降膽固醇乳酸菌的體外篩選及其降膽固醇機(jī)理探討

黃燕燕，郭 均，黎恒希，楊?lèi)?ài)君，馮立科，彭小霞，劉冬梅,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510640）

心腦血管疾病如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期食用乳酸菌及其制品可降低血清中低密度膽固醇含量，降低心腦血管病的發(fā)病率[1]。因此研究乳酸菌的降膽固醇性能及其機(jī)理具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，乳酸菌發(fā)揮作用取決于細(xì)菌能否通過(guò)胃腸道而在腸道中發(fā)揮作用，即其耐酸性和膽鹽耐受性。疏水性是決定細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物界面的最重要?jiǎng)恿χ?，因而菌體的細(xì)胞表面疏水性與其能否在腸道內(nèi)定殖息息相關(guān)[2]。膽鹽水解酶是微生物生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種胞內(nèi)酶，多存在于革蘭氏陽(yáng)性菌，包括乳桿菌、雙歧桿菌、屎腸球菌等，膽鹽水解酶可將體內(nèi)結(jié)合型膽鹽水解為游離型膽鹽，而游離型膽鹽不參與肝腸循環(huán)，隨糞便排出體外[3]，因而膽鹽水解酶活性是降低體內(nèi)膽固醇的關(guān)鍵因素。

膽固醇主要是在肝臟內(nèi)合成，由乙酰輔酶A開(kāi)始經(jīng)過(guò)一系列的酶促反應(yīng)合成的，其中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reducase，HMGCR）是合成反應(yīng)的限速酶，Chiu等[4]研究乳酸菌能夠降低其活性或影響其合成來(lái)降低膽固醇的合成，從而降低血清膽固醇水平。目前臨床上應(yīng)用于治療高膽固醇血癥的藥物主要是HMGCR競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如他汀類(lèi)藥物具有與HMGCR相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其對(duì)HMGCR具有加強(qiáng)的親和力，因而競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMGCR對(duì)膽固醇合成反應(yīng)的限速步驟的催化活性，減少內(nèi)源性膽固醇合成來(lái)達(dá)到降膽固醇功效[5]。這些結(jié)果引起了國(guó)內(nèi)外研究人員的普遍關(guān)注，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于降膽固醇乳酸菌的研究尚處于起步階段，大多數(shù)研究集中于菌株的篩選及其特性研究，但對(duì)作用機(jī)理探討多基于體外實(shí)驗(yàn)，篩選出的具有高效降膽固醇功效的乳酸菌對(duì)于體內(nèi)HMGCR的影響機(jī)理研究也很少。因此本實(shí)驗(yàn)旨在從開(kāi)菲爾粒和陳年泡菜水中分離篩選高效降膽固醇的乳酸菌，通過(guò)飼喂高血脂動(dòng)物模型大鼠，檢測(cè)大鼠血清中膽固醇降解情況以及肝臟中HMGCR基因mRNA表達(dá)量，在基因水平分析植物乳桿菌Lactobacillus plantarum DMDL 9010對(duì)膽固醇合成代謝相關(guān)基因的調(diào)控從而推斷其可能的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

開(kāi)菲爾粒 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；陳年泡菜水 廣東廣州市售。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8 周齡SPF級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠50 只，體質(zhì)量160～200 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK（粵）2012-0081，合格證編號(hào)440021000。

基礎(chǔ)飼料：蛋白質(zhì)20%，脂肪4.2%，碳水化合物50%，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。高脂飼料：豬油10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%，基礎(chǔ)飼料88.8%，混勻造粒，在飼喂大鼠之前進(jìn)行輻照殺菌。

瓊脂糖、溴乙錠、膽固醇、牛膽鹽（均為分析純）廣州卯林試劑有限公司；脫氧牛磺膽酸鈉、巰基乙酸鈉（均為分析純） 阿拉丁公司；鄰苯二甲醛、鄰苯二甲醛顯色劑、二甲苯、吐溫80（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；甘油三脂測(cè)定試劑盒、總膽固醇試劑盒 中生北控生物技術(shù)股份有限公司；引物溶液：HMGCR、LDL-R、CYP7A1和內(nèi)參基因β-actin由英維捷基公司合成。

