mL的Ad-HBV4.1 (約108efu/mL)尾靜脈普通注射，注射時間>15 s；二組1 mL的Ad-HBV4.1 腹腔注射。三組10 μg的pHBV4.1片段用1.8 mL生理鹽水稀釋，尾靜脈高壓5～8 s內(nèi)完成注射。四、五組分別采用生理鹽水1.8 mL尾靜脈、腹腔注射。注射第3 d處死三組小鼠，注射第1、3、5 d處死其余各組小鼠，取出肝組織，福爾馬林固定24 h，脫水、透明、包埋，4 μm連續(xù)切片，80 ℃烘干備用。采用免疫組化法檢測各組小鼠肝組織HBcAg,所有操作均嚴格按照使用說明書進行。染色后細胞胞質(zhì)和/或胞核染色中存在棕黃色顆粒的提示存在HBcAg表達。

2 結(jié)果

擴增72 h時，顯微鏡下可觀察到HEK293細胞胞質(zhì)存在綠色熒光。40倍鏡下可見“彗星”樣的匯聚中心；100倍鏡下可見細胞腫脹稍變圓，細胞核增大，折光性增強，并逐漸呈漂浮生長。培養(yǎng)24 h時Ad-HBV4.1病毒滴度為2.6～3.2×108efu/mL。

2.1 Ad-HBV4.1感染的HepG2細胞復(fù)制情況 感染72 h時，Ad-HBV4.1感染HepG2的細胞胞質(zhì)中存在綠色熒光。200倍鏡下可見細胞核增大，折光性增強。

Ad-HBV4.1感染的HepG2胞質(zhì)中存在HBsAg表達，陽性率達90%以上,HepG2細胞胞質(zhì)中未見HBsAg表達。Ad-HBV4.1感染的HepG2胞質(zhì)中存在HBcAg表達，陽性率達90%以上,HepG2細胞胞質(zhì)中未見HBcAg表達。

轉(zhuǎn)染72 h時，HepG2細胞中未能檢測到HBV DNA復(fù)制中間體；Ad-HBV4.1感染的HepG2細胞中存在HBV DNA復(fù)制中間體。

2.2 Ad-HBV4.1在BalB/C小鼠肝細胞內(nèi)的表達情況 第1、3 d時一組小鼠肝組織中未見HBcAg，第5 d小鼠肝組織中可見HBcAg；各時段二組小鼠肝組織均未見HBcAg表達；第3 d三組肝組織中可見HBcAg；各時段四、五組小鼠肝組織均未見HBcAg表達。

3 討論

目前研究HBV的細胞模型主要分為兩種:①HBV感染細胞模型。即直接用含HBV的血清去感染原代肝細胞(原代肝細胞多取自肝活檢或通過對肝臟進行門靜脈灌注而獲得)。但原代肝細胞來源有限, 肝內(nèi)成分有易變性, 其應(yīng)用受到限制。② HBV轉(zhuǎn)染細胞模型。主要是通過DNA-磷酸鈣共沉淀、電穿孔技術(shù)、病毒載體、脂質(zhì)體介導等方法將HBV及其基因片段導入靶細胞中，可獲得HBV DNA基因組的復(fù)制和表達。目前應(yīng)用最多的是將攜帶有HBV DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，有報道轉(zhuǎn)染同一質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至HepG2細胞的轉(zhuǎn)染效率較DNA-磷酸鈣共沉淀法高25%～33%，而脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至HepG2細胞的效率大多為40%～60%，效率仍不是很高[5,6]。

在體內(nèi)模型里,應(yīng)用較多的是小鼠模型，包括①轉(zhuǎn)基因小鼠 研究[7]顯示HBV1.3轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的病毒復(fù)制水平最高，可檢測到各種病毒復(fù)制中間體和RNA。但轉(zhuǎn)基因小鼠與自然感染病毒不同,不能檢測到cDNA，故不能用于研究病毒進入和病毒擴散及抗病毒藥物對病毒的清除作用等。②HBV感染小鼠 重組腺病毒載體介導的病毒感染模型:Sprinzl等[8]利用Ad-DHBV1.3系統(tǒng),將重組腺病毒接種小鼠,5 d后在其肝臟及血清中均可檢測出復(fù)制型DHBV。說明DHBV可以通過腺病毒轉(zhuǎn)移到小鼠肝臟并支持DHBV體內(nèi)復(fù)制。高壓注射HBV DNA導致的病毒感染模型:給小鼠尾靜脈短時間注射目的基因后,在其肝臟中檢測到基因表達產(chǎn)物。孟忠吉等[9～11]采用高壓水注射方法,通過尾靜脈將具有復(fù)制能力的HBV質(zhì)粒導入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)HBV基因可在小鼠體內(nèi)表達和復(fù)制。③人鼠嵌合肝動物模型：免疫缺陷鼠具有一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分的缺陷,不能引發(fā)因人和鼠MHC-I抗原不同所致的排斥反應(yīng), 使得異種移植物存活成為可能。但該模型中人肝細胞的存活數(shù)量較少,而且其建立需要較嚴格的技術(shù)[12,13]。

