郭觀華，黃自明，陳麗萍

（湛江中心人民醫(yī)院心內(nèi)二科，廣東 湛江 524037）

冠狀動脈疾病 （coronary artery disease，CAD）是一種常見的心血管疾病 （cardiovascular disease，CVD） ，是造成全球死亡率上升的主要原因之一［1］。心臟核磁共振、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像和血管造影常用于CAD的診斷，準(zhǔn)確率較高，但不穩(wěn)定的圖像質(zhì)量和有創(chuàng)的檢查方式限制了其臨床應(yīng)用，因此尋找一種創(chuàng)傷更小、準(zhǔn)確率更高的檢查手段已成為臨床關(guān)注的重點［2］。

mircoRNA （miRNA） 是一類長度為19～25個核苷酸的短鏈非編碼RNA，能夠通過啟動RNA的降解抑制RNA的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［3］。研究［4］表明，miRNA在CAD的病理過程中發(fā)揮著重要作用，如miR-206能夠通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)延緩CAD的進(jìn)展。血管生成在CAD的發(fā)病機(jī)制中有重要作用，某些miRNA具有調(diào)控血管生成的功能，然而，這些血管生成相關(guān)miRNA在CAD中的作用尚不明確。因此，本研究從以往的研究中篩選出20個與血管生成有關(guān)的miRNA，探討了這些miRNA在CAD診斷中的作用及其與CAD疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究分為探索階段和驗證階段。探索階段旨在從小樣本中初步篩選CAD患者中的血管生成相關(guān)差異表達(dá)miRNAs （differently expressed microRNA，DEMs） ，驗證階段旨在從較大的樣本中檢驗血管生成相關(guān)DEMs在CAD患者與HCs中的表達(dá)差異及其與CAD發(fā)病風(fēng)險和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

在探索階段，選取2015年4月至7月于湛江中心人民醫(yī)院經(jīng)血管造影確診為CAD的患者10例，排除心臟射血分?jǐn)?shù)受損、心衰、不穩(wěn)定CAD或急性心肌損傷的患者。同時選取10例無CAD證據(jù)的健康受試者作為健康對照 （health control，HCs）。排除標(biāo)準(zhǔn)：有白血球減少癥病史；血小板減少癥；嚴(yán)重感染；CVD；有腦血管疾病或惡性病史；肝功能或腎功能衰竭。

在驗證階段，選取2015年4月至2016年9月入院的142例CAD患者及140例HCs，入組及排除標(biāo)準(zhǔn)同探索階段。本研究經(jīng)湛江中心人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得所有受試者知情同意。

1.2 CAD患者基本信息

采用Gensini評分系統(tǒng)評估CAD患者疾病嚴(yán)重程度。包括計算血管腔的狹窄程度以及心臟病變和斑塊的X線表現(xiàn)。每處病變的積分為狹窄程度評分乘以病變部位評分。管腔狹窄程度分為25%，50%，75%，90%，99%和全閉，對應(yīng)分?jǐn)?shù)為1，2，4，8，16和32分。病變部位評分為：左主干病變，5分；左前降支病變，2.5分；左回旋支病變，2.5分；左前降支中段病變，1.5分；右主干病變、左前降支遠(yuǎn)端病變、后外側(cè)動脈病變以及鈍緣支動脈病變，1分；其他動脈病變，0.5分。

1.3 樣本采集與處理

采集CAD患者及HCs外周血樣本，并置于EDTA-3k管中保存。室溫放置2 h后，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，提取血漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min。于-80 ℃凍存。

1.4 實時熒光定量PCR

采用TRIzol LS Reagent試劑盒 （美國Ambion公司） 抽提總RNA。采用PrimerScript Real-time試劑盒（日本TaKaRa公司） 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （日本TaKaRa公司） 染料法測定備選RNA的相對表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參基因，最后結(jié)果通過方程2-ΔΔCt計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用頻數(shù) （百分位數(shù)） 表示，計量資料用±s或中位值（25分位值～75分位值） 表示。2組間差異比較采用t檢驗或Mann-Whitney檢驗。采用Spearman相關(guān)分析DEMs表達(dá)水平與Gensini評分的關(guān)系。采用單元及多元邏輯回歸分析CAD的風(fēng)險因素。制作受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線對備選miRNA對于CAD的診斷價值進(jìn)行分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探索階段DEMs

如表1所示，探索階段CAD患者及HCs的平均年齡、男女比例、體質(zhì)量指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

如表2所示，探索階段CAD患者miR-19a、miR-92a、miR-126、miR-130a、miR-210、miR-221、miR-296和miR-378的表達(dá)水平均顯著低于HCs，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。探索階段DEMs均被納入驗證階段進(jìn)行分析。

