姬賽賽，王嫻靜，馬晶晶，蔣小燕，袁換云，禹金龍，江 蕓*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

食源性致病菌所致的食源性疾病是我國重要的食品安全問題。大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是引起人類致病的腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. coli，EHEC）最常見的血清型，可引起腹瀉、出血性腸炎和溶血性尿毒綜合癥，后者病死率很高。該菌因感染劑量低、致病力強、危險性大，已經(jīng)成為全球公認的食源性致病菌之一[1-2]。E. coli O157:H7可通過食物、水及接觸進行傳播，其中食源性傳播最為普遍，可通過牛肉、羊肉等動物性食物為主要載體進行傳播[3]。自1982年首次由美國報道了E. coli O157:H7引起的出血性腸炎暴發(fā)，隨后諸多國家包括我國江蘇、安徽等多個地區(qū)均有E. coli O157:H7感染的暴發(fā)流行。

凍藏是食品工業(yè)中常見的貯藏措施，可有效抑制微生物增殖，延長食品貨架期。然而，研究表明凍藏可導(dǎo)致E. coli O157:H7等食源性致病菌產(chǎn)生亞致死損傷[4-6]，損傷菌對選擇性培養(yǎng)基中的一些物質(zhì)敏感而不能生長[7-8]，所以在常規(guī)安全檢測中會被低估或出現(xiàn)假陰性。然而，已有研究表明，損傷菌在一定條件下可以修復(fù)為正常狀態(tài)，恢復(fù)其致病性等生理特性[9-10]，從而帶來食品安全隱患。

損傷菌修復(fù)方面在國內(nèi)外有大量報道，其中較多是關(guān)于修復(fù)方法的研究，一般采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，或食品（如牛奶、肉）為基質(zhì)以促進損傷菌的修復(fù)[9,11-15]，增加檢出率，防止漏檢。但這些研究條件下并未區(qū)分正常菌的增殖和損傷菌的修復(fù)，所以若要單獨探討損傷菌的變化情況，則不宜采用營養(yǎng)豐富的基質(zhì)。Koseki等[16]研究發(fā)現(xiàn)超高壓損傷后的E. coli可在無營養(yǎng)的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中修復(fù)，本課題組前期研究得到了同樣結(jié)論[17]，張勇等[18]亦發(fā)現(xiàn)冷凍24 h的E. coli ATCC25922在PBS中存在一定程度的修復(fù)，因此采用PBS作為修復(fù)基質(zhì)時，因為不存在正常菌的生長和增殖，從而可以針對性地揭示損傷菌的存活情況。

冷凍食品，如不同種類的肉和肉制品，超市、農(nóng)貿(mào)市場或家庭在不同季節(jié)因環(huán)境溫度不同會自然解凍不同時間。采用不同溫度進行解凍不僅對食品品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，對殘存微生物的存活也會產(chǎn)生影響，進而對食品安全和貨架期產(chǎn)生影響。因此，本實驗首先研究E. coli O157:H7不同菌株冷凍后的死亡和損傷情況，進而采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)研究冷凍后不同自然解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響。本實驗摒除了正常菌的增殖，可更加真實地反映殘存菌本身的存活情況，為凍藏食品中食源性致病菌的科學(xué)合理的風(fēng)險評估和有效控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

E. coli O157:H7 CICC21530為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心惠贈；E. coli O157:H7 NCTC12900購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2 株分離自牛肉的E. coli O157:H7由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點實驗室惠贈。4 株菌攜帶毒力基因情況不盡相同[8]。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、山梨醇麥康凱瓊脂（sorbital macconkey ager base，SMAC）、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB） 北京陸橋技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司；WGZ-2XJ細菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門市其林貝爾儀器有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療器械廠；2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司；BCD-248T冰箱 河南新飛電器有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將保藏的4 株E. coli O157:H7經(jīng)TSA劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。

