Nano DSC法測定ILPR G-四鏈體的熱力學(xué)性質(zhì)

張又右，史全，王思雨，譚志誠，王韶旭

(1.大連交通大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連116028；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 熱化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

0 引言

端粒結(jié)構(gòu)存在于染色體末端，是一種富含鳥嘌呤(Guanine)的非編碼重復(fù)序列.端粒DNA的四個(gè)鳥嘌呤G在一價(jià)金屬陽離子(如K+、Na+)的誘導(dǎo)下[1]可以通過堿基間Hoogsteen氫鍵作用形成環(huán)狀的芳香平面結(jié)構(gòu)——G-四分體(G-quartets)，平面通過π-π相互作用進(jìn)一步形成四鏈體結(jié)構(gòu).已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)DNA序列形成穩(wěn)定的G-四鏈體時(shí)，端粒酶活性降低，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被明顯抑制[2].在生物體內(nèi)，G-四鏈體的不同堿基類型、空間構(gòu)象、溝槽種類等決定了G-四鏈體具有多態(tài)性和特異性，使得G-四鏈體能夠作為藥物選擇性識別的靶點(diǎn).因而近年來G-四鏈體在小分子抗病毒[3]和抗腫瘤[4]藥物合成方面得到了廣泛的關(guān)注.

ILPR(insulin linkage polymorohism region)是位于染色體胰島素基因近側(cè)啟動子365 bp處的一個(gè)基因片段[5]，其堿基序列為5′-ACAG4TGTG4-3′.Kennedy等[6]證實(shí)了ILPR序列能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，且能夠在胰島β細(xì)胞之間傳遞轉(zhuǎn)錄信號，該序列的增多會導(dǎo)致病毒基因具有高傳染性，因此ILPR序列是Ⅰ型糖尿病這一多基因遺傳病的關(guān)鍵.Schonhoft等[7]提出當(dāng)ILPR序列折疊形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平降低，病毒基因表達(dá)被抑制，從而達(dá)到靶向治療的目的.

近年來國內(nèi)外學(xué)者對ILPR G-四鏈體進(jìn)行了一系列結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究.Schonhoft等[7]使用熒光淬滅法研究了ILPR G-四鏈體與胰島素溶液的結(jié)合常數(shù).Jennifer等[8]利用圓二色光譜法測定了ILPR G-四鏈體與胰島素結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化并設(shè)計(jì)了相應(yīng)的電化學(xué)傳感器.Xiao等[9]在其工作中使用等離子共振技術(shù)研究了ILPR G-四鏈體和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)的解離常數(shù).Christine等[10]研究了ILPR G-四鏈體與胰島素的作用機(jī)制且證明了ILPR能在鉀離子溶液中形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu).這些研究在一定程度上探究了G-四鏈體的性質(zhì)，揭示了ILPR序列和胰島素的結(jié)合作用，然而對ILPR G-四鏈體的熱力學(xué)性質(zhì)如比熱研究等涉及較少.

差示掃描微量熱儀技術(shù)(Nano DSC)能夠準(zhǔn)確地測定微瓦級別的熱效應(yīng)，具有高靈敏性和穩(wěn)定的控溫能力，這一量熱技術(shù)能從能量角度提供光譜法等其他方法無法直接得到的熱力學(xué)基礎(chǔ)參數(shù)，在測定G-四鏈體等小分子時(shí)能準(zhǔn)確獲取體系中相互作用的能量信息.

本研究主要利用TA Nano DSC在40～100℃溫區(qū)測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的熔融溫度Tm、融化焓ΔH和等壓比熱Cp，并通過兩態(tài)模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，將熱力學(xué)行為與微觀結(jié)構(gòu)變化結(jié)合起來，為當(dāng)前進(jìn)一步研究ILPR G-四聯(lián)體提供新思路.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與儀器

ILPR序列的DNA片段由上海生工生物工程有限公司合成和純化， DNA序列通過質(zhì)譜檢測，分子量誤差<0.1%；氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，分析純，購自天津阿法埃莎(Alfa Aesar)化學(xué)有限公司；0.1 mol/L甘氨酸溶液(pH為2.4)和0.925 mg/mL溶菌酶溶液由TA Instruments提供；實(shí)驗(yàn)用水為高純水.

