江楊娟，徐 麗，陳美思，周小敏，韓翠萍*，王 松*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆是中國主要農(nóng)作物之一，常被用來生產(chǎn)大豆蛋白，而大豆糖蜜是生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，據(jù)報道，每生產(chǎn)1 t醇法大豆?jié)饪s蛋白將得到大約0.34 t大豆糖蜜[1]，因大豆糖蜜黏稠度高、色澤深，處理起來有很大的難度，故大部分大豆加工廠將其作為廢棄物或用作動物飼料低價出售，由于大豆糖蜜中大多數(shù)碳水化合物是結(jié)構(gòu)多糖和含有半乳糖的低聚糖如水蘇糖和棉子糖，動物可能缺乏必要的內(nèi)源酶來消化這些碳水化合物，因此又在一定程度上造成了資源浪費等問題[2]。同時，大豆糖蜜的組分豐富，含有高濃度的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和礦物質(zhì)等[3-5]，所以大豆糖蜜是一種可以被再度利用的生物資源。近年來，關(guān)于大豆糖蜜中功能性成分的研究成果被大量報道，為大豆糖蜜資源的開發(fā)和利用提供了廣闊的前景。因大豆糖蜜中含有豐富的營養(yǎng)成分，常作為微生物的生長發(fā)酵劑。據(jù)Siqueira等[4]研究，大豆糖蜜的碳水化合物主要是由水蘇糖、棉子糖和蔗糖組成。目前，國內(nèi)外大量學(xué)者研究以大豆糖蜜作為微生物的碳源來生產(chǎn)乳酸[6-7]、檸檬酸[8]、乙醇[9-10]等，且與常用的碳源葡萄糖相比，大豆糖蜜的價格僅為其20%，因此可以極大地節(jié)約成本并提高利潤[11]。

乳酸又可稱為α-羥基丙醇酸，廣泛存在于人類、動物和微生物的代謝機制中。乳酸作為21世紀(jì)最具應(yīng)用潛力的有機酸之一[12]，既是重要的有機化工原料，又是重要的精細(xì)化學(xué)品，乳酸及其衍生物被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、日用品、化工等行業(yè)[13-16]。乳酸在全球的生產(chǎn)量已超越檸檬酸和乙酸，位居第一[17]，且為了大力開發(fā)環(huán)境友好型的生物可降解材料，乳酸將會逐漸替代石油基塑料產(chǎn)品。目前乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶法及微生物發(fā)酵法[18]。國內(nèi)外企業(yè)常用的生產(chǎn)乳酸方法是微生物發(fā)酵法，這主要是微生物發(fā)酵法可利用的原料來源廣泛，成本也較低，且生產(chǎn)的乳酸光學(xué)純度高，安全性好。

大豆糖蜜含有多種碳水化合物，主要含有的大量棉子糖和水蘇糖，大部分酵母菌均難以利用，而乳酸菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生α-半乳糖苷酶水解水蘇糖和棉子糖生成乳酸和乙酸[19-20]。因此，本實驗選用6 株乳酸菌發(fā)酵大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸，通過乳酸菌的生長特征、乳酸產(chǎn)量、大豆糖蜜的糖代謝來分析乳酸菌利用大豆糖蜜以及生產(chǎn)乳酸的能力，為大豆糖蜜的利用提供應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum）CICC23168 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；德氏乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckii ssp.bulgaricus）KLDS1.8501、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）KLDS1.0327來自于乳品科學(xué)教育部重點實驗室；嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）ATCC11975、干酪乳桿菌（L. casei）ATCC393 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；植物乳桿菌（L. plantarum）NAU322來自于實驗室篩選菌株。大豆糖蜜購自大慶日月星有限責(zé)任公司，大豆糖蜜的主要成分測定結(jié)果如表1所示。

表1 大豆糖蜜的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of soybean molasses

MRS肉湯活化培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

大豆糖蜜培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2.0 g，吐溫80 1 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.05 g，15 °Brix大豆糖蜜1 000 mL、pH 6.0、121 ℃滅菌15 min。種子培養(yǎng)基同大豆糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance 2695高效液相色譜儀、XBridge Amide色譜柱 美國Waters公司；Allegra X-30R多功能臺式離心機 美國貝克曼庫特公司；超凈工作臺 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HPX-87H色譜柱 美國伯樂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的儲存和活化