1.3.2 冷凍及解凍實驗

1.3.2.1 E. coli O157:H7不同菌株冷凍后存活情況

4 株E. coli O157:H7 TSB活化菌液，用濁度計調(diào)菌液濃度為108CFU/mL（1.005～1.010麥氏濁度單位），然后

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS V17.0進行數(shù)據(jù)分析處理，采用ANOVA進行單因素方差分析中的Duncan’s多重比較檢驗（P＜0.05），數(shù)據(jù)均以 ±s表示。用無菌生理鹽水梯度稀釋菌液至濃度106CFU/mL，并分裝于滅菌的1.5 mL離心管中，分別置于-20 ℃冷凍處理24、48、72 h，采用TSA和SMAC進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，比較不同菌株死亡/凍傷情況，并計算損傷率。

1.3.2.2 冷凍后不同解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響

4 株E. coli O157:H7 TSB活化菌液，4 ℃、6 000×g離心5 min，棄上清液，用滅菌PBS（pH 7.2）離心洗滌3 次，用濁度計調(diào)至濃度為108CFU/mL，無菌生理鹽水梯度稀釋菌液至濃度106CFU/mL，4 株菌的PBS菌液等量混合均勻，分裝于滅菌的1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冷凍處理一定時間，冷凍時間根據(jù)1.3.2.1節(jié)結(jié)果確定。進一步進行解凍實驗，1）冷凍后不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響：4 株菌的PBS混合菌液冷凍一定時間后，立即取出分別置于20、30、37 ℃解凍12、24、36、48 h，采用TSA進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，觀察不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響；2）冷凍后不同緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響：4 株菌的PBS混合菌液冷凍一定時間后，將冷凍后菌體先置于4 ℃不同時間（0、2、6、12 h）再置于37 ℃不同時間（5、10、30 min），采用TSA和SMAC進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，觀察菌株存活情況。上述冷凍及解凍實驗，各處理組均做3個重復(fù)。

1.3.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法

待測菌液經(jīng)系列10 倍梯度稀釋，選擇3 個合適稀釋梯度，吸取100 μL至TSA或SMAC上，采用平板涂布法，37 ℃培養(yǎng)24 h，對E. coli O157:H7進行菌落計數(shù)。

根據(jù)兩種平板上菌落數(shù)計算損傷率，非選擇培養(yǎng)基TSA上的菌落數(shù)為未損傷、損傷和已繁殖的菌數(shù)，選擇性培養(yǎng)基SMAC上的菌落數(shù)為未損傷、已修復(fù)、已繁殖的菌落數(shù)，計算公式如下[19]：

2 結(jié)果與分析

2.1 E. coli O157:H7不同菌株冷凍后菌落數(shù)變化

4 株E. coli O157:H7分別置于-20 ℃冷凍處理24、48、72 h，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，比較不同菌株死亡/凍傷情況。由圖1可知，與冷凍前相比，4 株菌冷凍后兩種培養(yǎng)基TSA和SMAC上的菌落數(shù)均顯著下降（P＜0.05），冷凍時間越長，菌落數(shù)下降越多，表明冷凍導(dǎo)致細菌發(fā)生了死亡和損傷，且冷凍時間越長細菌致死和致傷效果越明顯。進一步比較發(fā)現(xiàn)，冷凍相同時間時，不同菌株菌落數(shù)的下降并不相同，表明冷凍造成細菌死亡和損傷程度存在菌株差異。

圖1 E. coli O157:H7冷凍不同時間后的菌落數(shù)Fig. 1 E. coli O157:H7 counts after freezing for different times