1.2 DNA樣品預(yù)處理

將50 OD DNA片段溶于高純水中，于4℃低溫靜置保存12 h，配置成儲存液.配置PBS緩沖液： 10 mmol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液中加入 100 mmol/L的KCl緩沖溶液(調(diào)節(jié)pH為7.4).儲存液中加入5 mL PBS緩沖液混合，留作退火處理.

1.3 Nano DSC實(shí)驗(yàn)

1.3.1 誤差校準(zhǔn)

使用隨配的脫氣裝置，在20 inches Hg的真空度下將待測甘氨酸與溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)試劑脫氣15 min，消除氣泡對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾.基線實(shí)驗(yàn)在3 atm壓力下以1℃/min的升溫速率預(yù)掃描甘氨酸溶液至85℃，后續(xù)從25℃升溫至85℃，重復(fù)兩遍.標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)驗(yàn)在3 atm壓力下掃描溶菌酶溶液至85℃.誤差校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍.

1.3.2 預(yù)掃描

為了避免溶液與儀器器壁之間的熱量交換對熱流信號產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)前12 h將適量PBS溶液進(jìn)樣至Nano DSC中，以1℃/min的升降溫速率進(jìn)行循環(huán)實(shí)驗(yàn).

1.3.3 DNA退火

混合液在Nano DSC中以1.5℃/min的速率從室溫升至90℃，于90℃恒溫10 min，以確保序列處于單鏈無序狀態(tài)，再以0.1℃/min的速率緩慢降至4℃.

1.3.4 G-四鏈體測定

緩沖液掃描在3 atm 壓力下于40～110℃溫度范圍內(nèi)，以0.5℃/min的速率升溫PBS緩沖溶液，重復(fù)測定2次.樣品掃描在3 atm 壓力下于40～110℃溫度范圍內(nèi)，以0.5℃/min的速率升溫退火后的G-四鏈體溶液.

1.3.5 UV-vis測定

以PBS緩沖液做參比溶液，在1 cm石英比色皿中加入一定濃度的退火后的G-四鏈體溶液，在波長190～350 nm之間以0.5 nm為間隔測定其吸光度.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 Nano DSC誤差校準(zhǔn)結(jié)果

在40～75℃溫區(qū)范圍內(nèi)校準(zhǔn)0.1 mol/L甘氨酸緩沖液熱流基線后，0.925 mg/mL溶菌酶的摩爾比熱隨溫度變化的曲線Cp,m-T如圖1所示.其中圓點(diǎn)、方塊與三角形分別代表了第一次、第二次與第三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.如圖1所示，溶菌酶的摩爾比熱隨著溫度升高呈現(xiàn)對稱的吸熱峰，在57℃左右有一個(gè)吸熱峰值，峰頂溫度即為熔融中點(diǎn)溫度Tm.

圖1 溶菌酶DSC熱譜圖

用Nano DSC標(biāo)準(zhǔn)積分軟件計(jì)算出的溶菌酶熔融中點(diǎn)溫度和融化焓列于表1.

表1 重復(fù)實(shí)驗(yàn)下溶菌酶的熔融中點(diǎn)溫度和融化焓

根據(jù)ASTM E 2603-08[11]，溶菌酶的熱力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)列于表2.且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出三次校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好.對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)值可以認(rèn)為誤差校準(zhǔn)后測量精度已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn).

表2 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)熱力學(xué)數(shù)據(jù)

2.2 ILPR G-四鏈體試驗(yàn)結(jié)果

圖2所示為ILPR G-四鏈體在40～110℃溫區(qū)范圍的DSC熱譜圖曲線.如圖所示，ILPR G-四鏈體的熔融轉(zhuǎn)變分別在67.63℃和96.2℃，這表明ILPR G-四鏈體的去折疊熔融過程不是一個(gè)簡單的兩態(tài)轉(zhuǎn)變過程.在低熔融溫度下，第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變?nèi)诔涕L且溫區(qū)跨度大.在高熔融溫度下，第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰形變窄，轉(zhuǎn)變迅速.

