周瑋婧，何平，王澍，侯靖

（武漢食品化妝品檢驗所，武漢430000）

0　引言

肌醇是一種飽和環(huán)狀多元醇，是作為生物體內(nèi)的一種必需的營養(yǎng)因子，肌醇具有免疫、預(yù)防和治療某些疾病等多種作用[2]，在很多的保健食品及一些嬰幼兒食品中均有添加[2]。氣相色譜法是我國檢測肌醇的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法[3-4]。本實驗根據(jù)國標(biāo)《GB 5413.25-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定》[5]方法檢測，增加山梨醇為內(nèi)標(biāo)，方法簡單、準(zhǔn)確、精密度高。奶粉在存放過程中容易發(fā)生結(jié)塊、潮解、脂肪氧化、等反應(yīng)，。目前研究多集中于分析嬰幼兒奶粉密封儲藏過程中物質(zhì)的變化，而對開封存放中品質(zhì)變化研究較少[6]。本文采用了優(yōu)化后的毛細(xì)管氣相色譜-內(nèi)標(biāo)法，跟蹤測定180天內(nèi)開封后奶粉中肌醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，為實際食用過程中分析環(huán)境對營養(yǎng)物質(zhì)的作用，提供理論基礎(chǔ)。

1　實驗

1.1　儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀：配備毛細(xì)管柱分流/不分流進(jìn)樣系統(tǒng)、FID檢測器；HP-5毛細(xì)管色譜柱（0.32μm，0.25 mm，30 m）；Vortex Gen le2旋渦混和器；Gilson精密移液槍；Beckm an高速離心機；M ettler-Toldeo XP205電子天平；Prim a超聲波清洗器；新苗HH-S21恒溫?zé)崴″仯籅UCH I旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和帶有螺紋蓋的25mL試管等實驗室常用儀器設(shè)備。

1.2　試劑

正己烷（色譜純），無水乙醇（分析純），三甲基氯硅烷（分析純）、六甲基二硅胺烷（分析純），N，N-二甲基甲酰胺（分析純）。硅烷化試劑：分別吸取體積比為1∶2∶8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲酰胺，超聲混勻；肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.2%）。

1.3　色譜條件

載氣：氮氣（99.999%）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；檢測器溫度：300℃，不分流；氫氣：45 mL/min；空氣：450 mL/min；進(jìn)樣體積：1μL。柱溫箱程序升溫：初始溫度120℃，保持0 min，升溫速率10℃/min，到190℃，保持18 min，升溫速率10℃/min，到240℃，保持30 min。以保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4　樣品處理

1.4.1試樣處理

奶粉樣品：稱取樣品1 g（精確到0.0001 g）于50 mL容量瓶中，加入12 mL約40℃溫水溶解試樣，加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL。超聲提取10 min，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容至刻度，混勻。靜置20min，取10mL于15mL離心管中，5 000 r/min離心5min，取5mL于濃縮瓶中。

1.4.2干燥與衍生

向濃縮瓶中加入10 mL無水乙醇，在80℃下濃縮近干時再加入5 mL無水乙醇繼續(xù)濃縮至徹底干燥。加入硅烷化試劑10 mL，超聲溶解后轉(zhuǎn)移到25 mL有螺紋蓋的試管中，在80℃水浴中衍生反應(yīng)75 min。取出冷卻至室溫后，加入5 mL正己烷，渦旋混合后靜置分層，取上層液3 mL于預(yù)先加少許無水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中，振蕩后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心，吸取上清液過濾膜到進(jìn)樣小瓶。

1.5　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.5.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取山梨醇100m g，置于10 mL容量瓶，用N，N二甲基甲酰胺定容，作為內(nèi)標(biāo)溶液（10.0 g/L）。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 g/L）：將肌醇標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過105℃烘干2 h，稱取100 mg（精確到0.1 mg）于100mL容量瓶中，用25mL水溶解完全，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇定容到刻度，混勻，4℃保存。肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（10.0 m g/L）：取1 mL肌醇儲備液于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇定容到刻度，混勻。

1.6　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

分別取肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL于濃縮瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液200μL，按1.4.2步驟操作，將制備好的樣品在與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中肌醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.7　結(jié)果計算

