食源性細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

張可欣

李忠海1, 2

任佳麗1, 2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.稻谷及副產(chǎn)品深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

隨著臨床、畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素的濫用，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)峻[1]。這些食源性耐藥細(xì)菌有可能通過(guò)食物鏈將耐藥性基因傳遞給人類，從而引起人類的感染。中國(guó)動(dòng)物性食品源細(xì)菌耐藥情況已很嚴(yán)重[2-4]。在中國(guó)，每年因食源性細(xì)菌感染發(fā)病人數(shù)可達(dá)9 411.7 萬(wàn)人次，病死人數(shù)8 564人，病死率0.009 1%[5]。為了從源頭阻止污染耐藥性細(xì)菌的食品流入市場(chǎng)，感染人類，快速測(cè)定食源性細(xì)菌的耐藥性顯得尤為重要。目前常用的藥敏試驗(yàn)方法有擴(kuò)散法和微量法等，但傳統(tǒng)方法得到準(zhǔn)確報(bào)告所需的時(shí)間太長(zhǎng)，隨著分子生物學(xué)和電化學(xué)技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展，一些新型的快速藥敏試驗(yàn)方法得到了發(fā)展。本文擬對(duì)目前常用的藥敏試驗(yàn)方法和快速藥敏試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法

1.1 擴(kuò)散法

擴(kuò)散法是利用待測(cè)藥物在含菌平板上球形擴(kuò)散的原理，離紙片(牛津杯或者孔)越近，抗生素濃度越高，越遠(yuǎn)抗生素濃度越低，隨著抗生素濃度的降低，有一條最低抑菌濃度帶，過(guò)夜培養(yǎng)后細(xì)菌不能生長(zhǎng)，形成抑菌圈。紙片擴(kuò)散法是通過(guò)測(cè)量抑菌圈的大小并根據(jù)CLSI(Clinical and laboratory standards institute)制定的“抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)”來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)該種抗生素的敏感程度。擴(kuò)散法包括紙片法、牛津杯法和打孔法[6]。由于牛津杯法和打孔法的操作性和穩(wěn)定性較差，且難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，所以目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和臨床藥敏試驗(yàn)都采用紙片擴(kuò)散法來(lái)獲得定性的結(jié)果。梁麗紅等[7]使用紙片擴(kuò)散法調(diào)查食用鹵制品中倫敦沙門菌的藥敏；王萍等[8]使用紙片擴(kuò)散法了解急性腹瀉患者副溶血性弧菌的耐藥情況。開發(fā)新的藥敏試驗(yàn)方法中，也常與紙片擴(kuò)散法的結(jié)果作對(duì)照，來(lái)保證新方法的準(zhǔn)確有效性，如廖詩(shī)英等[9]在研究雞大腸桿菌TTC快速藥敏試驗(yàn)方法過(guò)程中，選用紙片擴(kuò)散法作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照方法。

這種方法具有操作簡(jiǎn)便，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但至少需要16～18 h的培養(yǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，且因?yàn)樵囼?yàn)結(jié)果容易受到諸多因素，例如pH、平板厚度等的影響，所以必須嚴(yán)格按照CLSI的操作章程試驗(yàn)，同時(shí)使用質(zhì)控菌株進(jìn)行平行試驗(yàn)。

1.2 稀釋法

稀釋法判斷細(xì)菌藥物敏感性的原理是根據(jù)細(xì)菌在一系列含有二倍稀釋濃度抗生素的培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)情況，肉眼觀察無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)器中所含藥物的最低濃度就是最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。MIC值越小，說(shuō)明細(xì)菌對(duì)該種抗生素越敏感。根據(jù)培養(yǎng)物的不同分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，根據(jù)培養(yǎng)物量的不同，又分為常量法和微量法[10]。稀釋法可以得到對(duì)臨床用藥有指導(dǎo)意義的MIC值，可以在定性的同時(shí)又定量。李月婷等[11]使用微量肉湯稀釋法對(duì)食源性沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明27株受試沙門菌全部對(duì)頭孢西丁敏感；肖丹等[12]和李順姬等[13]使用微量肉湯稀釋法分別研究了沙門氏菌和致瀉大腸桿菌的耐藥性，結(jié)果表明66株沙門菌和41株致瀉大腸桿菌對(duì)測(cè)試的8種抗生素均有不同程度的耐藥，MIC值為4～608 μg/mL 不等。

稀釋法可以同時(shí)試驗(yàn)多種菌，對(duì)抗生素的選擇也比較自由，是臨床中常用的藥敏試驗(yàn)方法，但該方法同紙片擴(kuò)散法一樣，也需要將試驗(yàn)菌和質(zhì)控菌進(jìn)行平行試驗(yàn)，當(dāng)質(zhì)控菌的結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)菌的結(jié)果才可靠，且該方法至少需要16～20 h才能得到結(jié)果，且MIC值的準(zhǔn)確判斷對(duì)操作人員的要求較高。