MRS-CHOL液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取MRS培養(yǎng)基54 g，膽固醇1.0 g，吐溫20 mL，牛膽鹽3.0 g。將膽固醇置于吐溫80中溶解，使其沸騰后充分溶解后趁熱緩慢倒入培養(yǎng)基后，呈膠束溶液狀態(tài)，此培養(yǎng)基的顏色呈不透明的淡黃色。配制好的培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min后趁熱將離心管晃動(dòng)或上下顛倒振蕩，以使該膠狀物完全溶解，置于室溫中自然冷卻。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-18SI立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海日島科學(xué)儀器有限公司；EFGC-11155氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；Aplus mo-5L發(fā)酵罐 德國(guó)貝朗公司；MK3酶標(biāo)儀 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 降膽固醇乳酸菌初篩

從開(kāi)菲爾粒和泡菜水中接菌進(jìn)行平板培養(yǎng)得單菌落，分別挑選單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，將體積分?jǐn)?shù)5%二次活化的菌株接種至含1 mg/mL膽固醇的MRSCHOL培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后滅菌處理，經(jīng)離心（3 000 r/min，10 min），取上清液用鄰苯二甲醛比色法[6]于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度A。按公式（1）計(jì)算膽固醇去除率：

1.3.2 降膽固醇乳酸菌復(fù)篩

1.3.2.1 菌株耐酸性測(cè)定

調(diào)MRS培養(yǎng)基的pH值分別為3.0、4.0、5.0，pH值為6.0的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照組，分裝至各試管。將二次活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)5%接種于上述MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)3 h后取樣，測(cè)定OD600nm。按公式（2）計(jì)算菌株的耐酸性：

1.3.2.2 菌株耐膽鹽測(cè)定

將5%二次活化的菌株接種于含有3 g/L膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。以不加膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照組。傾注于平板在37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。按公式（3）計(jì)算菌株的膽鹽耐受性：

式中：VC1、VC0分別為測(cè)試樣品和對(duì)照樣品中的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.2.3 菌株疏水性測(cè)定

將5%二次活化的菌株接種于無(wú)菌MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，離心（9 500 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液離心洗滌2 次，將沉淀用緩沖液懸浮。以緩沖液為空白對(duì)照，調(diào)整菌體濃度，使其初始濃度在600 nm波長(zhǎng)處吸光度約為1。取4 mL調(diào)整濁度后的菌液，加入0.8 mL二甲苯，高速渦旋2 min，靜置10 min分層，取下層水相在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。按公式（4）計(jì)算乳酸菌細(xì)胞表面疏水性：

式中：A0和A分別為與二甲苯混勻前、后菌液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度。

1.3.2.4 菌株膽鹽水解酶定性測(cè)定

在新鮮配制的MRS液體培養(yǎng)基中添加3 g/L脫氧牛磺膽酸鈉、2 g/L巰基乙酸鈉、0.37 g/L CaCl2和15 g/L瓊脂，121 ℃滅菌15 min，傾倒入無(wú)菌平板中，待凝固后把無(wú)菌濾紙片均勻放入平板中，在每個(gè)濾紙片上滴加10 μL菌液（108～109CFU/mL），于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。若濾紙片周?chē)邪咨恋砦飫t認(rèn)為有膽鹽水解酶活性。

1.3.3 菌種鑒定

根據(jù)生理生化鑒定、16S rDNA分子鑒定以及乳酸脫氫酶1的上下游DNA序列鑒定菌株的菌種[6-7]，并送至廣東省保藏中心進(jìn)行保藏。

1.3.4 大鼠肝組織細(xì)胞HMGCR的表達(dá)檢測(cè)