從上世紀九十年代腺病毒就開始作為基因治療的有效載體。腺病毒載體最大的優(yōu)點之一就是可在包裝細胞內(nèi)高滴度復(fù)制，可感染多種分裂期和非分裂期細胞。第三代腺病毒載體，也叫假病毒或輔助依賴性腺病毒。這類腺病毒載體缺少病毒外殼蛋白，所以免疫原性大大降低，而且導入基因表達時間長，這類E1區(qū)缺失的腺病毒載體在293細胞或其它E1區(qū)互補的包裝細胞系內(nèi)復(fù)制。腺病毒載體作為目前最常用的生物治療載體之一具有包裝容量大、感染效率高、外源基因表達水平較高且相對較安全等優(yōu)點。

本實驗室結(jié)合腺病毒載體基因轉(zhuǎn)染效率高和1.3拷貝HBV復(fù)制水平高的優(yōu)勢，利用一種改良的細菌內(nèi)同源重組制備腺病毒的方法，已構(gòu)建了含1.3拷貝HBV DNA片段(HBV4.1)的重組腺病毒Ad-HBV4.1。本研究將已構(gòu)建好的復(fù)制型HBV重組腺病毒Ad-HBV4.1在HEK293細胞中大量擴增，并通過聚乙二醇方法濃縮病毒，得到滴度為2.6～3.2×108efu/mL的重組腺病毒，從而為進一步感染細胞和小鼠提供可能。

本研究選擇HepG2作為靶細胞，用Ad-HBV4.1感染HepG2細胞構(gòu)建HBV的體外模型。因Ad-HBV4.1攜帶有綠色熒光蛋白基因，在感染HepG2細胞后72 h，我們可以在熒光顯微鏡下觀察到HepG2細胞胞漿發(fā)綠色熒光，且發(fā)綠色熒光的細胞達90%以上，感染效率較高。同時取細胞爬片，分別進行免疫組化HBsAg、HBcAg染色檢測，均可見表達，提示HBV感染HepG2細胞后，能很快地進行轉(zhuǎn)錄并表達產(chǎn)生HBV特異性抗原。且HBsAg、HBcAg染色的陽性率達90%以上。通過Southern吸印雜交方法可檢測到HBV DNA復(fù)制中間體，提示HBV可通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBV復(fù)制中間體DNA。這說明本實驗室構(gòu)建的Ad-HBV4.1可以在體外感染靶細胞，并可進行HBV的復(fù)制,以及目的基因的正確表達。

以腺病毒為載體將具有復(fù)制能力的HBV基因組導入HepG2細胞與將HBV重組復(fù)制型質(zhì)粒pHBV4.1轉(zhuǎn)染至HepG2細胞構(gòu)建的HBV體外模型相比，后者建立模型的細胞篩選工作較為繁瑣，周期較長，且轉(zhuǎn)染效率更低。而將HBV基因組插入腺病毒基因組中，借助腺病毒的感染過程很容易把HBV基因組轉(zhuǎn)入宿主細胞，極大地提高了轉(zhuǎn)染效率，也使轉(zhuǎn)染過程更加穩(wěn)定。

攜帶有HBV基因的重組腺病毒通過腹腔注射或者靜脈注射均可在肝臟表達目的基因，而本研究用Ad-HBV4.1通過腹腔注射和尾靜脈注射兩種方式同時感染BalB/C小鼠，分別在第1、3、5天處死小鼠，取出小鼠肝組織，進行免疫組化HBcAg染色顯示僅尾靜脈注射第5天者為陽性，其余均為陰性。提示通過重組腺病毒作為載體將HBV導入小鼠體內(nèi)，可在小鼠體內(nèi)感染，并進行目的基因的正確表達。而相同的重組腺病毒滴度情況下，通過尾靜脈注射的方式到達肝臟這一靶器官的病毒濃度高于腹腔注射的方式，更容易構(gòu)建成功HBV的感染模型。

研究[13]證實通過高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法可構(gòu)建急性HBV感染的小鼠模型，且在第3天目的基因的表達最強。它的基本原理是通過小鼠尾靜脈快速注入大容量的質(zhì)粒DNA溶液，造成小鼠短暫的心衰，使液體由下腔靜脈經(jīng)肝靜脈迅速返流入肝臟，使得DNA未能與血清中的核酸酶有效接觸就進入了肝細胞。本研究通過重組腺病毒載體介導的方式也可成功第5天開始在小鼠模型中觀察到HBV表達，時間較高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法晚，本模型HBV表達持續(xù)時間是否較高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法更長，還需進一步的研究。尾靜脈高壓注射，可因為一次性高容量的注射對小鼠肝臟可能造成一定的損傷,以及可能增加的心臟負荷甚至導致小鼠死亡的可能。而本模型注射的途徑是直接通過小鼠尾靜脈普通注射，無需外科手術(shù)和特殊的設(shè)備裝置，卻達到了和尾靜脈高壓注射相似的效果，所以該模型的建立簡單、方便、安全。

綜上所述，Ad-HBV4.1感染HepG2細胞成功建立HBV復(fù)制與表達的體外模型，感染效率達90%以上，可見HBsAg、HBcAg及HBV DNA復(fù)制中間體表達。Ad-HBV4.1尾靜脈注射BalB/C小鼠肝組織存在HBV表達。