孫新六

(泰安市中心醫(yī)院，山東泰安271000)

胎盤形成過程中，絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮壁不斷重塑，侵入母體子宮內(nèi)壁蛻膜，改造子宮壁螺旋動脈，形成豐富的血管通道，使母體和胎兒間有足夠營養(yǎng)和氣體交換[1]。人黑色素轉(zhuǎn)移抑制基因(KP)與胎盤形成有關(guān)。絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞有KP和抗人黑色素轉(zhuǎn)移抑制基因蛋白受體(GPR54)表達(dá)，KP與GPR54結(jié)合能影響癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，并調(diào)節(jié)生殖功能、影響內(nèi)分泌[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)壁的入侵過程中發(fā)揮重要作用[3]。2016年3月～2017年5月，本研究探討了KP對早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、MMP-9、VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 胎盤及試劑來源 胎盤來自本院自愿終止妊娠者[妊娠<3個月、年齡(27.6±5.8)歲，均為初孕，孕周(8.6±1.2)周，均知情同意]。鼠源GPR54抗體、鼠源抗人KP抗體、鼠源抗人β-actin抗體均購于BOSTER公司。KP抑制劑P234購于美國Abcam公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 滋養(yǎng)層細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組 取胎盤，無菌狀態(tài)下剪取胎盤絨毛膜組織，用預(yù)先冰冷的PBS液漂洗3次，用眼科鑷子剪成碎塊，在含有0.25%胰蛋白酶和DNA酶(200 U/mL)溶液中37 ℃消化3次，30 min/次，收集懸浮細(xì)胞，去組織塊，PBS液漂洗2次，以Percoll液梯度離心(3 000 r/min，20 min)分離細(xì)胞。將細(xì)胞收集于培養(yǎng)皿中，用RPMI1640液培養(yǎng)1 h，巨噬細(xì)胞貼壁，懸浮細(xì)胞，接種于24孔板，用含10%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h。將滋養(yǎng)層細(xì)胞隨機(jī)分為三組，對照組常規(guī)培養(yǎng)，KP組加入終濃度為100 nmol/L KP蛋白進(jìn)行培養(yǎng)，KP+P234組加入終濃度為100 nmol/L KP蛋白及其抑制劑P234(終濃度5 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)，均培養(yǎng)30 min。

1.3 滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實驗。收集三組細(xì)胞，于6孔板中生長融合后，以吸頭輕輕劃痕，無菌PBS液輕柔沖去劃痕中散落的細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h。于顯微鏡下分別測量0、48 h劃痕的寬度，計算遷移率。細(xì)胞遷移率=48 h劃痕兩邊緣距離減小值/0 h劃痕兩邊緣距離×100%，對照組遷移率為1。

1.4 細(xì)胞內(nèi)KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，采用TRIzol液常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR。KP正向引物：5′-CTCACTGGTTTCTTGGCAGCTAC-3′、反向引物：5′-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3′；GPR54正向引物：5′-GCTGGTACGTGAC GGTGTTC-3′、反向引物：5′-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3′；MMP-9正向引物：5′-TGGAGGTTCGACGTGAAGG-3′、反向引物：5′-AAATAGGCTTTC TCTCGGTACTGG-3′；VEGF正向引物：5′-ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3′、反向引物:5′-TGGCCGTTGAGGTTGGAATG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性和延伸40 s，40個循環(huán)。同時擴(kuò)增內(nèi)參β-actin。以2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)檢測 收集三組細(xì)胞，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，Western blotting法檢測ERK和磷酸化的ERK(p-EKR)，實驗組蛋白相對表達(dá)量=p-ERK/ERK。

2 結(jié)果

2.1 三組滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力比較 對照組細(xì)胞遷移率為1，KP組為55.9%，KP+P234組為81.8%，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 三組KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA表達(dá)比較 對照組KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA相對表達(dá)量均為1，KP組分別為1.05±0.03、1.03±0.02、0.36±0.10、0.48±0.13，KP±P234組分別為0.58±0.12、1.04±0.06、0.62±0.15、0.85±0.17。KP組KP mRNA相對表達(dá)量較KP+234組高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；三組GPR54 mRNA相對表達(dá)量比較，P均>0.05；與對照組比較，KP組、KP±P234組MMP-9、VEGF mRNA相對表達(dá)量低(P均<0.05)，KP組最低(P均<0.05)。

2.3 三組ERK蛋白表達(dá)比較 對照組p-ERK/ERK為1，KP組為2.3±0.5，KP+P234組為1.6±0.3，與對照組比較，KP組、KP±P234組ERK蛋白相對表達(dá)量低(P均<0.05)，KP組最低(P均<0.05)。

3 討論

KP結(jié)合G蛋白受體GPR54，可激活磷脂酶C，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。KP能激活細(xì)胞中的ERK信號通路，使細(xì)胞永生化[4]。KP和GPR54最初均表達(dá)于受精卵合胞體細(xì)胞，與胎盤的形成有關(guān)；胎盤形成過程失調(diào)可致多種孕期并發(fā)癥[5]，如滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵貧乏可致患者出現(xiàn)子癇前期癥狀、胎兒宮內(nèi)生長受限；胎盤形成過度入侵則致胎盤異常增生[6]。絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞有KP和GPR54表達(dá)[7]。KP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在早期和末期胎盤中無差異；但GPR54在早期胎盤的表達(dá)高于末期胎盤[8]。這與懷孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞高侵入性而末期胎盤低侵入性相一致。本研究結(jié)果表明，早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均表達(dá)GPR54、KP，提示GRP54、KP與早期胎盤的發(fā)育可能相關(guān)。

絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對入侵血管的過程與腫瘤細(xì)胞相似，MMP、VEGF在其中發(fā)揮重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，KP可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移，影響子宮內(nèi)壁的重塑。KP干預(yù)后，滋養(yǎng)層細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)降低，加入KP抑制劑P234則ERK蛋白表達(dá)高。其作用機(jī)制可能為KP與其受體GPR54結(jié)合后，激活磷脂酶C，使二磷酸磷脂酰肌醇水解，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇和甘油二酯，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，磷酸化ERK，從而產(chǎn)生生物學(xué)作用[10]。提示KP能刺激ERK磷酸化從而抑制ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用。

MMP能降解細(xì)胞外基底膜，在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對螺旋動脈的重塑過程中起重要作用。MMP-9表達(dá)減少時，滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵能力減弱，胎盤形成不良，易誘發(fā)子癇前期癥狀及胎兒宮內(nèi)生長受限[11]。KP可控制MMP-9活性，其可能通過調(diào)節(jié)MMP的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抑制作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮內(nèi)膜，通過替換血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)壁血管[12]。本研究結(jié)果顯示，KP能降低滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)MMP-9、VEGF mRNA表達(dá)，提示MMP-9和VEGF參與胎盤形成過程。

綜上所述，KP可抑制早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞內(nèi)ERK、MMP-9及VEGF表達(dá)。

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