1.3.4.1 菌種預(yù)處理

將L. plantarum DMDL 9010按體積分?jǐn)?shù)5%接種于200 mL液體MRS培養(yǎng)基中活化，放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再次按體積分?jǐn)?shù)為5%接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度厭氧培養(yǎng)，在37 ℃、pH 6.8的條件下培養(yǎng)18 h后在8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄去上清液，收集菌泥，按海藻糖（保護(hù)劑）與菌泥的體積比為1.5∶1的比例加入，于-40 ℃條件下預(yù)凍5 h，使其均勻凍結(jié)在容器內(nèi)壁上，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥18～20 h后，用生理鹽水復(fù)水后，洗滌兩次，測(cè)得L. plantarum DMDL 9010菌粉中活菌數(shù)為9.30×109CFU/g。

1.3.4.2 大鼠飼養(yǎng)

將50 只8 周齡SPF級(jí)SD大鼠按照平均體質(zhì)量無(wú)顯著差異隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組、9010高組、9010低組5組。正常組：普通飼料+無(wú)菌生理鹽水；模型組：高脂飼料+無(wú)菌生理鹽水；陽(yáng)性組：高脂飼料+1 mg/mL阿托伐他汀鈣片水溶液；9010高組：高脂飼料+109CFU/mL L. plantarum DMDL 9010菌懸液；9010低組：高脂飼料+107CFU/mL L. plantarum DMDL 9010菌懸液。每組10 只，每只SD大鼠灌胃1 mL/次。在第28、70天將大鼠禁食一夜，腹腔采血。采血后分離血清，2 500 r/min離心10 min取血清。分別參照試劑盒說(shuō)明，采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）的含量并對(duì)比各組間血清指標(biāo)的差異。第70天時(shí)分離肝臟，取其肝組織細(xì)胞HMGCR進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)。

1.3.4.3 引物設(shè)計(jì)

在基因庫(kù)中查到HMGCR基因庫(kù)編號(hào)為NM_013134，引物序列為GACCAACCTTCTACCTCAGCAAG和ACAACTCACCAGCCATCACAGT和管家基因β-actin的全長(zhǎng)cDNA序列，應(yīng)用軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由英維捷基公司合成。

1.3.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用SYBR Green I熒光染料進(jìn)行定量PCR。按照Ultra SYBR Mixture（with ROX）試劑盒說(shuō)明書(shū)建立25 μL的反應(yīng)體系，并以無(wú)酶水作空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為 ±s。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析（one way ANOVA）和Duncan多重比較法，顯著性水平均設(shè)定為P小于0.05。采用ABI7500型熒光定量PCR儀計(jì)算Ct值、閾值，如公式（5）、（6）所示，用2-ΔΔCt計(jì)算各組大鼠肝臟中HMGCR的表達(dá)水平，經(jīng)2-ΔΔCt校正后，將 設(shè)為1，其余各組相對(duì)正常組含量為2-ΔΔCt。

式中：ACt為待測(cè)樣品的目的基因Ct均值；BCt為對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因的Ct均值；ΔCt為樣品的目的基因Ct值；ΔΔCt為校正值；為對(duì)照組（正常組）基因Ct值。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌初篩

從開(kāi)菲爾粒和陳年泡菜水中分離得29 株菌分別編號(hào)為1～18（泡菜水）和S1～S11（開(kāi)菲爾粒），如表1所示，其膽固醇去除率的范圍為0.84%～37.58%，可見(jiàn)不同菌株間膽固醇降解能力差異大，與郭翔等[7]研究結(jié)果類(lèi)似。14株乳酸菌降低介質(zhì)中膽固醇能力小于10%，占48.28%；膽固醇去除率超過(guò)30%的僅有1 株（18號(hào)菌株），其膽固醇去除率高達(dá)37.58%，即培養(yǎng)基中375.8 μg/mL膽固醇被降解，與李婷婷等[8]研究結(jié)果（424.7～583.2 μg/mL）一致，明顯高于于志會(huì)等[9]的研究結(jié)果（14.38～22.40 μg/mL）和王巍等[10]的研究結(jié)果（126.2～162.2 μg/mL），可能與培養(yǎng)條件、膽固醇含量、乳酸菌接種量及乳酸菌個(gè)體差異等因素有關(guān)。最后，初篩結(jié)果選取為4、12、14、16、18、S3、S9、S11這8 株降膽固醇能力較強(qiáng)的菌株。

