結(jié)核病疫苗研究

彭寶洲，劉梓健，粟海波

（廣州醫(yī)科大學(xué)-廣州生物醫(yī)藥與健康研究院聯(lián)合生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 511436）

1 前言

1.1 結(jié)核病現(xiàn)狀

結(jié)核病是全球第九大死因，也是單一病原體感染造成的主要死因，高于HIV病毒，是傳染病死亡人數(shù)之首。據(jù)估計(jì)，2016年全球結(jié)核病新發(fā)病例數(shù)為1 040萬(wàn)例，167.4萬(wàn)例死于結(jié)核病，其中34.7萬(wàn)人合并感染HIV病毒。全球約有1/4的人口有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（latent TB infection，LTBI）[1]。

中國(guó)是世界上結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第三。結(jié)核病是中國(guó)農(nóng)村因病致貧、因病返貧的主要疾病之一，嚴(yán)重制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展[2]。

1.2 結(jié)核病的致病機(jī)制

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium cuberculosis，Mtb）引起，Mtb已發(fā)展了許多機(jī)制來(lái)避免被吞噬細(xì)胞殺傷，特別是單核吞噬細(xì)胞。在宿主細(xì)胞內(nèi)，Mtb寄居于吞噬體內(nèi)且阻止吞噬體間的融合。通過(guò)ESX-1分泌系統(tǒng)破壞吞噬體膜，抗原可以進(jìn)入胞漿，其本身也可能進(jìn)入胞漿。Mtb抗原可與Ⅰ型MHC和Ⅱ型MHC結(jié)合分別被CD8+和CD4+T細(xì)胞識(shí)別，而Mtb可以下調(diào)Ⅱ型MHC的表達(dá)以減弱CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，抑制CD4+T細(xì)胞的積累[3]。

Mtb在活性階段和休眠階段的基因表達(dá)有很大的差異?；钚訫tb表達(dá)復(fù)制和高代謝活性的遺傳程序，包括毒力因子的表達(dá)以幫助其入侵宿主細(xì)胞，滅活或破壞宿主的防衛(wèi)機(jī)制并破壞其組織；而在休眠階段，Mtb幾乎沒(méi)有代謝、復(fù)制、毒力的基因表達(dá)[4]，由此來(lái)逃避免疫。休眠期Mtb表達(dá)的抗原被稱為休眠抗原，從更廣泛的意義上講，休眠抗原還包括營(yíng)養(yǎng)缺乏和有效免疫控制下表達(dá)的抗原。休眠期Mtb減少了毒力表達(dá)和對(duì)宿主細(xì)胞的破壞，與此同時(shí)，它對(duì)免疫系統(tǒng)卻是一個(gè)難題，其持續(xù)感染健康個(gè)體，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）。一旦宿主的免疫能力低下，Mtb即可從休眠階段復(fù)蘇返回活性階段，傳播和進(jìn)入新宿主。在全球范圍內(nèi)，估計(jì)有20億人擁有LTBI，且絕大多數(shù)人將終生維持這一狀態(tài)，只有約5%的LTBI患者會(huì)在感染的頭幾個(gè)月內(nèi)發(fā)展成結(jié)核病，主要發(fā)生在兒童和免疫功能低下的患者特別是HIV+個(gè)體中。另外，少數(shù)的LTBI患者可維持這一狀態(tài)數(shù)年至數(shù)十年，通過(guò)再活化或再感染而發(fā)病，這些個(gè)體在免疫功能足夠強(qiáng)力時(shí)壓制著Mtb，在后期免疫力減弱時(shí)發(fā)病。

同時(shí)，耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）也給全球的結(jié)核病疾病控制帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。2016年，全球有60萬(wàn)耐利福平（最有效的一線藥物）的新病例，其中49萬(wàn)為耐多藥結(jié)核病。全球數(shù)據(jù)顯示，接受治療的耐多藥結(jié)核病患者平均治愈率僅為54%。最近報(bào)道了幾乎定義為完全耐藥結(jié)核病的病例，表明人類結(jié)核病正在加入進(jìn)入抗生素后時(shí)代的細(xì)菌性疾病[5]。

1.3 目前主要疫苗

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一一種用于預(yù)防兒童結(jié)核病的預(yù)防接種疫苗。相比較牛分支桿菌與Mtb，BCG缺乏了多個(gè)基因組片段。其主要減毒原因是RD1（the Region of Different 1）基因，該基因編碼免疫顯性抗原，包括ESAT-6、CFP-10以及分枝桿菌獨(dú)有的ESX-1 Ⅶ型分泌系統(tǒng)。

雖然BCG對(duì)結(jié)核病的預(yù)防功不可沒(méi)，還能通過(guò)刺激非特異性免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗常見(jiàn)疾病[6]，但研究表明，BCG僅對(duì)預(yù)防兒童結(jié)核病有效，而對(duì)青年和成人結(jié)核病沒(méi)有保護(hù)作用且其作用具有地域性。所以，更加安全有效的疫苗是人們的迫切需要。