1.3 Etest法

Etest法是濃度梯度瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，既結(jié)合了擴(kuò)散法和稀釋法的特點(diǎn)和原理，又彌補(bǔ)了二者的不足[14]。E試條一面固定有不同濃度的藥物，另一面標(biāo)有藥物濃度的刻度，將E試條含有藥物的一面置于含菌平板上過(guò)夜培養(yǎng)后，在試條周圍可見(jiàn)明顯的橢圓抑菌圈，通過(guò)讀取圈邊緣與E試條相交的刻度可以得到抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度。沈赟等[15]同時(shí)使用微量肉湯稀釋法和Etest法判斷食源致病菌的MIC值，結(jié)果表明2種方法重復(fù)性好；秦思等[16]使用Etest法對(duì)江蘇地區(qū)食源性致病菌進(jìn)行耐藥分析，結(jié)果表明63株金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素耐藥率最高，為33.3%，多重耐藥率為3.2%；Cantón等[17]同時(shí)使用微量肉湯稀釋法和Etest 法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明2種方法具有良好的重復(fù)性。

Etest法繼承了紙片擴(kuò)散法優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也具有定量的優(yōu)點(diǎn)，與微量肉湯法相比，MIC值易判讀。以上3種傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法都是基于細(xì)菌生長(zhǎng)的原理，需過(guò)夜培養(yǎng)，獲得試驗(yàn)結(jié)果所需時(shí)間較長(zhǎng)。

2 快速藥敏檢測(cè)系統(tǒng)

目前有3種常用的藥敏自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，分別是德國(guó)西門子的MicroScan WalkAway系統(tǒng)、法國(guó)梅里埃的Vitek系統(tǒng)和美國(guó)BD公司的Phoenix系列自動(dòng)化儀器[18]。3種檢測(cè)系統(tǒng)都是基于微量肉湯稀釋法的原理，集成了標(biāo)準(zhǔn)濃度細(xì)菌懸液的配制、接種、培養(yǎng)、菌株生長(zhǎng)情況測(cè)定及報(bào)告MIC值5個(gè)步驟于一體，具有快速、便攜的優(yōu)點(diǎn)[6]。

孫宏莉等[19]調(diào)查中國(guó)425所使用Vitek-2藥敏檢測(cè)系統(tǒng)的醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試準(zhǔn)確率，結(jié)果表明中國(guó)Vitek-2細(xì)菌藥敏檢測(cè)系統(tǒng)中氨芐西林/舒巴坦、頭孢替坦、頭孢曲松、美羅培南和頭孢吡肟的藥敏檢測(cè)結(jié)果一致性和準(zhǔn)確性較低，其他抗菌藥物的藥敏結(jié)果均具有很好的一致性和較高的準(zhǔn)確性；魏丹丹等[20]將臨床分離的可疑耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)124株隨機(jī)分別用Vitek-2 COMPACT和MicroScan WalkAway 40 SI全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏分析，同時(shí)用PCR方法對(duì)照，評(píng)價(jià)2臺(tái)細(xì)菌分析儀檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的靈敏度、特異度和符合率，結(jié)果表明2臺(tái)全自動(dòng)微生物分析儀與PCR方法檢測(cè)得到的結(jié)果一致；Erika等[21]用MicroScan方法測(cè)定了柬埔寨人血液中沙門氏菌對(duì)阿奇霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性。

藥敏自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是在藥敏結(jié)果的數(shù)據(jù)報(bào)告、分析及傳遞方面的便捷性及準(zhǔn)確性，減少了人力，缺點(diǎn)是儀器體積龐大不便攜，且購(gòu)買儀器所需的費(fèi)用昂貴，加上維修成本高導(dǎo)致使用成本高。