2.2 降膽固醇乳酸菌復(fù)篩

2.2.1 菌株的耐酸性

乳酸菌制品通常由食物或以制劑的形式口服，要到達(dá)腸道并具有良好的活性就必須能通過(guò)胃腸道傳輸，這就要求乳酸菌能耐受胃液的酸度及胃蛋白酶的作用，并能耐受膽汁、膽鹽和胰蛋白酶的作用[11]，保證其在胃腸道內(nèi)具有良好的存活能力，并能持續(xù)增長(zhǎng)和繁殖。正常人空腹時(shí)胃中的pH值在0.9～1.8之間，而食用奶制品或其他食物后，其胃液pH值的波動(dòng)范圍為1.8～5.0，如表2所示，8 株菌的耐酸性隨著pH值的降低而不斷下降，各菌株的耐酸性存在較大差異。在pH值為3.0時(shí)，8 株菌都能生長(zhǎng)。此結(jié)果與Wang Shuchen等[12]采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)乳酸菌株的耐酸性的結(jié)論相似。正常人食用奶制品或其他食物后，其胃液的pH值一般認(rèn)為3.0左右，故益生菌應(yīng)具有耐酸性并能夠在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖的特性。由此說(shuō)明8 株菌可以隨食物通過(guò)胃并到達(dá)小腸。其中，18號(hào)菌株表現(xiàn)出最好的耐酸性，其次是S11和S3。

表2 不同菌株的耐酸性（s，n= 10）Table 2 Acid tolerance of selected strains ± s, n= 10)%

表2 不同菌株的耐酸性（s，n= 10）Table 2 Acid tolerance of selected strains ± s, n= 10)%

菌株編號(hào) pH 3.0 pH 4.0 pH 5.0 4 42.25±0.19 48.42±0.14 85.39±0.12 12 36.50±0.15 40.17±0.42 51.25±0.19 14 37.98±0.32 40.51±0.34 43.85±0.23 16 31.92±0.22 51.90±0.12 64.06±0.44 18 80.12±0.41 85.12±0.42 98.12±0.32 S3 63.30±0.37 72.32±0.17 94.06±0.29 S9 55.14±0.25 78.20±0.29 93.99±0.27 S11 77.75±0.19 78.69±0.25 91.80±0.16

2.2.2 菌株的膽鹽耐受性

正常人體的小腸的膽鹽含量的波動(dòng)范圍在0.03%～0.3%且消化的時(shí)間一般為3h[13]，測(cè)定0.3%膽鹽條件下的菌株耐受性，判斷乳酸菌是否能在小腸中發(fā)揮作用。從表3可看出，菌液在不含膽鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，菌體濃度達(dá)到108～109CFU/mL。8 株菌株在含0.3%的膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)3 h后，其活菌數(shù)仍能達(dá)到106CFU/mL以上，高于菌體發(fā)揮功能特性的活菌數(shù)臨界值[14]。由此表明，8株菌株都能夠耐受消化道的高膽鹽環(huán)境，順利通過(guò)小腸到達(dá)大腸。其中18號(hào)菌株的膽鹽耐受性最強(qiáng)，高達(dá)35.48%，其次是S9、S3號(hào)菌株。

表3 菌株的膽鹽耐受性（s，n=10）Table 3 Bile acid tolerance of selected strains s, n= 10)

表3 菌株的膽鹽耐受性（s，n=10）Table 3 Bile acid tolerance of selected strains s, n= 10)

