鴿糞中酵母菌分離與鑒定

馬玉英 安堯汶 何嚴(yán)峰

（1，新疆石河子工程技術(shù)學(xué)校 832000；2，新疆霍城縣三宮鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站 835200；3，新疆塔城市畜牧獸醫(yī)站 830049）

酵母菌細(xì)胞一般成圓形、卵圓形、圓柱形或檸檬形，每種酵母細(xì)胞有其一定的形態(tài)大小。大多數(shù)酵母菌在平板培養(yǎng)基上形成的菌落較大而厚，濕潤、較光滑，顏色較單調(diào) （多為乳白色，少有紅色，偶有黑色）。紅酵母屬細(xì)胞圓形、卵形或長形，多邊芽殖，少數(shù)形成假菌絲。無發(fā)酵能力，但能同化某些糖類，常污染食品，少數(shù)為致病菌。代表種為黏紅酵母。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自石河子南山石場鎮(zhèn)和農(nóng)八師132團(tuán)場私人養(yǎng)殖鴿子的新鮮鴿糞，共收集6份樣品，石河子南山石場鎮(zhèn)和農(nóng)八師132團(tuán)各3份，上述樣品采集放入無菌三角瓶后，置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

沙堡氏培養(yǎng)基，咖啡酸培養(yǎng)基，尿素酶瓊脂斜面，無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑

0.4﹪的酚紅溶液，20﹪尿素溶液，Tween-80溶液，1.6%溴甲酚酒精溶液，山羊血清。

1.1.4 主要儀器

光學(xué)顯微鏡，電子天平，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

（1）將采集的標(biāo)本每份取1.0g左右放入高壓過的小瓶中，加入10ml無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后，靜置15min使之，吸取0.5ml上清液接種于沙堡氏培養(yǎng)基 （加有氯霉素）和咖啡酸培養(yǎng)基 （加有氯霉素）置于37℃溫箱中培養(yǎng)3d，挑取疑似酵母菌的菌落，革蘭氏染色后鏡檢，確認(rèn)為真菌后接種到沙堡氏培養(yǎng)基 （加有氯霉素），純化2～3次接種到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培養(yǎng)3d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）將采集的標(biāo)本每份取1.0g左右放入高壓過的三角瓶中，加入20ml普通肉湯 （加有氯霉素）后置于37℃溫箱中培養(yǎng)3d，革藍(lán)氏染色后做顯微鏡檢查，確認(rèn)為真菌后接種到沙堡氏培養(yǎng)基 （加有氯霉素），純化2～3次接種到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培養(yǎng)3d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酵母菌的鑒定

1.2.2.1 酵母菌形態(tài)學(xué)的鑒定

（1）菌落特征的觀察

將被檢菌在沙堡氏培養(yǎng)基 （加有氯霉素）上37℃培養(yǎng)1～3d，選擇單個(gè)典型菌落起顏色、形狀、透明度、光滑度、濕潤度和邊緣整齊情況等特征。

（2）細(xì)胞形態(tài)的觀察

將被檢菌在沙堡氏培養(yǎng)基 （加有氯霉素）上37℃培養(yǎng)1～3d，逐日選擇單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色后顯微鏡檢查，連續(xù)7d。

（3）微培養(yǎng)的觀察

有小培養(yǎng)法將被檢菌接種到玻片上，逐日在顯微鏡下觀察被檢菌的生長、菌絲、孢子情況。

1.2.2.2 酵母菌特性培養(yǎng)的鑒定

（1）最適生長溫度的試驗(yàn)

將接種好的沙堡氏斜面 （加有氯霉素）分別放入不同溫度的條件下培養(yǎng)，觀察其生長過程有何不同。

（2）尿素酶試驗(yàn)

將被檢菌生長旺盛時(shí)接種到尿素酶斜面上，放入37℃溫箱中培養(yǎng)1～7d，逐日觀察尿素酶斜面有無顏色變化，若斜面由淡紅色變?yōu)樽霞t色為陽性，不變色則為陰性。