將凍干的菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基活化，再將活化后的菌液接種于種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)用于隨后的實驗。所有步驟都要求在無菌室操作進行。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵大豆糖蜜

分別將L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus KLDS1.0327、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322接種于大豆糖蜜培養(yǎng)基。大豆糖蜜的可溶性固形物濃度通過加蒸餾水稀釋調(diào)節(jié)至15 °Brix。大豆糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基pH值用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至6.0。菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基被活化，接種到種子培養(yǎng)基中，然后將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到大豆糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞濃度控制在1.05×107CFU/mL。在最佳溫度下，每隔8 h取樣，對發(fā)酵液中的乳酸菌活細(xì)胞數(shù)、碳水化合物含量及乳酸產(chǎn)量進行測定分析。

1.3.3 指標(biāo)成分的測定

1.3.3.1 乳酸菌活細(xì)胞數(shù)的測定

按照1.3.2節(jié)操作，每隔8 h取樣大豆糖蜜發(fā)酵液，稀釋涂布平板測定活細(xì)胞數(shù)。

1.3.3.2 大豆糖蜜組成成分的測定

大豆糖蜜中的碳水化合物采用高效液相色譜法測定。蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測定[21]。脂質(zhì)經(jīng)正己烷萃取后采用質(zhì)量分析法測得[22]。大豆糖蜜樣品在550 ℃燃燒后用質(zhì)量分析法測定灰分[23]。大豆糖蜜在105 ℃干燥后通過質(zhì)量分析法測得水分含量[24]。

1.3.3.3 碳水化合物消耗量的測定

采用高效液相色譜測定發(fā)酵液中蔗糖、棉子糖、水蘇糖的含量。色譜條件為：Waters Alliance 2695色譜儀；色譜柱為Waters XBridge Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；檢測器為Waters 2487示差檢測器；流動相為75%乙腈溶液；柱溫為55 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL。

以峰面積為縱坐標(biāo)，分別以蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)：蔗糖：y=7 023.2x+1661.5，R2=0.995 6；棉子糖：y=6 014.7x-99.104，R2=0.999 8；水蘇糖：y=2 580.6x-6 298，R2=0.992 4。碳水化合物消耗量和利用率分別按公式（1）和（2）進行計算：

1.3.3.4 乳酸產(chǎn)生量的測定

采用液相色譜測定發(fā)酵液中乳酸的含量。色譜條件為：色譜儀為Waters Alliance 2695；色譜柱為Bio-Rad HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；檢測器為Waters 2487示差檢測器；流動相為5 mmol/L H2SO4溶液；柱溫為40 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為20 μL。

以峰面積為縱坐標(biāo)、乳酸產(chǎn)生量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)：y=9 034.9x+8 224.4，R2=0.999 8。乳酸產(chǎn)生量按公式（3）進行計算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗重復(fù)3 次，采用Microsoft Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。方差分析采用SPSS軟件中的One-Way ANOVA進行分析；相關(guān)性分析采用SPSS軟件中的皮爾遜相關(guān)系數(shù)進行分析；采用Origin 9.0軟件進行繪圖；采用Microsoft Word進行表格制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的生長特征

圖1 6 種菌株在15 °Brix大豆糖蜜中的生長特征（37 ℃，pH 6.0）Fig. 1 Growth characteristics of six different strains in soybean molasses at 15 °Brix (37 ℃, pH 6.0)

如圖1所示，在15 °Brix的大豆糖蜜中，在37 ℃、pH 6.0條件下，L. plantarum subsp. plantarum CICC23168的遲滯期和對數(shù)期時間很短，8 h即進入到穩(wěn)定期，其活細(xì)胞數(shù)達到最高值6.66×109CFU/mL，40 h以后進入衰亡期。L. acidophilus KLDS1.0327的最大活細(xì)胞數(shù)與L. plantarum subsp. plantarum CICC23168相似，其活細(xì)胞數(shù)也可達到3.98×109CFU/mL，但是需要48 h，且其遲滯期很長約24 h，因此其獲得最大細(xì)胞數(shù)需要時間過長。L. casei ATCC393和L. acidophilus ATCC11975的活細(xì)胞數(shù)與前2 株相比較低，都分別達到7.75×108CFU/mL和9.25×108CFU/mL，前者8 h活細(xì)胞數(shù)就可達到最大量，而后者需要32 h才能達到。L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501和L. plantarum NAU322很快達到最大活細(xì)胞數(shù)，但與其他菌株相比活細(xì)胞數(shù)很低，僅為1.5×108CFU/mL和7.75×107CFU/mL，且兩株菌16 h后細(xì)胞開始衰亡，L. plantarum NAU322衰亡速率很快，8 h下降一個數(shù)量級，可能是因為耐酸能力較弱。

