郭曉彤 魏優(yōu)蕾 雷加吉 李廣華 徐廣全

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院胸外科，黑龍江 哈爾濱 150001)

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，約占全部肺癌的80%〔1〕。在過去的幾十年里，手術、放化療、新輔助治療等是肺癌的主要治療手段，雖然挽救了部分患者的生命，但療效仍非常有限，其中Ⅲa、Ⅲb及Ⅳ期的NSCLC患者5年生存率僅為19%、7%和2%〔2〕。由此可見，篩選開發(fā)新一代高效低毒性的抗肺癌藥物意義重大。藤黃酸是中藥藤黃的主要成分，既往研究已經證實〔3，4〕其能有效抑制多種(如肝癌、乳腺癌、結直腸癌及前列腺腫瘤等)癌細胞增殖。然而，藤黃酸對NSCLC A549細胞凋亡的影響及機制尚未完全闡明。本研究觀察不同濃度的藤黃酸對NSCLC A549細胞凋亡及B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、P53表達的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料 A549細胞購自上海信裕生物科技有限公司，藤黃酸(分子式C38H44O8，分子量628.76 D，純度≥98%)購于成都瑞芬思生物科技有限公司，胎牛血清、F12-K細胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等均購自美國Gibco公司，Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體、P53多克隆抗體及PUMA多克隆抗體購于Cell Signaling Technology公司，Annexin V-FITC/PI雙染色凋亡細胞檢測試劑盒購于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司(BD)，細胞裂解液自行配制，酶標儀為芬蘭Labsystems公司，流式細胞儀購于美國Becton Dickinson公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.2方法

1.2.1A549細胞培養(yǎng)、凍存、復蘇 A549細胞采用F12-K完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度達90%左右且生長狀態(tài)良好時加入0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，密切觀察，待細胞變圓后加入完全培養(yǎng)基使消化反應停止，常規(guī)方法收集細胞懸液，以800 r/min室溫離心5 min后采用完全培養(yǎng)基重懸細胞，傳代于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞密度達90%左右且生長狀態(tài)良好時消化(具體方法同上)收集細胞，離心去上清后采用細胞凍存液重懸細胞，重懸的細胞轉移至凍存管，在4℃冰箱放置0.5 h后轉移至-80℃冰箱保存。實驗時取出凍存的細胞，在37℃水浴中復蘇，離心去上清后采用完全培養(yǎng)基重懸細胞，重懸的細胞裝于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2A549細胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞，采用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，離心后收集細胞并采用完全培養(yǎng)基重懸，然后將重懸的細胞置于鏡下計數(shù)，將細胞濃度調整為1.0×105個/ml，以3 ml/孔的量接種于6孔板，然后將其置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合率達到60%左右時去培養(yǎng)液并采用PBS常規(guī)清洗3次，根據(jù)實驗需求分為空白對照組、藤黃酸2.5、5.0和10.0 μmol/L組，空白對照組加入完全培養(yǎng)基3 ml，藤黃酸2.5、5.0和10.0 μmol/L組加入3 ml含藤黃酸2.5、5.0和10.0 μmol/L的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入0.25%胰酶消化收集細胞，采用PBS按1∶1重懸細胞，取重懸后的單細胞懸液100 μl分裝于兩支試管，其中一支加入5 μl的Annexin V-FITC，另一只加入10 μl的PI，混勻后將兩支試管中的懸液合裝，輕震蕩混勻后避光孵育15 min，在流式細胞儀檢測525 nm波長處V-FITC熒光強度，在流式細胞儀610 nm波長處檢測PI熒光強度，采集數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件進行處理。

1.2.3MTT檢測A549細胞生長情況 細胞制備、收集、鋪板等同凋亡實驗，接種于96孔板中加入100 μl含5×103個細胞懸浮液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同凋亡實驗，將50 mmol/L的藤黃酸母液用完全培養(yǎng)基稀釋成0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L的培養(yǎng)液，根據(jù)不同的培養(yǎng)液濃度分為0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L五組，各孔加入100 μl含藥培養(yǎng)基，每樣濃度設置6個復孔，分別于干預24、48、72 h后加入MTT儲存液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h,1 200 r/min離心5 min，去除上清液后每孔加入150 μl的DMSO并低速震蕩10 min使結晶充分溶解，將96孔板置于酶標儀，以490 nm波長檢測各孔吸光值，計算細胞存活率。

1.2.4Western印跡實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化，離心、收集細胞、細胞重懸及細胞計數(shù)方法同凋亡實驗，將細胞濃度調整為1.5×105個/ml，接種于60 mm的培養(yǎng)皿，每培養(yǎng)皿中3 ml相當于4.5×105個細胞，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁過夜，融合率達60%左右時去原培養(yǎng)液，PBS清洗3次，分別加入3 ml完全培養(yǎng)基(空白對照組)和3 ml含藤黃酸2.5、5.0、10.0 μmol/L的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗3次，每培養(yǎng)皿中加入200 μl裂解液，刮取細胞集中于裂解液，轉移至1.5 ml離心管，充分裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清保存至600 μl離心試管，測定P53蛋白水平及其下游基因Bcl-2、Bax和PUMA的表達水平〔5〕。P53蛋白以750 nm為檢測波長，酶標儀讀取各孔吸光值，繪制標準曲線，計算樣品濃度，Bcl-2、Bax和PUMA基因表達在電泳分離目標蛋白后常規(guī)處理，化學發(fā)光后采用Quantity One圖像分析軟件進行分析處理，計算其相對表達量〔6〕。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件行t檢驗或方差分析。