注：同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05），下同。

菌株編號(hào)菌體濃度（lg（CFU/mL）） 膽鹽耐受性/%0%膽鹽 0.3%膽鹽4 8.87±0.03 6.11±0.04 17.37±2.59c 12 9.02±0.08 6.14±0.03 13.18±2.33c 14 8.95±0.06 6.17±0.07 16.60±3.82c 16 9.14±0.05 6.31±0.05 14.79±2.80c 18 9.15±0.02 6.70±0.08 35.48±5.31a S3 9.29±0.04 6.73±0.05 27.54±3.70b S9 8.70±0.05 6.18±0.06 30.20±2.29a S11 9.11±0.04 6.35±0.03 17.38±2.40c

2.2.3 菌株的疏水性

人體對(duì)膽固醇的吸收主要在小腸部位，因此菌體對(duì)機(jī)體產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的前題條件是益生菌必須黏附到腸黏膜的表面并定殖在小腸，從而抑制病原菌的黏附和侵襲，提高機(jī)體免疫力[15]。乳酸菌黏附到腸細(xì)胞是定殖的首要條件，這類(lèi)黏附既可以是基于物理化學(xué)因素的非特異性黏附，也可以是細(xì)菌表面含有的脂磷壁酸、肽聚糖和細(xì)胞壁蛋白等與腸黏膜細(xì)胞的特異性黏附[16]。乳酸菌對(duì)小腸細(xì)胞的黏附過(guò)程與多種因素相關(guān)，主要包括疏水作用、靜電相互作用或特殊菌體結(jié)構(gòu)[17]。菌株的疏水性如圖1所示。根據(jù)菌株在水相和二甲苯相中發(fā)生的疏水分配來(lái)比較其疏水性，結(jié)果表明：疏水性10%～20%和20%～30%之間分別有5 株和2 株菌，超過(guò)30%的僅1株菌株，其中18號(hào)菌株的疏水性最強(qiáng)，高達(dá)40%。不同菌株的疏水性差別較大，這與Slim等[18]研究的一致。由此可見(jiàn)18號(hào)菌株對(duì)二甲苯的吸附能力比較強(qiáng)，其次是S3、S9號(hào)菌株。

圖1 菌株的疏水性Fig. 1 Hydrophobicity property of selected strains

2.2.4 菌株的膽鹽水解酶活性

研究表明，干酪乳桿菌、植物乳桿菌都可以產(chǎn)生膽鹽水解酶，具有降低介質(zhì)和血清中膽固醇的能力[19]，膽鹽水解酶活性已經(jīng)成為體外篩選降膽固醇乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo)。菌株的膽鹽水解酶活性如圖2所示，37 ℃培養(yǎng)72 h后，18號(hào)、S3菌株的濾紙片周?chē)邪咨恋?，S9菌株的濾紙片周?chē)鸁o(wú)白色沉淀，而對(duì)照組濾紙片周?chē)鸁o(wú)白色沉淀，說(shuō)明18號(hào)和S3號(hào)菌株可能具有膽鹽水解酶，它能將結(jié)合態(tài)膽鹽水解為游離膽酸，而游離膽酸與培養(yǎng)基中的CaCl2產(chǎn)生白色沉淀。

圖2 菌株的膽鹽水解酶活性Fig. 2 Determination of bile salt hydrolase activity in solid MRS medium

綜合以上結(jié)果，18號(hào)菌株的膽固醇去除率達(dá)37.58%，pH 3.0時(shí)存活率達(dá)80.12%，膽鹽耐受性高達(dá)35.48%，疏水性高達(dá)40%，并且具有膽鹽水解酶活性。因此根據(jù)生理生化鑒定、16S rDNA分子鑒定以及乳酸脫氫酶1的上下游DNA序列鑒定菌株的菌種[20-21]，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC NO.5172，于2011年其首次被鑒定為戊糖乳桿菌DMDL 9010，其16S rDNA 基因庫(kù)登錄序列號(hào)為KJ 917253。

2.3 大鼠血清中血脂指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表4 各組血脂檢測(cè)結(jié)果比較（x±s，n=10）Table 4 Serum lipid levels of experimental rats (x ± s, n = 10)mmol/L