近年來(lái)，一些新型結(jié)核病疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的不同階段，本綜述對(duì)全球結(jié)核病疫苗進(jìn)行系統(tǒng)簡(jiǎn)述，包括重組卡介苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗、治療性疫苗等。

2 國(guó)內(nèi)外結(jié)核病疫苗研究現(xiàn)狀

2.1 重組卡介苗

目前，卡介苗顯然不足以控制全球結(jié)核病，而重組BCG旨在代替目前的BCG疫苗[2-3]。

鋅蛋白酶由zmp1基因編碼，致病性分支桿菌依靠該蛋白短暫停止吞噬體的成熟；BCG Δ zmp1將zmp1基因移除可使更多活疫苗被運(yùn)往成熟的吞噬體，增強(qiáng)Ⅱ型MHC受限抗原的呈遞，已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。

BCG Δ ureC::hly（VPM1002）將單核細(xì)胞李斯特菌hly基因整合至BCG。hly基因可編碼溶血性穿孔蛋白溶血素O能在吞噬體膜上穿孔，其最適pH為5.5。ureC基因編碼尿素酶C，尿素酶C缺失可促進(jìn)吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境，保證溶血素活性。穿孔可以使細(xì)菌的蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞胞漿，導(dǎo)致Ⅰ型MHC受限抗原呈遞增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬。BCG Δ ureC::hly被證實(shí)在成人中有免疫原性，甚至能用于HIV+患者，已進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)。

此外，BCG Δ ureC::hly還有新的改進(jìn)方案：BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 和 BCG Δ ureC::hly Δ pdx1。

nuoG是BCG中的抗細(xì)胞凋亡毒力基因，編碼NADH 脫氫酶1亞基G。BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 比BCG更安全，并且改善了對(duì)親本BCG Δ ureC::hly的保護(hù)，顯著降低了鼠肺中的TB負(fù)荷并增強(qiáng)了免疫應(yīng)答，具有優(yōu)異的療效和安全性。

pdx1是細(xì)菌和真菌的維生素B6合成基因，該基因的缺失使得維生素B6營(yíng)養(yǎng)缺陷型Mtb顯著抑制了其在小鼠中的存活。BCG Δ ureC::hly Δ pdx1在皮下免疫小鼠中顯示明顯受限的播散，該疫苗的比親本BCG Δ ureC::hly更安全，甚至有望用于HIV+嬰兒。

BCG ::pfo（AERAS-422）疫苗加入了產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素基因，且表達(dá)了3個(gè)抗原——Ag85A、Ag85B、Rv3407，其中Rv3407是在Mtb從休眠狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)表達(dá)的抗原。然而，該疫苗在臨床Ⅰ期試驗(yàn)中存在安全性問(wèn)題而被終止。

BCG ::ESX-1將ESX-1基因插入BCG中，ESX-1 T7SS是BCG減毒的主要原因，但ESX-1分泌蛋白是重要的抗原物質(zhì)。這些抗原物質(zhì)Mtb能產(chǎn)生，而B(niǎo)CG不能。該疫苗在臨床前試驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫原性，但其毒性會(huì)增強(qiáng)。最近，有使用親緣關(guān)系更疏遠(yuǎn)的海魚(yú)分枝桿菌的ESX-1基因來(lái)補(bǔ)充BCG（BCG::ESC-1Mmar），這個(gè)結(jié)構(gòu)比BCG ::ESX-1Mtb更加安全有效，已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。

Mtb Δ phoP Δ fadD26（MTBVAC）疫 苗 來(lái) 源 于Mtb株系MT103。phoP基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，控制分枝桿菌的胞內(nèi)適應(yīng)并促進(jìn)ESAT-6的分泌。fadD26是脂質(zhì)合成基因，與細(xì)胞壁形成、細(xì)菌毒力、胞內(nèi)存活相關(guān)。該疫苗的安全性與BCG相當(dāng)，且免疫原性和保護(hù)力更強(qiáng)，能CD4+T細(xì)胞數(shù)量。高度減毒的MTBVAC可能成為高風(fēng)險(xiǎn)免疫抑制人群的潛在疫苗，現(xiàn)該疫苗已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段。

BCG ::AB疫苗插入了抗原Ag85A和Ag85B的基因，和BCG相比有更高的Ag85A和Ag85B蛋白過(guò)表達(dá)水平。BCG ::AB可提供更強(qiáng)更持久的保護(hù)作用，已進(jìn)入小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

BCG ::AR疫苗包含了Ag85B和Rv3425基因，Rv3425是PPE家族亞組3的成員，在所有BCG菌株中都不存在。該疫苗接種小鼠后，增強(qiáng)了Th1細(xì)胞應(yīng)答，提升γ干擾素水平，具有比BCG更強(qiáng)的保護(hù)效力。該疫苗已進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)階段。

BCG ::GCE是一個(gè)共表達(dá)人GM-CSF和結(jié)核桿菌特異性抗原CFP10與ESAT6的重組卡介苗，該疫苗免疫小鼠后，血清特異性抗體滴度迅速升高，脾淋巴細(xì)胞增殖、CD4+和CD8+T細(xì)胞比例及γ干擾素分泌也增加，已進(jìn)入小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗在BCG注射后使用，主要用于增強(qiáng)BCG誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。大部分重組卡介苗的主要使用人群是兒童和青年，將重組卡介苗與亞單位疫苗結(jié)合使用，可以將他們的應(yīng)用擴(kuò)大到成人群體中[2,7]。