綜上所述，L. plantarum subsp. plantarum CICC23168是活細(xì)胞數(shù)最快能達到6.66×109CFU/mL的菌株，且穩(wěn)定時間長，雖然L. acidophilus KLDS1.0327的活細(xì)胞數(shù)也能達到3.98×109CFU/mL，但是其遲滯期太長，而其他4 株乳酸菌的最高活細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于L. plantarum subsp.plantarum CICC23168，說明L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在大豆糖蜜中生長旺盛。

2.2 乳酸菌對大豆糖蜜碳水化合物的利用情況

圖2 6 株菌在48 h內(nèi)對碳水化合物的利用Fig. 2 Carbohydrate utilization by six different strains in soybean molasses at 15 °Brix during 48 h

如圖2A所示，經(jīng)過48 h發(fā)酵，L. acidophilus ATCC11975、L. acidophilus KLDS1.0327、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501和L. plantarum NAU322發(fā)酵底物中的蔗糖含量不斷下降，表明該5 株菌均有利用大豆糖蜜中的蔗糖的能力。其中L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在發(fā)酵開始就水解蔗糖，16 h內(nèi)發(fā)酵液中蔗糖含量快速下降，且蔗糖利用率很高，這可能是因為該菌的蔗糖酶是固有酶，可以很快適應(yīng)蔗糖環(huán)境，而大豆糖蜜蔗糖含量很高，因此在大豆糖蜜中可以快速生長（圖1）[25-26]。L. acidophilus KLDS1.0327在發(fā)酵48 h內(nèi)，發(fā)酵底物中的蔗糖含量先呈小幅度降低趨勢，24 h后突然大量代謝蔗糖，由圖2B和2C可知，在前8 h該菌對水蘇糖和棉籽糖的代謝量很小，而24 h后代謝量急劇增加，說明該菌對3 種糖的代謝啟動緩慢，可能是因為L. acidophilus KLDS1.0327中代謝這3 種糖所需要的酶是誘導(dǎo)酶，如蔗糖酶、α-半乳糖苷酶等。L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在發(fā)酵48 h內(nèi)，大豆糖蜜中蔗糖含量呈降低趨勢，表明該菌具有水解蔗糖的能力，但是在32～40 h，蔗糖含量急速上升，可能是L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在此期間產(chǎn)生了蔗糖合成酶或是由于水蘇糖和棉子糖水解產(chǎn)生了部分蔗糖（圖2B和2C）。L. acidophilus ATCC11975和L. plantarum NAU322在發(fā)酵48 h內(nèi)，大豆糖蜜中蔗糖含量小幅度降低，說明該2 株菌株利用蔗糖的能力并不強。L. casei ATCC393對蔗糖的利用情況與其他5 株菌有很明顯的差異，L. casei ATCC393在發(fā)酵48 h內(nèi)，蔗糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是由于L. casei ATCC393在發(fā)酵初始階段產(chǎn)生棉子糖系列寡糖水解酶活力大于蔗糖水解酶活力導(dǎo)致。

如圖2B所示，在發(fā)酵48 h內(nèi)，6 株乳酸菌的發(fā)酵液中棉子糖含量均呈降低趨勢，說明6 株菌株均能利用大豆糖蜜中的棉子糖。其中L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168和L. casei ATCC393在發(fā)酵48 h內(nèi)，大豆糖蜜中的棉子糖含量呈小幅度降低趨勢，說明該4 株菌株水解棉子糖的能力并不強。而L. acidophilus KLDS1.0327在發(fā)酵24～32 h，棉子糖含量大幅降低，可能是因為L. acidophilus KLDS1.0327誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量可水解棉子糖的胞外酶。L. plantarum NAU322在8～16 h棉子糖含量呈上升趨勢，可能是因為在此期間產(chǎn)生了棉子糖合成酶，因此棉子糖含量升高[27-28]。