2.2 驗證階段DEMs

如表3所示，驗證階段CAD患者與HCs平均年齡、男女比例、體質(zhì)量指數(shù)等一般信息無統(tǒng)計學(xué)差異。

如圖2所示，驗證階段CAD患者miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378的表達(dá)量顯著低于HCs （均P ＜ 0.05） 。然而，2組間miR-19a （P = 0.170） 、miR-92a（P = 0.108） 、miR-221 （P = 0.108） 和miR-296 （P =0.966） 的相對表達(dá)量并無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 探索階段CAD患者與HCs一般資料Tab.1 Characteristics of CAD patients and healthy controls in exploration stage

表2 探索階段20個血管生成相關(guān)miRNAs在CAD患者和HCs中的表達(dá)量Tab.2 Expression of 20 angiogenic miRNAs in CAD patients and HCs in exploration stage

表3 驗證階段CAD患者與HCs一般資料Tab.3 Characteristics of CAD patients and HCs in validation stage

2.3 DEMs與CAD患病風(fēng)險

圖2 驗證階段DEMs在CAD患者與HCs中的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of differentrally expressed microRNAs in CAD patients and HCs in validation stage

如表4所示，進(jìn)一步采用單元、多元邏輯回歸模型評估DEMs對于CAD患病風(fēng)險的預(yù)測價值，單元邏輯回歸結(jié)果顯示，高表達(dá)水平的miR-19a （P =0.012）、miR-126 （P ＜ 0.001） 、miR-130a （P ＜ 0.001） 、miR-210 （P ＜ 0.001） 和miR-378 （P = 0.008） 是CAD的保護(hù)因素。將所有P ＜ 0.1的元素納入多元邏輯回歸，結(jié)果表明，miR-19a （P = 0.009） 、miR-126 （P ＜0.001） 、miR-130a （P ＜ 0.001） 、miR-210 （P ＜ 0.001）和miR-378 （P = 0.014） 高表達(dá)是CAD患病的獨立保護(hù)因素。

2.4 DEMs對于CAD的診斷價值

ROC曲 線 分 析 表 明，miR-19a、miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378的表達(dá)水平可以區(qū)分CAD患者與健康人群，曲線下面積 （area under curve，AUC） 分別為0.574、0.654、0.656、0.611和0.576。而進(jìn)一步將5個DEMs結(jié)合分析顯示，結(jié)合miR-19a、miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378檢 測 對 于CAD具有較好的診斷價值，AUC為0.768，見圖3。

2.5 DEMs與Gensini評分的關(guān)聯(lián)

miR-126 （r = -0.299，P ＜ 0.001） 和miR-210 （r =-0.169，P = 0.045） 的表達(dá)水平與Gensini評分呈負(fù)相關(guān)，而miR-19a （r = -0.038，P ＜ 0.001） 、miR-92a （r =-0.068，P = 0.422） 、miR-130a（ r = -0.034，P = 0.692） 、miR-221 （ r = -0.058，P = 0.495） 、miR-296 （ r = -0.054，P= 0.520） 和miR-378 （ r = -0.064，P = 0.447） 的表達(dá)水平與Gensini評分無關(guān)。

表4 驗證階段8種DEMs對于CAD風(fēng)險預(yù)測單元多元邏輯回歸分析Tab.4 Univariate and multivariate logistic regression of 8 DEMs for evaluating the risk of CAD in the validation stage

圖3 DEMs預(yù)測CAD風(fēng)險的ROC曲線Fig.3 ROC curves of differentially expressed microRNAs for predicting the risk of CAD

3 討論

缺血性心臟病常表現(xiàn)為穩(wěn)定期的CAD，因此CAD患者是心臟病急性發(fā)作的高危人群。另外，CAD患者發(fā)生中風(fēng)的風(fēng)險同樣高于正常人［4-5］。盡管經(jīng)皮冠狀動脈干預(yù)治療 （percutaneous coronary intervention，PCI） 和冠狀動脈旁路移植 （coronary artery bypass grafting，CABG） 是臨床上治療CAD的有效的心臟動脈重建術(shù)，但一些研究［6-8］顯示，CABG和PCI對于改善患者生存期的作用有限，費用相對昂貴，限制了其在臨床中的使用。早期對CAD患者進(jìn)行臨床干預(yù)可以顯著延長患者的生存期，因此，早期診斷在CAD患者的管理中發(fā)揮著重要作用。近期的研究［9］表明，miRNA在心血管疾病中同樣發(fā)揮著重要作用，如miR-21可以通過激活纖維母細(xì)胞中MAP激酶的信號通路促進(jìn)心肌病的進(jìn)展。也有研究［10］表明，miR-148a通過直接調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體 （low density lipoprotein receptor，LDLR） 的表達(dá)，在肝臟LDL-C清除中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，而LDL-C/HDL-C比率是心血管疾病的重要風(fēng)險因素。