2 結 果

2.1藤黃酸對A549細胞凋亡率的影響 干預24 h后，空白對照組A549細胞凋亡率為(7.82±1.34)%，藤黃酸2.5 μmol/L組為(22.46±3.47)%，藤黃酸5.0 μmol/L組為(41.37±6.28)%，藤黃酸10 μmol/L組為(66.67±5.48)%，4組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著藤黃酸濃度的上升，A549細胞凋亡率呈上升趨勢，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2藤黃酸對A549細胞生長情況的影響 采用藤黃酸干預的各組A549細胞的生長均受到一定程度的抑制，且存在劑量、時間關系，不同濃度的藤黃酸干預組A549細胞存活率均低于空白對照組，隨著時間的推移，各干預組A549細胞存活率降低(P<0.05)。見表1。

2.3藤黃酸對A549細胞P53、Bcl-2、Bax、PUMA表達水平的影響 干預24 h后，P53、Bax、PUMA的相對表達量隨著藤黃酸濃度的增加而增加，且2.5、5.0、10.0 μmol/L組均高于空白對照組(P<0.05)；但Bcl-2的相對表達量隨著藤黃酸濃度的增加而降低，且2.5、5.0、10.0 μmol/L組低于空白對照組(P<0.05)。見表2。

表1 不同濃度藤黃酸對A549細胞生長的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05

表2 不同濃度藤黃酸對A549細胞P53、Bcl-2、Bax、PUMA表達水平的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05；與2.5 μmol/L組比較：2)P<0.05；與5.0 μmol/L組比較：3)P<0.05

3 討 論

最新流行病學調查顯示〔7〕，I期患者約占NSCLC總數(shù)的24%，Ⅱ期約占NSCLC總數(shù)的11%，而Ⅲ期患者約占NSCLC總數(shù)的24%，Ⅳ期的患者約占NSCLC總數(shù)的41%。以上數(shù)據(jù)表明，NSCLC以Ⅲ期和Ⅳ期(即中晚期)為主，而Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC患者的5年生存率較低〔1,2〕，由此可見NSCLC的臨床治療仍面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。以鉑類為基礎的一線化療方案的臨床療效已進入平臺期，因而迫切需要開發(fā)針對NSCLC的新治療模式及新型藥物。與化學合成藥物相比，從天然藥用植物分離獲得抗腫瘤藥物具有研發(fā)周期短、研發(fā)費用較低、毒副作用較小、作用機制廣泛等優(yōu)勢。中醫(yī)認為肺癌最初起于痰濁之邪，痰濁壅肺，肺失宣發(fā)肅降，給予清熱解毒、活血化瘀類中藥可獲益〔8,9〕。藤黃酸是中藥藤黃的主要活性成分，藤黃是植物藤黃分泌的干燥樹脂，性寒味酸、辛、澀，可有效抑制多種腫瘤細胞增殖〔10,11〕。另有研究表明〔12,13〕，有效濃度的藤黃酸不會明顯抑制正常造血，是一種具有良好前景的抗腫瘤活性藥物成分，但其對NSCLC A549細胞凋亡的影響及機制都尚未闡明，還需進一步研究。

本研究顯示，藤黃酸可促進A549細胞凋亡，抑制NSCLC A549細胞增殖，且存在劑量、時間關系。藤黃酸可活化P53蛋白及其下游靶基因Bax、PUMA表達。Bax和PUMA基因均為粗凋亡基因，同時抑制抗凋亡基因Bcl-2基因活化，從而起到促A549細胞凋亡，抗A549細胞增殖的作用。既往研究顯示〔14,15〕，中藥活性成分抗腫瘤主要通過上調細胞內反應性氧自由基(ROS)含量引起DNA損傷、線粒體通透性改變及粗凋亡內容物釋放而實現(xiàn)。而ROS是穩(wěn)定P53轉錄活性或表達上調的重要因素，可延長P53蛋白的半衰期、上調P53表達。P53作為轉錄因子可調控其下游靶基因的表達，Bax、PUMA等促凋亡基因可在P53誘導下表達上調，而抗凋亡基因Bcl-2表達下調，藤黃酸對A549的凋亡作用與其可誘導P53表達有關〔16〕。

綜上所述，藤黃酸可能通過增加反應性ROS含量使P53表達水平上調，而P53表達上調可誘導其下游促凋亡基因Bax和PUMA表達上調，抗凋亡基因Bcl-2表達下調，從而促進A549細胞凋亡和抑制A549細胞增殖，其促進A549細胞凋亡存在劑量與療效的關系，抑制A549細胞凋亡存在劑量、時間與療效的關系。

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