如圖2C所示，在發(fā)酵48 h內(nèi)，6 種菌株的發(fā)酵液中水蘇糖含量均呈降低趨勢，說明6 株菌株均有利用大豆糖蜜中的水蘇糖[29-30]的能力。其中，L. acidophilus KLDS1.0327對水蘇糖的利用最大，在24～48 h產(chǎn)生大量可水解水蘇糖的胞外酶，如α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶等[31]。

綜上所述，該6 株乳酸菌均能利用大豆糖蜜中的主要碳水化合物，其中L. acidophilus KLDS1.0327和L.plantarum subsp. plantarum CICC23168較其他菌株糖代謝能力強，發(fā)酵48 h后，碳水化合物的總消耗量分別為27.47 g/L和26.40 g/L，說明該2 株菌更具有以大豆糖蜜為底物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的潛力。

2.3 大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

圖3 6 株菌種在大豆糖蜜中生產(chǎn)乳酸的情況Fig. 3 Lactic acid production of six different strains grown in soybean molasses at 15 °Brix during 48 h

由圖3可見，以15 °Brix大豆糖蜜作為發(fā)酵底物，在發(fā)酵48 h內(nèi)，6 株菌的發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)生量都有所增加，其中L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L.acidophilus ATCC11975、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322這4 株菌的乳酸產(chǎn)生量較低，發(fā)酵48 h后乳酸產(chǎn)生量僅為2.95、2.50、4.18 g/L和5.86 g/L。而L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在發(fā)酵8 h內(nèi)乳酸產(chǎn)生量快速增加，最大乳酸產(chǎn)生率為0.48 g/（L·h）。L. acidophilus KLDS1.0327在發(fā)酵24 h內(nèi)，乳酸產(chǎn)生量很低，是因為L. acidophilus KLDS1.0327處于延滯期，活細(xì)胞數(shù)僅為2×107CFU/mL（圖1），幾乎未水解大豆糖蜜中的碳水化合物（圖2）。在發(fā)酵24 h后，乳酸產(chǎn)生量突然大幅度上升，因為該菌此時開始大量生長繁殖（圖3），加速利用大豆糖蜜中的碳水化合物，代謝生成終產(chǎn)物乳酸，發(fā)酵48 h后積累乳酸質(zhì)量濃度為11.57 g/L。L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在發(fā)酵48 h內(nèi)，乳酸產(chǎn)生量隨著發(fā)酵的進行而逐漸升高，在發(fā)酵48 h時產(chǎn)生量為12.53 g/L，與其他5 株菌株相比較高；而在發(fā)酵24 h時，其乳酸產(chǎn)生量即可達12.18 g/L，相比48 h時雖差異顯著（P＜0.05 ），但24～48 h間僅合成乳酸0.35 g/L。

綜上所述，雖然L. acidophilus KLDS1.0327的乳酸產(chǎn)生量較高，糖代謝能力較強，但因其發(fā)酵時間過長，因此，判定其為利用大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸的非優(yōu)勢菌株。而L. plantarum subsp. plantarum CICC23168因其可以大量代謝大豆糖蜜中蔗糖，且在短時間內(nèi)（8 h）生長量達到6.66×1010CFU/mL，且24 h內(nèi)產(chǎn)生較高濃度乳酸，所以其具有作為利用大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸的潛力。選擇24 h作為L. plantarum subsp. plantarum CICC23168的最佳發(fā)酵時間，從而節(jié)省生產(chǎn)成本。

3 結(jié) 論

在利用大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸的研究中，發(fā)現(xiàn)L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus KLDS1.0327、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322六株乳酸菌菌株均能利用大豆糖蜜產(chǎn)生乳酸。其中，在發(fā)酵24 h時，L. plantarum subsp.plantarum CICC23168的活細(xì)胞數(shù)達到6.66×109CFU/mL，乳酸產(chǎn)生量為12.18 g/L，總糖消耗量為22.48 g/L，與其他菌株相比有明顯優(yōu)勢。L. plantarum subsp. plantarum CICC23168具有發(fā)酵時間短，活細(xì)胞數(shù)高，總糖消耗量大，乳酸產(chǎn)生量高的特點。說明L. plantarum subsp. plantarum CICC23168是能利用大豆糖蜜發(fā)酵產(chǎn)乳酸的潛力菌株。

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