圖2 ILPR G-四鏈體DSC熱譜圖

已有研究從光譜的角度分析了ILPR G-四鏈體的構(gòu)象.Paramasivan S[12]和Kypr J[13]曾利用圓二色光譜法對G-四鏈體的特征結(jié)構(gòu)CD譜圖作出總結(jié)，研究認(rèn)為G-四鏈體的平行構(gòu)象在260～265 nm處出現(xiàn)正Cotton效應(yīng)、240 nm處出現(xiàn)負(fù)Cotton效應(yīng)；而反平行構(gòu)象則在295nm處出現(xiàn)正Cotton效應(yīng)、260 nm處出現(xiàn)Cotton效應(yīng).對ILPR G-四鏈體，Dhakal S[14]、Christine M[10]、Schonhoft J D[7]等人經(jīng)CD熔融實(shí)驗(yàn)表明該G-四鏈體在265、295 nm出現(xiàn)明顯正Cotton效應(yīng)，如圖3所示.這說明了ILPR G-四鏈體可能是平行構(gòu)象和反平行構(gòu)象的混合.

圖3 ILPR G-四鏈體 CD光譜圖

在本研究中，可以從比熱的角度分析G-四鏈體可能的結(jié)構(gòu)微觀變化.Liphardt J[15]研究表明，在反平行構(gòu)象中，G四分體之間鳥嘌呤G形成的環(huán)形相連的連續(xù)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，反平行構(gòu)象解鏈的破裂力高.在圖2中，在較低熔融溫度下，第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰值處比熱為0.465 J/mol·℃.在較高熔融溫度下，第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰值處比熱為6.054 J/mol·℃.這說明第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變吸熱更多，且需要在溫區(qū)跨度為86～105℃的較高溫度下進(jìn)行，相比較第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變處平緩的吸熱解鏈情況，推斷這是由于反平行構(gòu)象穩(wěn)定、解鏈所需能量大導(dǎo)致.高溫熔融源自于反平行構(gòu)象轉(zhuǎn)變，低溫熔融對應(yīng)平行構(gòu)象轉(zhuǎn)變.兩個(gè)熔融峰分離十分明顯，說明這兩種構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程可能是相對獨(dú)立的.

在圖4中，通過TA Analysis軟件模擬，基線校正后的G-四鏈體摩爾比熱隨溫度變化曲線的去卷積處理可以很好地把原始實(shí)驗(yàn)曲線處理成兩個(gè)分立組分的疊加，以此來分離這兩個(gè)相對獨(dú)立的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程.

圖4 DSC熱譜圖去卷積模擬

為了準(zhǔn)確表達(dá)比熱數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)變過程中的熔融焓，研究中采用了高斯函數(shù)對比熱實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合：

(1)

式(1)中的各擬合參數(shù)沒有物理意義，僅作比熱實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合.所有的擬合參數(shù)(A0、A1、A2、A3)和擬合數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均方根偏差(RMS)列于表3.

由此計(jì)算出來G-四鏈體熔融溫度和融化焓列于表4.

所有ILPR G-四鏈體在40～110℃的摩爾比熱實(shí)驗(yàn)值(以0.5℃為間隔)列于表5.

表3 比熱擬合系數(shù)

表4 ILPR G-四鏈體熔融溫度和融化焓

表5 ILPR G-四鏈體摩爾比熱

2.3 紫外可見吸收光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對ILPR序列，其摩爾吸光系數(shù)ε=283 900 L/(mol·cm)，分子量為8.911 8 kD.吸光度A在波長190～350 nm之間的變化曲線如圖5所示.在260 nm 處G-四鏈體溶液吸光度為4.068.由朗伯-比耳定律得：

A=εbc

其中,A為吸光度;ε為摩爾吸光系數(shù);b為液池厚度;c為溶液濃度.