樣品中肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

式中：X為待測樣品中肌醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（m g/100 g）；C為樣品測定液中肌醇的量（μg）；m為樣品稱量質(zhì)量（g），10為稀釋倍數(shù)。

1.8　穩(wěn)定性分析

本實驗選取5種不同市售品牌嬰幼兒配方奶粉，開封后分別于4，20，37℃的溫度下，相對濕度為10%的陰涼干燥處存放180 d，并分別在0，30，60，120，180 d測定其肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其衰減率為

2　結(jié)果與討論

2.1　方法的線性范圍與定量

肌醇為環(huán)己六醇，山梨醇為己六醇，兩者結(jié)構(gòu)相似，且樣品中不含山梨醇，因此可以作為內(nèi)標(biāo)物使用[7]。奶粉樣品的色譜圖如圖1（a），肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（40μg）色圖譜如圖1（b），在本實驗的色譜條件下內(nèi)標(biāo)和樣品的峰保留時間適中，與雜質(zhì)的分離情況良好，目標(biāo)物質(zhì)前后無雜質(zhì)峰干擾。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測定，以肌醇的量（20，40，60，80，100μg）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)物（肌醇）與內(nèi)標(biāo)物（山梨醇）的峰面積之比Y為縱坐標(biāo)，繪制肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.4588x+0.0171。本法線性范圍較寬，肌醇的量在0～500μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9996。本方法中肌醇的3倍平均信噪比對應(yīng)的肌醇量為檢出限（LOD），10倍平均信噪比對應(yīng)的肌醇量為定量限（LOQ）。在本研究條件下肌醇的檢出限為0.72 m g/100 g，定量限為2.42 m g/100 g，符合奶粉中肌醇的檢測要求。

圖1　樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的GC色譜

2.2　方法的精密度與回收率

選擇3組肌醇本底量不同的奶粉，稱量1 g（精確至0.0001 g）樣品各6份，分別按照1.4的方法與國標(biāo)方法進(jìn)行分析，并對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。3組奶粉進(jìn)行6次平行測定，測量精密度RSD在1.02%～3.18%之間，均小于5%，表明兩種方法的精密度均能達(dá)到測定要求。且內(nèi)標(biāo)法與國標(biāo)（外標(biāo)法）測定結(jié)果無顯著性差異，但外標(biāo)法結(jié)果略低于內(nèi)標(biāo)法結(jié)果。由于嬰幼兒配方奶粉中成分復(fù)雜，多添加氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，這類雜質(zhì)經(jīng)常會和肌醇一起衍生化，影響氣相色譜的分離效果，干擾肌醇的測定。采用凈化方法操作繁瑣，還可能造成樣品的損失，所以添加內(nèi)標(biāo)物可以極大程度減少基質(zhì)的干擾，能夠顯著改善測定的準(zhǔn)確度和精密度。

根據(jù)上述樣品的測定步驟，隨機抽取一種嬰幼兒配方奶粉作為本底進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，分別添加低（10 m g/100g）、中（20 m g/100g）、高（50 m g/100g）3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)平行做5次。由表2可以看出，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)組肌醇的加標(biāo)回收率為98.42%，中質(zhì)量分?jǐn)?shù)組的加標(biāo)回收率為99.36%，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組肌醇的加標(biāo)回收率為100.97%，同時RSD在0.54%～1.23%之間，均小于5%。實驗結(jié)果表明，在使用山梨醇為內(nèi)標(biāo)時，實驗準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性良好，滿足微量分析的要求。分別采用國標(biāo)（外標(biāo)法）和本方法對樣品中肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異，而內(nèi)標(biāo)法的回收率（98.42%～100.97%）明顯優(yōu)于外標(biāo)法（96.61%～97.69%），所以本方法能夠用于嬰幼兒配方奶粉中肌醇的準(zhǔn)確定量檢測。肌醇易溶于水，微溶于乙醇，因此我們需先用水提取奶粉中的肌醇。此外，由于肌醇在水中的溶解度會隨溫度的升高而增大，采用40℃的溫水溶解后置于溫水浴上保溫數(shù)分鐘，這樣充分提取也能提高肌醇測定的準(zhǔn)確度[8]。