（3）咖啡酸試驗(yàn)

將被檢菌生長旺盛時(shí)接種到咖啡酸培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱中培養(yǎng)1～7d，逐日觀察咖啡酸培養(yǎng)基有無顏色變化，若培養(yǎng)基變?yōu)樽睾稚珵殛栃?，不變色則為陰性。

1.2.2.3 酵母菌的生化鑒定

（1）發(fā)酵試驗(yàn)

將被檢菌生長旺盛的時(shí)候分別接種到蔗糖、麥芽糖、乳糖與葡萄糖培養(yǎng)基中，放入37℃溫箱中培養(yǎng)1～7d，逐日觀察糖培養(yǎng)基有無顏色變化和氣泡產(chǎn)生，培養(yǎng)基不變色，不產(chǎn)生氣泡為陰性，有顏色變化，產(chǎn)生氣泡或兩種情況同時(shí)存在則為陽性。

（2）同化試驗(yàn)

先制作無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將被檢菌混入無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中傾倒平板。凝固后貼附含糖 （15﹪的糖水）濾紙片。陽性在紙片周圍有一圈明顯的生長圈，無生長圈則為陰性。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

將培養(yǎng)好被檢菌懸液 （9億菌），用無菌針管各吸取1ml分別注入6只健康的小白鼠腹腔內(nèi)并做一陰性對照，在隨后的一個(gè)月內(nèi)觀察小白鼠變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿糞中酵母菌的分離

通過培養(yǎng)、純化與鏡檢，6份樣品均分離出疑似酵母菌。

2.2 菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)

從6份鴿糞樣品中分離的酵母菌，觀察菌落形態(tài) (酵母型菌落)、細(xì)胞形態(tài)及小培養(yǎng)觀察結(jié)果見表1、表2。

2.3 特性培養(yǎng)鑒定與生化鑒定

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被檢菌在25～28℃為最適生長溫度，在該溫度范圍內(nèi)，被檢菌生長最快。其他培養(yǎng)特性鑒定和生化鑒定結(jié)果見表3。因6份樣品中分離出來的疑似酵母菌在培養(yǎng)特性鑒定與生化鑒定結(jié)果相同，故不作單個(gè)介紹。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

從小白鼠人工感染被檢菌以后，通過近兩個(gè)月的連續(xù)觀察，除一只小白鼠意外死亡外，其余6只小白鼠一直保持健康狀態(tài)，無任何疾病癥狀，從而說明該酵母菌無致病性。

3 討論

3.1 酵母菌的分離純化

菌種分離提純應(yīng)盡可能做到全面、細(xì)致、不丟、不重，在試驗(yàn)過程中對樣品進(jìn)行2～3次分離。分離培養(yǎng)的溫度為37℃，雖然適合大多數(shù)酵母菌生長，但通過這次試驗(yàn)獲知大多數(shù)酵母菌的最適生長溫度在25～30℃左右，沙堡氏培養(yǎng)基上生長良好。

3.2 酵母菌屬的鑒定

表1 菌落形態(tài)

表2 細(xì)胞形態(tài)和小培養(yǎng)鑒定結(jié)果

表3 培養(yǎng)特性鑒定與生化鑒定結(jié)果

根據(jù) 《酵母菌特性及鑒定手冊》和 《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》等介紹的方法，酵母菌的鑒定主要以形態(tài)學(xué)特征為主并結(jié)合生理學(xué)特征。形態(tài)學(xué)特征包括菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、假菌絲、子囊孢子等，生理學(xué)特征包括芽管試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵、同化試驗(yàn)等。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，酸鴿糞中的酵母菌形態(tài)相似，種類不多，從6份樣品中分離得到酵母菌經(jīng)屬的鑒定為同一屬酵母菌：紅色酵母屬。