王傳旭，劉傳亮，史光軍

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3青島市立醫(yī)院)

肝癌是世界范圍內(nèi)第五大最常見(jiàn)惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)性死亡的第二大原因，并且其發(fā)病率持續(xù)升高。雖然在過(guò)去十幾年中，其治療水平有相當(dāng)大提高，但是肝癌患者的總生存期卻沒(méi)有明顯提高[1]。因此，探究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，尋找建立有效的監(jiān)控和治療靶點(diǎn)是現(xiàn)今最重要的研究方向。腫瘤生長(zhǎng)和癌癥侵襲普遍受表觀遺傳學(xué)方式的調(diào)控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA以及染色體結(jié)構(gòu)改變。異常的DNA甲基化被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及化療藥物的抵抗[2]。TET家族是一種甲基胞嘧啶加雙氧酶，其中包含TET1、TET2、TET3。TETs可以催化DNA的脫甲基化，主要通過(guò)催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)變成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)。其中，在癌癥進(jìn)展中TET1是最主要和研究最多的[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，TET1促進(jìn)基因重排相關(guān)的惡性腫瘤發(fā)生，如MLL型白血病[4]；在胃癌、肺癌中則發(fā)揮抑制腫瘤的作用[5]。2017年6月～2018年2月，本研究探討了TET1在肝癌中的表達(dá)變化以及在肝癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 組織:肝癌組織及癌旁組織(距離癌組織2 cm)標(biāo)本切片38例份由濰坊醫(yī)學(xué)院病理科提供。其中，患者男33例、女5例，年齡44～59歲、平均49.2歲，術(shù)前均未行放化療及靶向藥物治療。細(xì)胞:人肝癌HepG2細(xì)胞株由青島市立醫(yī)院肝膽胰細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、PBS購(gòu)自Gibico公司；TET1抗體、GAPDH抗體、HRP二抗購(gòu)自Sigma公司；SDS-凝膠配制試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和PVDF膜購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DoJINDO公司；TET1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)空載質(zhì)粒購(gòu)自南通思特康生物科技有限公司。

1.2 肝癌組織及癌旁組織中TET1蛋白表達(dá)的檢測(cè) ①采用免疫組化SP法。組織脫蠟后遞減濃度乙醇復(fù)水，PBS洗片，30%過(guò)氧化氫溶液孵片10 min，蒸餾水洗3次，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗片，羊血清室溫封閉30 min，TET1抗體(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗片后加入二抗，20 ℃、20 min，PBS洗片，DAB顯色，蘇木精復(fù)燃，脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。TET1蛋白在組織中主要表達(dá)在細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒。使用Remmele等提出的免疫反應(yīng)積分評(píng)分法對(duì)染色后的切片進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色深度計(jì)分，每例隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性率，取平均數(shù)，并按下列計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。著色深度：陰性結(jié)果0分，淡黃色染色1分，淡棕色染色2分，棕色染色3分。取兩者乘積作為總分進(jìn)行分析，≥1為陽(yáng)性，<1為陰性。②采用蛋白質(zhì)印跡法：取低溫保存的肝癌及癌旁組織30 mg，用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣品(40 μg)進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄去封閉液，分別加入用5% BSA的PBS稀釋的一抗(TET1 1∶200；β-actin 1∶2 000)，4 ℃搖床過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，TBST洗滌，用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)室溫孵2 h，TBST充分洗滌后，電化學(xué)發(fā)光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，將TET1條帶與作為內(nèi)參的β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 肝癌及癌旁組織中TET1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-PCR法。取低溫保存的肝癌及癌旁組織100 mg置于1.5 mL的去RNA酶EP管中，加入檢測(cè)TRIzol 1 mL。按照TRIzol試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用紫外分光光度儀對(duì)提取的總RNA計(jì)算純度和濃度后，將提取的RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理，反應(yīng)體系為：總RNA 400 ng、 PrimeScript RT Master Mix 2 μL及RNase Free dH2O共10 μL，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR引物由北京賽百勝基因技術(shù)有限公司合成，以GAPDH為內(nèi)參照，定量PCR擴(kuò)增在羅氏定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)完成后計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出cDNA模板的擴(kuò)增曲線(xiàn)及循環(huán)閾值(Ct值)，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。TET1 mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)均采用GAPDH作為內(nèi)參基因，來(lái)校正被測(cè)樣品中mRNA水平，用TET1 mRNA與各自的GAPDH的差值來(lái)表明樣本中目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素)培養(yǎng)，于含5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，1%胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前接種于6孔板預(yù)先培養(yǎng)24 h，分別加入TET1基因過(guò)表達(dá)重組慢病毒顆粒和空載體對(duì)照慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 h后更換完全培養(yǎng)液，24 h后換液，轉(zhuǎn)染后72 h開(kāi)始添加2 μg/mL嘌呤毒素，通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選1周。成功構(gòu)建的TET1過(guò)表達(dá)(過(guò)表達(dá)組)及空載體HepG2細(xì)胞(對(duì)照組)凍存于液氮中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞后對(duì)TET1表達(dá)情況進(jìn)行重新鑒定。