表1　精密度測定結(jié)果比較（n=6）

表2　添加回收實驗結(jié)果比較（n=5）

2.3　肌醇穩(wěn)定性試驗

表3為5種市售品牌的嬰幼兒配方奶粉在不同溫度條件下，經(jīng)過180 d開封存放以后的肌醇衰減率變化情況，可以看出，這5種奶粉肌醇隨著存放時間的延長，質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，衰減率逐漸增加。以A品牌奶粉為例（圖2），肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在每個溫度下都有不同程度的衰減，但在低溫（4℃）環(huán)境下的衰減速率明顯較高溫（37℃）環(huán)境下存放的慢，即在高溫環(huán)境存放下奶粉中肌醇損失的更快。由表3可以看出，在低溫（4℃）存放30 d時，5種奶粉中肌醇衰減率僅為0.40%～0.83%；存放180 d后也僅衰減了3.24%～7.05%；而常溫（20℃）存放180 d后，5種奶粉就衰減了12.06%～14.33%；在高溫（37℃）存放180 d后，5種奶粉肌醇衰減率高達(dá)16.60%～24.07%，速率明顯加快，是低溫的近4倍。肌醇與牛磺酸、膽堿一樣，屬于可選擇性成分添加，即非強制性營養(yǎng)強化劑。有研究顯示[9]，肌醇在密封儲藏24個月后衰減了17.67%，這與我們存放期間的研究結(jié)果肌醇不斷減少的趨勢是一致的，相比而言，奶粉開封存放過程中，肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)衰減率比密封儲藏更快。大多數(shù)嬰幼兒配方奶粉包裝上都有明確規(guī)定，奶粉開封后需要在1個月內(nèi)用完，本文通過肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的持續(xù)跟蹤測定也充分說明了這一點。由于肌醇極易溶于水，所以為了避免肌醇的氧化，開封后的奶粉應(yīng)存放于干燥低溫環(huán)境中，更能減緩奶粉中的營養(yǎng)物質(zhì)流失。

圖2　不同溫度下奶粉樣品A中肌醇的衰減變化

表3　市售嬰幼兒奶粉存放期間肌醇的衰減率 %

3　結(jié)論

本文通過優(yōu)化色譜條件，建立了嬰幼兒配方奶粉中肌醇測定的方法。結(jié)果顯示，方法快速、簡便，色譜峰分離度高，添加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)定量，受基質(zhì)影響小；回收率在98.42%～100.97%之間，RSD為0.54%～1.23%，可以滿足奶粉樣品中肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的準(zhǔn)確測定；且檢出限為0.1 m g/100 g，具有極高的靈敏性，滿足微量測定的要求。分別采用國標(biāo)法和本方法對樣品中肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。

通過檢測5種市售品牌的奶粉在不同溫度下開封180 d存放的肌醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，發(fā)現(xiàn)肌醇隨著時間的延長均有不同程度的衰減，其中在高溫（37℃）環(huán)境中衰減最快。除溫度外，嬰幼兒配方奶粉的穩(wěn)定性還受其他因素的影響，如光照、氧氣、水分等。需對各種影響因素的破壞機理進(jìn)行深入的研究，才能在嬰幼兒配方奶粉中科學(xué)的使用肌醇等營養(yǎng)元素，以提高奶粉的穩(wěn)定性。隨著人們對食品安全的關(guān)注度越來越高，嬰幼兒配方奶粉的穩(wěn)定性及其營養(yǎng)成分的合理化更加受到生產(chǎn)者和消費者的重視。所以，嬰幼兒配方奶粉中營養(yǎng)素的強化添加量，除了參照相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)、食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)、食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)外，還要及時關(guān)注衛(wèi)生部公告中有關(guān)食品添加劑和營養(yǎng)強化劑的使用范圍和使用量，以便及時更新產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)簽標(biāo)示值。質(zhì)檢部門也更應(yīng)該起到強有力的監(jiān)督作用，對奶粉中肌醇的檢測要做到準(zhǔn)確無誤。

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