正常菌和損傷菌均能在非選擇性平板TSA上生長，而選擇性平板SMAC上只有正常未損傷菌可以生長，因此非選擇性平板上菌落數(shù)與選擇性平板上菌落數(shù)的差值可以反映損傷菌的數(shù)量。由圖1可知，4 株菌兩種平板上的菌落數(shù)差值（損傷菌數(shù)量）在不同冷凍時間不盡相同，在冷凍72 h時菌株CICC21530、NCTC12900、兩株牛肉分離菌在兩種平板上的菌落數(shù)差值分別為0.91、0.77、0.23、0.52（lg（CFU/mL））。進一步計算4 株E. coli O157:H7冷凍不同時間于活菌中的損傷率，如表1所示，隨著冷凍時間的延長，損傷率逐漸增大，進一步比較不同菌株的損傷率發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中4 株菌損傷率不盡相同，冷凍72 h時菌株CICC21530的損傷率最高，達到87.70%。冷凍對微生物的影響與細胞內(nèi)冰晶形成所致的結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，還與溶質(zhì)損傷、脫水、氧化脅迫等有關(guān)[20-21]，導(dǎo)致細菌發(fā)生可逆性損傷甚至死亡。值得注意的是，由于選擇性培養(yǎng)基SMAC中存在一些抑菌物質(zhì)，所以冷凍前SMAC上的菌落數(shù)稍低于TSA（P＞0.05），即存在一定的損傷率（表1中0 h）。

表1 4 株E. coli O157:H7冷凍不同時間后的損傷率Table 1 Injury rates of four E. coli O157: H7 strains after freezing for different times%

Ro等[22]研究發(fā)現(xiàn)接種于肉制品的EHEC冷凍180 d后菌數(shù)未發(fā)生顯著變化；Metzger等[23]報道接種于奶酪的單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌于-20 ℃冷凍30 d后菌數(shù)未發(fā)生顯著下降，而E. coli O157:H7和傷寒沙門菌則顯著下降；Manios等[6]報道接種于絞碎牛肉中的沙門菌和E. coli O157:H7 -22 ℃冷凍5 d時均發(fā)生了顯著下降，并產(chǎn)生了一定量的損傷菌體，繼續(xù)冷凍至75 d時兩種致病菌數(shù)量未進一步下降。上述研究報道以及本實驗的發(fā)現(xiàn)并不完全一致，主要原因是微生物死亡和損傷程度與冷凍條件、菌液基質(zhì)、菌種、菌株等有關(guān)[4-5]。

2.2 冷凍后不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響

由2.1節(jié)結(jié)果可知，E. coli O157:H7冷凍72 h時產(chǎn)生了較大的損傷和死亡，且存在菌株差異，因此進一步采用混合菌株進行解凍實驗，同時為了避免正常菌增殖的干擾，采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)。4 株菌的PBS混合菌液冷凍前TSA上的初始菌落數(shù)為6.48（lg（CFU/mL）），冷凍72 h后菌落數(shù)顯著下降（P＜0.05）。冷凍后的PBS混合菌液分別置于20、30、37 ℃解凍不同時間，由圖2可知，3 種溫度條件下菌落數(shù)均繼續(xù)下降，且解凍溫度越高下降越明顯，至24 h時3 個解凍溫度組TSA菌落數(shù)均顯著低于冷凍72 h（冷凍后）時菌落數(shù)（P＜0.05），且20 ℃、24 h顯著高于30 ℃、24 h和37 ℃、24 h菌落數(shù)（P＜0.05）。解凍36 h和48 h時，20 ℃和30 ℃菌落數(shù)未再出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），而37 ℃、36 h菌落數(shù)顯著增加（P＜0.05），之后無顯著性變化；至實驗?zāi)┢?8 h時3 個解凍溫度組菌落數(shù)均顯著低于冷凍72 h時菌落數(shù)（P＜0.05）。

圖2 不同解凍溫度條件下E. coli O157:H7存活情況Fig. 2 Survival rates of E. coli O157:H7 thawed at different temperatures