1.5 HepG2細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。取兩組細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，分別制成1.5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞懸液100 μL，鋪六孔板。培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔的OD值，每組去掉最大值和最小值，取平均值。

1.6 HepG2細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕試驗(yàn)。在六孔板底面預(yù)先繪制數(shù)條參考線(xiàn)，用于定位劃痕位置。將兩組細(xì)胞(5×105/孔)分別接種在6孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，使用200 μL槍頭進(jìn)行劃痕處理，PBS洗滌2次，將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用裝有數(shù)碼相機(jī)(德國(guó)Zeiss公司)的倒置顯微鏡，觀察并拍攝0 h及24 h劃痕照片，使用Image Pro Plus6.0軟件讀取劃痕面積，平均相對(duì)遷移距離=0 h劃痕面積/高度-24 h劃痕面積/高度，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中TET1的表達(dá)比較 38例肝癌組織中TET1陽(yáng)性表達(dá)9例(23.7%)，癌旁組織中TET1陽(yáng)性表達(dá)27例(71.1%)，兩者TET1陽(yáng)性表達(dá)率比較，χ2=17.100，P<0.01。肝癌組織和癌旁組織中TET1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.46±0.09、1.15±0.13,兩者比較，P<0.05。RT-PCR結(jié)果顯示，以TET1 mRNA在癌旁組織中表達(dá)量平均值為1，肝癌組織為0.43±0.07,兩者比較，P<0.05。

2.2 兩組增殖能力比較 培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h，過(guò)表達(dá)組OD值分別為0.212±0.004、0.228±0.005、0.301±0.007、0.393±0.006、0.432±0.007、0.582±0.012；對(duì)照組分別為0.211±0.002、0.246±0.003、0.347±0.006、0.541±0.008、0.685±0.007、0.897±0.009。在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h時(shí)過(guò)表達(dá)組的OD值均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 兩組遷移能力比較 過(guò)表達(dá)組相對(duì)遷移距離為(0.47±0.007)μm，劃痕愈合率為(14.38±1.67)%；對(duì)照組相對(duì)遷移距離為(0.94±0.08)μm，劃痕愈合率為(28.15±2.61)%。與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組的相對(duì)遷移距離短和劃痕愈合率低(P均<0.05)。

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，DNA甲基化狀態(tài)的異常與腫瘤的進(jìn)展和癌癥患者的預(yù)后有密切關(guān)系。已有研究證實(shí)，DNA甲基化廣泛參與肝癌的發(fā)病過(guò)程[6]。胞嘧啶甲基化會(huì)導(dǎo)致腫瘤抑制基因的沉默從而導(dǎo)致癌癥形成。而DNA脫甲基化酶又會(huì)抵消這種致癌基因的作用。TET家族蛋白可以通過(guò)催化DNA的5-mC轉(zhuǎn)化成5-hmC而促進(jìn)DNA的脫甲基化[7]。根據(jù)一個(gè)對(duì)887例腺癌的Meta分析得出TET1 mRNA水平在腫瘤的第一階段會(huì)下調(diào)[8]。另外，有研究證實(shí)TET1蛋白在前列腺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)也會(huì)下調(diào)[9]，因此在本研究中，我們首先通過(guò)免疫組化法、蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn)了肝癌組織和癌旁正常組織中TET1蛋白及mRNA表達(dá)的差異，結(jié)果顯示TET1在肝癌組織中的表達(dá)降低，說(shuō)明TET1可能參與了抑制肝癌的發(fā)生。

細(xì)胞侵襲是原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移啟動(dòng)的關(guān)鍵步驟，因此腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力直接代表了癌癥的惡性程度。已有研究顯示，TET1在胃癌、卵巢癌和乳腺癌發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的作用[7]。因此，我們采用構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞中，驗(yàn)證TET1的過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響，結(jié)果提示TET1過(guò)表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是一種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族蛋白及其內(nèi)生性的調(diào)控因子，它在細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10,11]。例如，MMP2和MMP9會(huì)通過(guò)損壞細(xì)胞基底膜和降解Ⅳ型膠原蛋白和層黏連蛋白而促進(jìn)細(xì)胞侵襲。雖然機(jī)制不清，但TIMP蛋白可通過(guò)結(jié)合MMPs的活性位點(diǎn)或降低MMPs活酶而抑制MMPs的活性[12]。TIMP基因已被證實(shí)受DNA甲基化的調(diào)控，且已有研究證實(shí)在某些腫瘤細(xì)胞中，TIMP正是TET1發(fā)揮抑制腫瘤作用的下游調(diào)控因子[13]。因此，TIMPs可以作為我們進(jìn)一步研究TET1抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號(hào)通路的一個(gè)較好目標(biāo)。

綜上所述，TET1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)，并且其基因的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性和遷移能力。說(shuō)明TET1密切參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，因此，TET1可作為治療肝癌的一個(gè)靶向基因。

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