如表4所示，飼喂28 d時(shí)，模型組的血清TC（1.47±0.23）mmol/L較正常組（1.18±0.19）mmol/L有明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且模型組血清LDL-C（0.44±0.11）mmol/L相對(duì)于正常組（0.27±0.08）mmol/L顯著升高，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)28 d的高脂飼料的飼喂，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高脂模型成功建立。相比正常組，模型組的血清TC、LDL-C水平較正常組有明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)過(guò)70 d高脂飼料飼喂，導(dǎo)致大鼠體內(nèi)TC和LDL-C增多，增大了大鼠患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)模型組，陽(yáng)性組和9010高組、9010低組的TC、LDL-C均有一定程度的降低，其中陽(yáng)性組和9010高組有顯著性降低（P＜0.05），且9010高組能顯著降低高脂大鼠血清TC（23.03%）和LDL-C（28.00%），說(shuō)明連續(xù)70 d灌胃阿托伐他汀和乳酸菌對(duì)高脂大鼠均具有降低血清膽固醇的效果，且9010高組的效果優(yōu)于阿托伐他汀。在模型組、陽(yáng)性組、9010高組、9010低組中，灌胃高劑量乳酸菌的實(shí)驗(yàn)組（9010高組）大鼠血清70 d TG含量最低，但是各組之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。相對(duì)正常組，模型組的血清HDL-C含量顯著降低，陽(yáng)性組和乳酸菌組相對(duì)模型組的HDL-C有一定程度的升高，但沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明連續(xù)70 d灌胃阿托伐他汀和乳酸菌對(duì)大鼠血清TG和HDL-C的作用不顯著。

2.4 大鼠肝組織HMGCR基因mRNA的表達(dá)變化

表5 實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟中HMGCR mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 5 Relative expression level of HMGCR mRNA in liver of experimental rats

如表5所示，設(shè)定正常組的HMGCR基因相對(duì)表達(dá)量為基準(zhǔn)水平1，其余各高脂飼料喂養(yǎng)組HMGCR基因與正常組作對(duì)比。相對(duì)普通飼料喂養(yǎng)的正常組，各高脂飲食喂養(yǎng)組的HMGCR基因mRNA表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明飲食來(lái)源中過(guò)高的膽固醇會(huì)減少體內(nèi)膽固醇的內(nèi)源性合成，從而抑制膽固醇合成限速酶HMGCR的活性。相對(duì)模型組，陽(yáng)性組的HMGCR基因mRNA表達(dá)量降低79.92%（P＜0.05），說(shuō)明阿托伐他汀類(lèi)藥物對(duì)HMGCR有明顯的抑制作用，可能是因?yàn)榘⑼蟹ニ∈桥cHMGCR產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，與Takeda等[22]研究結(jié)果一致。相對(duì)模型組，9010高組下調(diào)肝臟中HMGCR基因mRNA的表達(dá)（62.86%）（P＜0.05），說(shuō)明高劑量DMDL 9010能通過(guò)降低HMGCR活性來(lái)降低膽固醇合成，因此導(dǎo)致血清膽固醇水平降低。