本實驗結(jié)果表明，E. coli O157:H7 PBS菌液冷凍后立即置于20、30、37 ℃解凍，細菌發(fā)生了進一步的死亡，解凍溫度越高死亡越明顯。這可能是從-20 ℃立即轉(zhuǎn)入較高溫度時，菌體無法適應(yīng)環(huán)境的突然變化而加重了應(yīng)激損傷程度。但是，張勇等[18]對冷凍24 h的E. coli ATCC25922進行4 h內(nèi)最佳修復(fù)方法研究時發(fā)現(xiàn)冷凍后PBS菌液于25 ℃和37 ℃時，發(fā)生了修復(fù)甚至菌數(shù)增加，并未發(fā)生進一步的死亡。本實驗與其研究結(jié)果不一致，可能與冷凍時間、修復(fù)時間、不同菌株等有關(guān)。冷凍解凍過程中，細胞內(nèi)相關(guān)基因相關(guān)蛋白發(fā)生變化，主要的應(yīng)激蛋白包括熱應(yīng)激蛋白和冷應(yīng)激蛋白[24]。黃忠明等[25]將TSB+0.6% YE培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌-18 ℃凍藏90 d后于37 ℃修復(fù)，發(fā)現(xiàn)細胞膜相關(guān)基因msrR和抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因fhuC表達量顯著下調(diào)，而產(chǎn)能代謝相關(guān)基因cytB表達量顯著上調(diào)，認為冷凍損傷的金黃色葡萄球菌的修復(fù)可能與細胞表面的修復(fù)、細胞中活性氧含量降低以及產(chǎn)能代謝活動逐漸增強有關(guān)。關(guān)于無營養(yǎng)PBS基質(zhì)中細菌的冷凍解凍存活的分子機制值得進一步研究。

采用非選擇性培養(yǎng)基如TSA、TSAYE等進行培養(yǎng)計數(shù)，相當于是一種固體修復(fù)方法。早期即有研究表明，最佳修復(fù)培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件與應(yīng)激種類、損傷程度和機制、菌種和菌株等有關(guān)[26]。例如，單核細胞性李斯特菌損傷后，采用非選擇性平板TSAYE計數(shù)時30 ℃培養(yǎng)溫度比37 ℃更有利于其鹽、酸損傷的修復(fù)；在TSAYE上添加過氧化氫酶、D-葡萄糖有利于其鹽和酸損傷的修復(fù)，添加硫酸鎂有利于其熱損傷的修復(fù)，而對鹽、酸應(yīng)激損傷無影響[27-28]。Gurtler等[29]研究發(fā)現(xiàn)TSA平板中添加FeSO4、硫代二丙酸、丙酮酸鈉可增加熱損傷沙門菌的修復(fù)。Manios等[6]研究凍傷對沙門菌影響時采用TSA添加1%丙酮酸鹽作為非選擇性計數(shù)培養(yǎng)基以增加損傷菌的修復(fù)。PBS作為一種無營養(yǎng)基質(zhì)，損傷菌可以修復(fù)而正常菌不出現(xiàn)增殖[16]，本實驗中37 ℃解凍36 h時菌落數(shù)出現(xiàn)增加，可能是解凍初期冷凍損傷嚴重的菌體采用TSA、37 ℃培養(yǎng)計數(shù)時并未得到完全修復(fù)生長，至解凍36 h時有更多的修復(fù)菌體能夠在TSA、37 ℃條件下生長，從而使菌落數(shù)出現(xiàn)增加，其具體機制尚需進一步研究。本實驗結(jié)果表明，冷凍后立即于較高溫度下解凍不利于細菌的存活。為了探討在緩慢解凍時細菌的存活情況，進一步進行冷凍后緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活影響的實驗。

2.3 冷凍后不同緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響

4 株菌的PBS混合菌液冷凍72 h后先置于4 ℃一定時間（0、2、6、12 h），再置于37 ℃不同時間（5、10、30 min）觀察菌株存活情況，如圖3所示，冷凍前TSA上的初始菌落數(shù)為6.33（lg（CFU/mL））。冷凍后于4 ℃解凍0、2、6、12 h再置于37 ℃，與冷凍前相比兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)均顯著低于冷凍前（P＜0.05），僅除了4 ℃、12 h/37 ℃、5 min組TSA上的菌落數(shù)（P＞0.05），表明緩慢解凍仍造成了一定量細菌的死亡/損傷。4 ℃放置一定時間后，置于37 ℃、5 min，37 ℃、10 min，37 ℃、30 min各組兩種平板上的菌落數(shù)均稍有下降，顯著性分析具體結(jié)果見圖3。