3 輔以顯色劑的藥敏試驗(yàn)方法

具有代謝活性的細(xì)菌能產(chǎn)生ATP、水解酶以及氧化還原酶，創(chuàng)造出利于還原的環(huán)境，能夠直接或者間接地還原顯色劑，顯色劑顏色或者熒光的改變代表了細(xì)菌的活性[22]。細(xì)菌與抗生素以及反映代謝活性的顯色劑(如亞甲基藍(lán)和刃天青)一同培養(yǎng)，耐藥細(xì)菌會(huì)持續(xù)繁殖、代謝顯色劑導(dǎo)致顏色變化，而敏感細(xì)菌則不會(huì)，以此來(lái)判斷細(xì)菌的藥物敏感性。林麗英等[23]研究亞甲基藍(lán)還原法測(cè)定結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性，并將結(jié)果與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法進(jìn)行比較，2種方法測(cè)得MIC值的相同率較高；孫懷昌等[24-26]研制出一種以刃天青為指示劑的微量板，能夠快速診斷奶牛乳腺炎葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)，在12 h內(nèi)獲得與紙片擴(kuò)散法一致的藥敏試驗(yàn)結(jié)果；Deiss等[27]研制出一種以刃天青為指示劑的便攜式大腸桿菌藥敏試驗(yàn)紙板，具有與紙片擴(kuò)散法類似的性能、重復(fù)性和預(yù)測(cè)性；Kadlec等[28]基于手機(jī)攝像頭將其改造成微光度計(jì)，研制出一種以水溶性四唑鹽(WST-8)為指示劑的快速便攜藥敏試驗(yàn)方法，通過(guò)調(diào)整細(xì)菌與WST-8的作用時(shí)間可以直接測(cè)定初始濃度101～106CFU/mL 的細(xì)菌，省略了菌液的前處理步驟，將抗生素預(yù)涂于容器表面，也解決了有限資源下快速藥敏試驗(yàn)的問(wèn)題。

這種基于指示劑顏色變化來(lái)判斷細(xì)菌藥物敏感性的方法不僅可以肉眼觀察進(jìn)行定性檢測(cè)，也可以使用分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，具有直觀，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，可以縮短藥敏試驗(yàn)的時(shí)間，但人工肉眼判別具有一定的主觀性，而分光光度計(jì)又不便于攜帶。

4 電化學(xué)方法

近年來(lái)，在細(xì)菌的電化學(xué)超靈敏檢測(cè)中已有了最新進(jìn)展[29-31]，但只有學(xué)者研究抗生素敏感性的直接電化學(xué)檢測(cè)。電化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)菌藥物敏感性的原理是：細(xì)菌的呼吸作用主要依靠呼吸鏈的電子傳遞，巧妙引入氧化還原探針介入細(xì)菌呼吸鏈，呼吸鏈活動(dòng)產(chǎn)生的電化學(xué)變化可以用電化學(xué)的方法快速而可靠地檢測(cè)到。

國(guó)外已有此類研究。Ertl等[32-33]利用鐵氰化鉀作為氧化還原探針，將大腸桿菌與抗生素作用15 min后，與鐵氰化鉀的溶液混合，用計(jì)時(shí)電量法測(cè)定電信號(hào)，結(jié)果與傳統(tǒng)紙片擴(kuò)散法完全一致，這種方法能在少于25 min的時(shí)間內(nèi)提供報(bào)告，但用電化學(xué)方法測(cè)得的IC50值比標(biāo)準(zhǔn)濁度法得到的結(jié)果要高100倍，且試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)電極對(duì)抗生素有吸附作用，影響試驗(yàn)結(jié)果；Chotinantakul等[34]在Ertl等的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了試驗(yàn)方案：大腸桿菌與細(xì)菌作用后離心除去抗生素，之后重懸于含有鐵氰化鉀的測(cè)試液中，該方法能在3～6 h給出藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

以上的研究均基于大電極系統(tǒng)，隨著微機(jī)加工技術(shù)的發(fā)展，電極尺寸可微縮至微米乃至納米級(jí)別，為便攜式耐藥細(xì)菌快速檢測(cè)系統(tǒng)的研制提供了技術(shù)支撐。Besant等[22]將菌液體積限制在2.75 nL的容器中，通過(guò)使用電化學(xué)檢測(cè)刃天青的還原來(lái)檢測(cè)細(xì)菌代謝活性，提出了一種快速電化學(xué)藥敏試驗(yàn)方法能夠在1 h內(nèi)報(bào)告細(xì)菌的藥物敏感性；Choi等[35]使用了一種微流體瓊脂糖系統(tǒng)(MAC)，通過(guò)瓊脂糖固定單個(gè)細(xì)胞后，使用顯微鏡觀察在不同抗生素存在時(shí)的生長(zhǎng)情況，只需3～4 h就能給出與CLSI相匹配的MIC值。中國(guó)的何佳芮[36]研究構(gòu)建了一種集細(xì)菌快速檢測(cè)和快速藥敏分析為一體的微流控芯片，能夠在30 min內(nèi)完成對(duì)1 μL樣本中E.coliO157：H7的檢測(cè)，檢測(cè)限為101～105CFU/μL，并在4～8 h 完成對(duì)不同濃度下，3種抗生素的藥敏試驗(yàn)。

