響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取桂皮總黃酮的工藝研究

趙世霞

(淄博職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255314)

桂皮，別名官桂或香桂，為天竺桂、肉桂或川桂等樟科植物樹皮的通稱[1,2]，在我國(guó)主要產(chǎn)于云南、廣西等地。桂皮是典型的食藥同源品種[3]，作為傳統(tǒng)的中藥材，其具有暖胃祛寒、通脈止痛、散瘀消腫、止瀉、活血舒筋等功效；作為古老的香辛調(diào)味品，其廣泛用于肉類菜肴的祛腥解膩及五香粉的加工[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明桂皮含有揮發(fā)油、多糖類、皂苷類、萜類、酚類、黃酮類等多種化學(xué)活性物質(zhì)，在消化、心血管、免疫及內(nèi)分泌相關(guān)疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用[5]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康的重視，作為桂皮主要成分之一的黃酮類化合物由于具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫力等作用而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者及大型公司的廣泛 關(guān)注，其在藥品、保健食品、食品添加劑、功能性飲料、消毒劑等領(lǐng)域極具開發(fā)價(jià)值[6,7]。

目前，黃酮類化合物的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、微波或超聲輔助提取法、有機(jī)溶劑提取法等[8]。超聲輔助提取具有效率高、質(zhì)量穩(wěn)定、安全性高、耗能低等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的提取[9,10]。本研究選用乙醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法對(duì)桂皮總黃酮化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為桂皮的二次開發(fā)提供一定的思路與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂皮：市售，經(jīng)洗凈、烘干、粉碎后過60目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：酷爾化學(xué)科技有限公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZY-C500型電子天平 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；UV-5100B型紫外分光光度計(jì) 無(wú)錫久平儀器有限公司；FW135型中草藥粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 江蘇同君儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用比色法測(cè)定510 nm處吸光度[11]。以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，A=9.3971C-0.0039，R2=0.9988。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品總黃酮含量，桂皮中總黃酮提取率按下式計(jì)算：

總黃酮提取率=(提取總黃酮的質(zhì)量/桂皮粉末質(zhì)量)×100%。

1.3.2 桂皮總黃酮的提取

精確稱取桂皮干燥粉末10.00 g，按一定液料比(mL/g)15∶1加入60%的乙醇溶劑，在600 W額定超聲功率下提取 60 min，提取液冷卻后過濾，濾液減壓濃縮至30～40 mL，過0.45 μm濾膜，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，60%乙醇定容，搖勻后取1 mL提取液測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)按1.3.2步驟進(jìn)行桂皮總黃酮的提取，分別以不同的液料比(mL/g)10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，不同乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，90%，不同超聲功率300，400，500，600，700，800 W，不同提取時(shí)間20,40,60,80,100 min為單因素，考察單因素對(duì)桂皮總黃酮提取的影響，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)桂皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

圖1 單因素條件對(duì)桂皮總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on the extraction rate of flavonoids from cinnamon

由圖1中A可知，桂皮總黃酮提取率隨著液料比的增加呈典型的倒“V”型變化趨勢(shì)，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，提取桂皮總黃酮的效果最佳。這是因?yàn)橐毫媳鹊蜁r(shí)，桂皮粉末得不到充分浸潤(rùn)；增加液料比，黃酮類化合物的擴(kuò)散和溶出速率的提高有利于桂皮總黃酮的提?。灰毫媳冗^高時(shí)，非黃酮類可溶雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇液料比20∶1較為合適。由圖1中B可知，桂皮總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而快速增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，桂皮總黃酮提取率最大，達(dá)到4.52%，隨后桂皮總黃酮提取率開始下降。這是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，提取液極性開始下降，黃酮類化合物由于相似相溶而不斷溶出；當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，粘度變大，極性過低，不利于黃酮類化合物溶出，同時(shí)溶出的醇溶性雜質(zhì)增多，導(dǎo)致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇乙醇濃度70%較為適宜。由圖1中C可知，隨著超聲功率的增加，桂皮總黃酮提取率先快速增加而后緩慢下降。隨著超聲功率增加，分子擴(kuò)散加快，桂皮總黃酮提取率增加，但當(dāng)超聲功率過大時(shí)，局部升溫過快，造成苷鍵水解和色素的溶出，導(dǎo)致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇超聲功率500 W為宜。由圖1中D可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，桂皮總黃酮提取率呈先增后減的趨勢(shì)；提取60 min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，為5.01%。延長(zhǎng)提取時(shí)間可以提高總黃酮提取率，但是時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致桂皮總黃酮發(fā)生降解，提取率隨之下降。因此，選擇提取時(shí)間60 min較佳。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)2.1中試驗(yàn)結(jié)果，以液料比20∶1、乙醇濃度70%、超聲功率500 W、提取時(shí)間60 min為中心點(diǎn)，桂皮總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.0軟件，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

表1 桂皮總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Response surface methodology design scheme and results for extraction of total flavonoids from cinnamon

續(xù) 表

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得桂皮總黃酮提取率(Y)與液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素之間的二次回歸方程：

Y=-84.67458+2.00067A+0.98025B+0.075442C+0.54600D+5.00000E-005AB-4.85000E-004AC-6.00000E-004AD-2.57500E-004BC+1.82500E-003BD-2.35000E-004CD-0.041267A2-6.90417E-003B2-3.54167E-005C2-4.40417E-003D2。