本研究中，在探索階段，CAD患者miR-19a、miR-92a、miR-126、miR-130a、miR-210、miR-221、miR-296和miR-378的表達(dá)水平顯著升高；而在驗證階段，只有miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378在CAD患者中的表達(dá)水平顯著高于HCs。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-19a、 miR-126、 miR-130a、 miR-210和miR-378的 表 達(dá)水平是CAD發(fā)病風(fēng)險的獨立預(yù)測因素；miR-19a、miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378結(jié) 合 分 析 對于CAD的患病風(fēng)險具有較高的預(yù)測價值；miR-126和miR-210的表達(dá)水平與CAD的疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

近年來，研究［11］發(fā)現(xiàn)一些miRNA在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促血管生成或抑制血管生成的作用，參與CVD的病理進(jìn)展。miR-126是與血管生成有關(guān)的miRNA之一，位于染色體9q34.3，并在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)［12］。有研究［13］表明，miR-126-5p過表達(dá)增加了具有促血管生成作用的內(nèi)皮細(xì)胞活動，下調(diào)miR-126-5p的表達(dá)水平能抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)miR-125-5p的表達(dá)水平有助于調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中粗血管生成骨形成蛋白4效應(yīng)。CHEN等［14］也發(fā)現(xiàn)，miR-126可以通過靶向調(diào)控PI3K/Akt信號抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。研究［15］表明，在血管受損和缺氧時，上調(diào)miR-126的表達(dá)水平可以激活內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并通過此機(jī)制促進(jìn)血管修復(fù)和新血管的生成，顯示了miR-126在心血管疾病中的血管保護(hù)和動脈粥樣硬化保護(hù)作用。

GAX和HOXA5是具有抑制血管生成作用的同源盒基因，而另一個與血管生成相關(guān)的miRNA——miR-130a具有抑制二者的表達(dá)從而達(dá)到調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞表型的作用［16］。一項關(guān)于胎肺氣道與血管發(fā)展的動物實驗［17］顯示，進(jìn)行miR-130a治療可以促進(jìn)血管管道的形成以及細(xì)胞的遷徙。miR-210是一個具有促血管生成功能的miRNA，可以通過靶向調(diào)控纖維母細(xì)胞生長因子受體1促進(jìn)患者腫瘤血管生成［18］。miR-210還可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，從而改善心肌梗死小鼠的心臟功能［19］。

miR-378同樣在血管生成中具有重要作用，SKRZYPEK等［20］報道，miR-378過表達(dá)可以降低血紅素氧合酶1和p53的表達(dá)水平，上調(diào)黏蛋白5AC、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、白細(xì)胞介素8和血管緊張素1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷徙，刺激內(nèi)皮細(xì)胞。在其他心血管疾病中，miR-378同樣被發(fā)現(xiàn)具有重要作用，有研究［21］報道，電刺激心臟干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)miR-378的表達(dá)水平，并改善心臟缺血。

miR-19a位于染色體13q31.3，隸屬于miR-17-92基因簇，其過表達(dá)可通過調(diào)控凋亡信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/p38，從而減少脂多糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［22］。另外，miR-19a在cyclinD1的表達(dá)調(diào)控中起重要作用，并通過調(diào)控cyclinD1影響內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)［23］。在某些心血管疾病中，miR-19a可以保護(hù)心肌受損，如對PCI引起的心肌梗死，它還可以抑制Bcl-2調(diào)節(jié)因子，從而減少低氧引起的細(xì)胞死亡，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用［24］。

本研究驗證階段結(jié)果顯示，miR-19a、miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378在CAD患者中的表達(dá)水平顯著高于HCs，并且miR-126和miR-210的表達(dá)水平與CAD的疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能與這些差異表達(dá)的促血管生成miRNA對血管生成的正向調(diào)控作用及對心肌的保護(hù)作用有關(guān)［12-27］。

以往關(guān)于miRNA對于CVD以及CAD的診斷作用的研究［25-27］揭示了miRNA作為診斷標(biāo)志物的可能性，miR-126、miR-143、miR-145、miR-223等均被發(fā)現(xiàn)在CVD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，并可以作為CVD診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合分析miR-126、 miR-130a、 miR-210和miR-378對于 CAD的發(fā)病風(fēng)險具有較好的診斷作用，這可能與miR-126、miR-130a、miR-210和miR-378對血管生成及心肌缺血的調(diào)控作用有關(guān)，該結(jié)果或許可以為改善CAD患者的臨床診斷和預(yù)后提供新的選擇［12-27］。

本研究尚有不足之處： （1） 本研究中的CAD患者及HCs的年齡均較大，為老年患者及年齡相近的健康對照，因此未能測定及評估中年CAD患者及健康人的血管生成miRNA的表達(dá)水平及其與發(fā)病風(fēng)險及疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性； （2） 本研究未測定CAD患者組織中的備選miRNA表達(dá)水平，并與循環(huán)血中的表達(dá)水平進(jìn)行對比，然而獲取CAD患者的組織標(biāo)本較為困難； （3） 本研究的樣本量相對較小。

綜上所述，miR-19a、 miR-126、 miR-130a、 miR-210和miR-378可以作為預(yù)測CAD發(fā)病風(fēng)險和疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。

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