電化學(xué)方法具有快速、靈敏、低能耗和低成本的優(yōu)點(diǎn)，在開發(fā)快速便攜的藥敏試驗(yàn)方法方面具有廣闊前景。

5 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)包括PCR技術(shù)、基因芯片法、全基因組測(cè)序等[37]。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，主要是從基因?qū)用鎸?duì)耐藥基因進(jìn)行的檢測(cè)。

5.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)包括普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)[38]，可以用于鑒定和定量分析臨床標(biāo)本中的病原菌，以及檢測(cè)病原菌中的耐藥基因，具有靈活、快速的優(yōu)點(diǎn)[39]。目前，已經(jīng)可以通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)mecA和(或)mecC基因來(lái)鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[40]；還有人[41-42]運(yùn)用PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)與萬(wàn)古霉素耐藥基因相關(guān)的vanA和vanB基因來(lái)快速檢測(cè)腸球菌的耐藥性。李堅(jiān)等[43]設(shè)計(jì)并合成熒光定量PCR引物，繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，以熒光定量PCR方法測(cè)定細(xì)菌在抗生素作用下生長(zhǎng)不同時(shí)間基因組DNA含量，并與紙片(K-B)法進(jìn)行比較，建立了葡萄球菌快速藥敏試驗(yàn)方法，結(jié)果與紙片擴(kuò)散法一致。

5.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序法，即未知序列通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，具有快速、特異、高通量的特點(diǎn)，運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌耐藥性，可以在1個(gè)工作日內(nèi)提供報(bào)告[37-38]。歐維正等[44]通過(guò)比較基因芯片法和比例法在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的藥物敏感性試驗(yàn)中的符合率，發(fā)現(xiàn)基因芯片較比例法有更高的敏感性和特異性，對(duì)多重耐藥性結(jié)核桿菌的快速診斷具有重要臨床價(jià)值；Naas等[45-46]的研究表明，在最新的升級(jí)版芯片中可一次性檢測(cè)3種超廣譜β內(nèi)酰胺類耐藥基因，6種質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素類耐藥基因和5種碳青霉烯類耐藥基因，經(jīng)臨床菌株驗(yàn)證顯示，敏感性和特異性均為100%。

5.3 全基因組測(cè)序

全基因組測(cè)序可以得到樣品的完整序列，可獲得大量信息。朱健銘等[47]運(yùn)用全基因測(cè)序法分析肺炎克雷伯菌JM45株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥基因；王登峰[48]基于Hiseq 2000和PacBio SMRT技術(shù)的測(cè)序數(shù)據(jù)，使用de novo拼接方法獲得多重耐藥MRSA菌株Z35和Z43的全基因組序列并進(jìn)行SCCmec特征分析，結(jié)果顯示Z35為ST9-SCCmec Ⅶ，攜帶重組酶基因復(fù)合體ccrC2；Z43為ST97-SCCmec Ⅳ，含有多種耐藥基因。

分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法不同，傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法是對(duì)菌株耐藥表型的檢測(cè)，而分子生物學(xué)方法是基因?qū)用鎸?duì)耐藥基因進(jìn)行的檢測(cè)[6]。PCR技術(shù)檢測(cè)耐藥基因具有快速靈敏度高的特點(diǎn)，但一次檢測(cè)的耐藥基因有限，且容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；基因芯片法能一次檢測(cè)多種耐藥基因，具有快速、靈敏度高和特異性高的特點(diǎn)，但在檢測(cè)新的或不典型的耐藥基因時(shí)具有局限性，且價(jià)格昂貴；全基因組測(cè)序能夠發(fā)現(xiàn)盡可能多的耐藥機(jī)制，是細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的重要手段，但不適合臨床和耐藥性檢測(cè)、監(jiān)測(cè)中的推廣應(yīng)用[49]。以上3種分子生物學(xué)方法都不能對(duì)臨床治療提供有指導(dǎo)意義的MIC值[37]。

6 展望

以快速、靈敏和便攜的耐藥細(xì)菌鑒定技術(shù)可有效避免污染食品的進(jìn)一步流通，是研究的方向和熱點(diǎn)。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有完善的標(biāo)準(zhǔn)體系，但所需時(shí)間長(zhǎng)(通常24～48 h)；快速藥敏檢測(cè)系統(tǒng)減少了人工操作，但儀器龐大且成本較高，難以做到便攜；分子生物學(xué)技術(shù)具有高通量、快速和特異性高的特點(diǎn)，但在檢測(cè)新的和不典型耐藥基因時(shí)具有局限性；基于電化學(xué)方法的微流控技術(shù)具有快速、靈敏、微型的特點(diǎn)，如能突破穩(wěn)定性和可回復(fù)性因素的影響，將是未來(lái)生物檢驗(yàn)發(fā)展的方向。

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