圖5 ILPR G-四鏈體紫外可見吸收光譜圖

由此計(jì)算得退火后的G-四鏈體溶液濃度為14.33 μmol/L.

3 結(jié)論

通過Nano DSC法進(jìn)行ILPR序列退火處理，并通過紫外光譜測試得到退火后的ILPR G-四鏈體濃度.在3 atm壓力下，40～110℃溫區(qū)準(zhǔn)確測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的等壓比熱，并通過去卷積擬合數(shù)據(jù)分離兩個(gè)結(jié)構(gòu)的變化過程，分別得到熔融中點(diǎn)溫度為(67.63±0.16)℃和(96.2±0.01)℃；融化焓為(170.9±2.1)kJ/mol 主(392.0±1.6)kJ/mol.

[1]CHANTOT J F, GUSCHLBAUER W. Physicochemical properties of nucleosides 3. Gel formation by 8-bromoguanosine [J]. FEBS Lett.，1969,4(3): 173-176.

[2]ZHANG JING NAN, YU QIAN QIAN. A ruthenium(II) complex capable of inducing and stabilizing bcl-2 G-quadruplex formation as a potential cancer inhibitor [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2013,134:1- 11.

[3]VIRGILIO A, ESPOSITO V . Structural Investigations on the Anti-HIV G-Quadruplex-Forming Oligonucleotide TGGGAG and Its Analogues: Evidence for the Presence of an A-Tetrad [J]. Chem. Bio. Chem., 2012,13(15): 2219- 2224.

[4]PAULA J, DAMIAN Al. Discovery and Development of the G-Rich Oligonucleotide AS1411 as a Novel Treatment for Cancer [J]. Exp. Mol. Path., 2009,86(3): 151- 164.

[5]CONNOR A C, FREDERICK K A. Insulin Capature by an Insulin-Linked Polymorphic Region G-Quadruplex DNA Oligonucleotide[J]. J. Am. Chem. Soc., 2006,128(15): 4986- 4991.

[6]KENNEDY G C, GERMAN M S . The Minisatellite in the Diabetes Susceptibility Locus Iddm2 Regulates Insulin Transcription [J]. Nat. Genet., 1995,9(3): 293- 298.

[7]SCHONHOFT J D, DAS A. ILPR Repeats Adopt Diverse G-quadruplex Conformations That Determine Insulin Binding [J]. Biopolymers., 2010,93(1): 21- 31.

[8]GERASIMOV J Y, SCHAEFER C S, YANG W, et al. Development of an Electrochemical Insulin Sensor Based on the Insulin-Linked Polymorphic Region [J]. Biosens. Bioelectron., 2013,42: 62- 68.

[9]XIAO J, CARTER J A. A Genome-Inspired DNA Ligand for the Affinity Capture of Insulin and Insulin-Like Growth Factor-2[J]. J. Sep. Sci.,2009,32(10):1654- 1664.

[10]CHRISTINE M T, NICOLEL Ml. An Isothermal Titration and Differential Scanning Calorimetry Study of the G-Quadruplex DNA-Insulin Interaction[J]. J. Phys. Chem. B., 2014,118: 1784- 1790.

[11]美國材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會. ASTM Standards[EB/OL]. https://www.astm.org/DATABASE.CART/HISTORICAL/E2603- 08.htm.

[12]PARAMASIVAN S, RUJAN I, PHILIP H. Circular dichroism of quadruplex DNAs: Applications to structure, cation effects and ligand binding[J]. Methods.,2007,43: 324- 331.

[13]KYPR J, KEJNOVSKA I, RENCIUK D, et al. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA[J]. Nucleic Acids Res., 2009,37(6): 1713- 1725.

[14]DHAKAL S, SCHONHOFT J D. ILPR G-quadruplex Formed in Seconds Demonstrate High Mechanical Stabilities [J]. J. Am. Chem. Soc., 2009,131(5): 1876- 1882.

[15]LIPHARDT J, DUMONT S, SMITH S B, et al. Equilibrium Information from Nonequilibrium Measurements in an Experimental Test of Jarzynski′s Equality [J].Science,2002,296: 1832- 1835.