圖3 不同緩慢解凍方式條件下E. coli O157:H7存活情況Fig. 3 Survival rates of E. coli O157:H7 treated by different slow thawing methods

進一步對37 ℃、5 min的各組進行比較時發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下時間越長菌數(shù)越多，4 ℃ 0 h和2 h之間菌落數(shù)無顯著差異，而4 ℃ 6 h和12 h菌落數(shù)顯著高于4 ℃ 0 h和2 h（P＜0.05）。37 ℃、10 min各組和37 ℃、30 min各組亦存在相似變化趨勢。結(jié)果表明4 ℃緩慢解凍時間越長，越有利于細菌的存活。分析原因可能是4 ℃放置較短時間后轉(zhuǎn)入37 ℃時，菌體無法適應(yīng)溫度的突然變化而加重應(yīng)激損傷程度造成了進一步的死亡，當4 ℃放置較長時間后轉(zhuǎn)入37 ℃時，細菌得到足夠時間的緩沖對較高溫度耐受增強，也可能在4 ℃較長時間時菌體存在一定程度的修復(fù)，具體機制有待進一步研究。

Metzger等[23]報道接種于奶酪的單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌-20 ℃冷凍30 d后分別采用4 ℃、14 h和20 ℃、4 h進行解凍，結(jié)果兩種解凍方式之間菌數(shù)無顯著差異。Manios等[6]報道接種于絞碎牛肉的沙門菌和E. coli O157:H7 -22 ℃冷凍5、75 d后，分別采用冰箱（4 ℃、16 h）、室溫（20 ℃、12 h）、微波22～24 min進行解凍，結(jié)果冰箱解凍或微波解凍與解凍前菌數(shù)無顯著性差異，而室溫解凍與解凍前菌數(shù)相比兩種菌均有所增加，且E. coli O157:H7菌數(shù)顯著增加。本實驗采用無營養(yǎng)PBS基質(zhì)的解凍實驗結(jié)論不一致，表明解凍對細菌存活的影響與基質(zhì)存在較大關(guān)系。

本實驗采用4 ℃、12 h/37 ℃、5～30 min解凍，TSA上菌落數(shù)無顯著差異，SMAC上的亦無顯著性差異，而SMAC上的菌落數(shù)顯著低于TSA上的菌落數(shù)（P＜0.05），表明尚有一定量損傷菌存在。本實驗結(jié)果提示，食品生產(chǎn)中采用“緩慢解凍”方式，在保證食品品質(zhì)的同時，也有利于食源性致病菌的存活，因此在冷凍食品風(fēng)險控制時除了常規(guī)檢測外，還應(yīng)重視損傷菌的檢測，以防漏檢或低估。

3 結(jié) 論

本實驗首先研究E. coli O157:H7不同菌株冷凍后的死亡和損傷情況，然后采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)研究冷凍后不同解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響。結(jié)論如下：1）實驗的4 株E. coli O157:H7冷凍后發(fā)生了一定程度的死亡和損傷，冷凍時間越長細菌致死和致傷程度越明顯，且存在菌株差異，冷凍72 h時菌株CICC21530的損傷率最高。2）采用混合菌株進行解凍實驗，E. coli O157:H7 PBS菌液冷凍后立即于20、30、37 ℃解凍，細菌發(fā)生了進一步的死亡，解凍溫度越高死亡越明顯。3）進一步探討緩慢解凍方式對菌體存活的影響，結(jié)果表明4 ℃緩慢解凍時間越長，越有利于細菌的存活，但實驗?zāi)┢谌杂幸欢繐p傷菌存在。本實驗提示冷凍食品風(fēng)險評估時應(yīng)重視對殘存菌尤其是損傷菌的檢測和控制。

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