方程的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表明方程代表的拋物面開口向下，具有極值點(diǎn)，可以進(jìn)行優(yōu)化分析。以桂皮總黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)桂皮總黃酮提取工藝模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表2。

表2 桂皮總黃酮提取二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 2 Variance analysis of quadratic polynomial model of total flavonoids extracted from cinnamon

由表2可知，回歸模型顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.085)，說(shuō)明該模型擬合充分，能夠用來(lái)描述桂皮總黃酮提取率與提取條件的關(guān)系。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，表明該模型可以解釋響應(yīng)面中99.13%的可變性，可以用于桂皮在總黃酮提取最佳條件的確定。方程一次項(xiàng)中A，C，D，二次項(xiàng)中A2，B2，C2，D2，交互項(xiàng)中AC，BC，BD，CD對(duì)桂皮在總黃酮提取率影響最為顯著(P<0.0001)，其他項(xiàng)不顯著(P>0.05)，表明各因素之間影響是非線性關(guān)系。模型中根據(jù)F值大小可知，影響桂皮在總黃酮提取效果的因素按主次順序排列為：液料比(A)>超聲功率(C)>提取時(shí)間(D)>乙醇濃度(B)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖2 各因素交互效應(yīng)對(duì)桂皮總黃酮提取率影響的響應(yīng)圖Fig.2 Interactive effects of each factor on the extraction of flavonoids from cinnamon

響應(yīng)曲面圖可以直觀地反映各因素相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。其中曲線越陡峭，表明操作條件對(duì)響應(yīng)值影響越顯著。

由圖2可知，乙醇濃度與超聲功率曲面最為陡峭，料液比與超聲功率、超聲功率與提取時(shí)間、乙醇濃度與提取時(shí)間均較為陡峭，可見這些因素的交互作用對(duì)桂皮總黃酮的提取率影響比較顯著，這與上述方差分析和顯著性檢驗(yàn)正好相符。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定桂皮總黃酮最佳提取條件為：液料比21.17∶1，乙醇濃度70.99%，超聲功率452.39 W，超聲處理時(shí)間63.19 min，在此條件下桂皮黃酮提取率的最大預(yù)測(cè)值為5.60%。考慮實(shí)際過程中的局限性，將工藝條件優(yōu)化為液料比21∶1，乙醇濃度71%，超聲功率452 W，提取時(shí)間63 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證，得到桂皮總黃酮平均提取率為5.61%，與模型預(yù)測(cè)值接近，表明構(gòu)建的模型對(duì)桂皮總黃酮提取工藝的模擬是可靠的。

3 結(jié)論

超聲提取法就是利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，加速活性成分進(jìn)入溶劑，同時(shí)粉碎植物細(xì)胞，使活性成分快速釋放至胞外，提取效率高[12]。黃酮類化合物在植物中廣泛分布，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一類天然產(chǎn)物，常以游離態(tài)或與糖苷形式存在[13]，具有廣泛的藥理活性，食用和藥用價(jià)值均比較高。桂皮作為古老而悠久的香辛料，含有豐富的黃酮類化合物。本文以桂皮總黃酮為研究對(duì)象，選用超聲輔助提取法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件為：液料比21∶1，乙醇濃度71%，超聲功率452 W，提取時(shí)間63 min，在此條件下桂皮總黃酮提取率為5.61%，與理論預(yù)測(cè)值(5.60%)基本一致。本研究為桂皮總黃酮的工業(yè)提取利用以及香辛料的科學(xué)開發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

[1]賈琦,王瑞,吳喜民,等.不同種類桂皮化學(xué)成分的比較[J].上海中醫(yī)藥雜志,2011(5):82-86.

[2]馬世宏.桂皮黃酮的提取工藝及抗氧化性研究[J].食品工業(yè)科技,2010(12):224-226.

[3]張慧蕓,孔保華,李鑫玲.桂皮提取物成分分析及抗菌活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31(3):147-150.

[4]Hinneburg I,Hjd D,Hiltunen R.Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices[J].Food Chemistry,2006,97(1):122-129.

[5]陳家源,牙啟康,盧文杰,等.中藥肉桂的研究概況[J].廣西醫(yī)學(xué),2009,31(6):872-874.

[6]陶亮亮,林華衛(wèi),李明旭,等.超聲輔助提取桂皮中總黃酮的工藝研究[J].飲料工業(yè),2012,15(5):24-27.

[7]李紅玉,郝教敏,楊文平,等.桂皮總酚提取工藝的研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2016,41(4):88-91.

[8]仝其根,魏風(fēng)蓮.超聲波提取桂皮有效成分及其油樹脂穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技,2006(11):95-97.

[9]庫(kù)詠峰.肉桂總黃酮提取分離分析及抗氧化活性研究[D].南寧：廣西大學(xué),2012.

[10]劉霞,李偉,李傳靈,等.超聲輔助酶法提取大葉梔子花總黃酮的工藝研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,55(23):6219-6223.

[11]白生文,湯超,田京,等.沙棘果渣總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析[J].食品科學(xué),2015,36(10):59-64.

[12]李俠,鄒基豪,王大為.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波-酶法提取綠豆皮黃酮類化合物工藝[J].食品科學(xué),2017,38(8):206-212.

[13]張怡,曾紹校,鄭寶東.柚子皮總黃酮提取工藝的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(14):100-103.