3 討論與結(jié)論

許多流行病學(xué)調(diào)查及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，如LDL-C水平的升高是動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┌l(fā)生與發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[23]。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)外具有降低膽固醇的益生功能，其主要從乳制品和發(fā)酵制品中篩選[24-25]。與目前所報(bào)道的文獻(xiàn)相比較，本實(shí)驗(yàn)成功從開(kāi)菲爾粒和陳年泡菜水中分離篩選出1 株高效降解膽固醇的乳酸菌，經(jīng)鑒定為L(zhǎng). plantarum DMDL 9010，其膽固醇降解率達(dá)37.58%，pH 3.0時(shí)存活率達(dá)80.12%，膽鹽耐受性高達(dá)35.48%，疏水性高達(dá)40%，并且具有膽鹽水解酶活性，是為數(shù)不多的滿足進(jìn)入胃腸道存活率高同時(shí)高效降膽固醇的乳酸菌。但不同菌株的降膽固醇能力存在一定差異，Anderson等[26]采用隨機(jī)雙盲和安慰劑對(duì)照的設(shè)計(jì)對(duì)膽固醇水平為5.40～8.32 mmol/L的48 位志愿者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每天飲用200 g含嗜酸乳桿菌L. acidophilus L1的酸奶10 周后，其血清膽固醇水平比服用安慰劑組顯著降低2.4%。Kiebling等[27]對(duì)年齡在19～56 歲的29 名健康女性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每天飲用300 g含嗜酸乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的酸奶21 周后，能顯著升高HDL-C水平（P＜0.002），并升高了LDL-C與HDL-C的比例。以上結(jié)果的差異性由多種因素引起的，包括乳酸菌菌株的差異、乳酸菌的使用劑量、實(shí)驗(yàn)周期、樣本量大小等因素[28]。本實(shí)驗(yàn)將分離的菌株應(yīng)用到高脂動(dòng)物模型中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果進(jìn)一步證明L. plantarum DMDL 9010的降膽固醇效果。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給高脂動(dòng)物模型灌胃L. plantarum DMDL 9010，相對(duì)模型組，陽(yáng)性組和9010高組、9010低組的TC、LDL-C均有一定程度的降低，其中陽(yáng)性組和9010高組有顯著性降低（P＜0.05）（表4），且9010高組TC、LDL-C含量最低，說(shuō)明連續(xù)10 周灌胃阿托伐他汀和乳酸菌對(duì)高脂大鼠均具有降低血清膽固醇的效果，且高劑量DMDL 9010的效果優(yōu)于阿托伐他汀。這與Xu Hu等[1]研究發(fā)現(xiàn)相一致，L. plantarum NS5能明顯降低SD大鼠TC、TG和LDL-C水平。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示L. plantarum DMDL 9010和阿托伐他汀能顯著下調(diào)肝臟中膽固醇合成HMGCR基因mRNA的表達(dá)（62.86%和79.92%）（P＜0.05）（表5），這一結(jié)果與血清中血脂指標(biāo)相互驗(yàn)證，說(shuō)明L. plantarum DMDL 9010和阿托伐他汀降低膽固醇途徑也可能與抑制膽固醇合成限速酶的表達(dá)有關(guān)。Fukushima等[29]研究發(fā)現(xiàn)給成功建立高脂模型的大鼠飼喂用嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌發(fā)酵的米糠后，降低了肝臟中HMGCR的活性，進(jìn)而降低了血清膽固醇水平。Jungae等[30]研究植物乳桿菌L. plantarum KCTC3928菌體的死活對(duì)HMGCR的調(diào)控起不同作用，活的植物乳桿菌能夠下調(diào)HMGCR的表達(dá)，而死的菌體則能上調(diào)HMGCR的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)也驗(yàn)證了高劑量的L. plantarum DMDL 9010能下調(diào)肝臟中HMGCR基因mRNA的表達(dá)，因而膽固醇水平有一定程度的下降。而Simons等[31]研究發(fā)現(xiàn)，46 名受試者被隨機(jī)分為兩組，每天服用4 顆含發(fā)酵乳桿菌的膠囊（含2×109CFU）和安慰劑10 周后，受試者的血脂水平?jīng)]有顯著改善。目前，乳酸菌降膽固醇機(jī)制包括乳酸菌同化吸收或吸附膽固醇作用、共沉淀作用、同化吸收與共沉淀二者結(jié)合等理論。存在這樣的爭(zhēng)議說(shuō)明菌株之間具有差異性，其降解膽固醇的機(jī)理有很多方面。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明從開(kāi)菲爾粒和陳年泡菜水中分離篩選的L. plantarum DMDL 9010具有高效降膽固醇能力，其降膽固醇機(jī)理可能是影響膽固醇合成限速酶HMGCR的活性，從而影響膽固醇的生成，進(jìn)一步降低血清中膽固醇的含量。其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為預(yù)防和治療高膽固醇血癥的益生菌制劑提供了可能，但是其降膽固醇的機(jī)理仍有待進(jìn)一步的研究。

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