M72是PPE家族成員Rv1196（Mtb39A）和絲氨酸蛋白酶Rv0125（Mtb32A）的融合蛋白，加佐劑AS01E；M72/AS01E疫苗具有免疫原性并兼顧臨床上可接受的安全性，能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞對(duì)M27的特異性免疫應(yīng)答和體液免疫，且該疫苗對(duì)LTBI人群具有較好的安全性，已進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)。

Hybrid 1是Ag85B和ESAT-6的融合蛋白，Hyvac 4是Ag85B與TB10.4的融合蛋白。兩種疫苗都使用佐劑IC31，且能持續(xù)有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，均已進(jìn)入臨床IIa期試驗(yàn)。

Hybrid 56是利用了休眠抗原的疫苗，這個(gè)疫苗不僅包含了早期分泌抗原ESAT-6和Ag85B，而且還包含潛伏感染抗原Rv2660。Rv2660基因產(chǎn)物在脅迫條件下表達(dá)，被認(rèn)為是休眠抗原，本身具有弱免疫原性。將Rv2660與ESAT-6、Ag85B結(jié)合后，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中保護(hù)性免疫應(yīng)答顯著提升，能增強(qiáng)BCG對(duì)獼猴抵抗Mtb感染的保護(hù)作用。該疫苗已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)。這個(gè)疫苗代表了TB疫苗開(kāi)發(fā)的一大進(jìn)步，因?yàn)槠浒目乖诟腥镜牟煌A段即可識(shí)別。此外，一項(xiàng)H56 cDNA的臨床前內(nèi)皮注射小鼠試驗(yàn)中，H56 cDNA誘導(dǎo)了特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答和Ag85B IgG抗體，改善肺部病理[8]。

融合蛋白ID93包含3個(gè)毒力蛋白R(shí)v2608、Rv3619、Rv3620和1個(gè)休眠蛋白R(shí)v1813。ID93/GLA-SE與Hybrid 56亞單位疫苗都包含了不同感染階段的抗原。在小鼠中，ID93和佐劑GLA-SE組合使用誘導(dǎo)了多功能CD4+Th1細(xì)胞應(yīng)答，以及隨后感染動(dòng)物的肺中細(xì)菌數(shù)量減少。在豚鼠實(shí)驗(yàn)中，ID93與BCG組合使用還降低了死亡率。蛋白亞單位疫苗ID93/GLA-SE可預(yù)防動(dòng)物中的結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病，并且可以提高兒童BCG疫苗的保護(hù)效力，已進(jìn)入臨床Ia期試驗(yàn)。

LT70疫苗將抗原ESAT-6、Ag85B、MPT64的肽190-198、Mtb8.4和潛伏期相關(guān)抗原Rv2626融合共同構(gòu)建為多級(jí)蛋白LT70，LT70可被來(lái)自結(jié)核病人和LTBI患者的T細(xì)胞識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有更高的保護(hù)效力，已進(jìn)入小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

重組結(jié)核疫苗AEC/BC02是由重組MTB抗原Ag85B、ESAT-6、CFP-10與復(fù)合佐劑BC02構(gòu)成的亞單位疫苗，該疫苗免疫原性強(qiáng)，在豚鼠實(shí)驗(yàn)中多次注射免疫后沒(méi)有觀察到明顯的Koch現(xiàn)象，具有較高的安全性。該疫苗有望用于LTBI患者，已進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)。

2.3 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗主要以痘苗病毒、腺病毒、仙臺(tái)病毒為載體構(gòu)建結(jié)核病新型疫苗，主要用于免疫加強(qiáng)或預(yù)防性免疫[9]。

MVA85A一種表達(dá)抗原Ag85A的改進(jìn)后的安卡拉牛痘病毒，改進(jìn)后的痘苗病毒雖然不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，但能表達(dá)蛋白，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。該疫苗在多年前已接種BCG的個(gè)體中也能誘導(dǎo)二次免疫應(yīng)答，僅觀察到輕微的不良反應(yīng)，在LTBI患者中也有相似的免疫效果。但在臨床IIb期試驗(yàn)中對(duì)兒童沒(méi)有表現(xiàn)出免疫效力，以失敗告終。

重組腺病毒載體特別適用于誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫。Ad35-TBS（AERAS-402）是這一類型疫苗中較先進(jìn)的一種，是基于Ad35型的病毒載體疫苗，它表達(dá)了Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的獨(dú)特融合蛋白。在動(dòng)物模型中，通過(guò)鼻內(nèi)或肌內(nèi)途徑施用給小鼠賦予了針對(duì)Mtb的保護(hù)作用，能誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。該疫苗已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)階段。

Ad5Ag85A是一種基于復(fù)制缺陷型黑猩猩腺病毒載體的疫苗，這個(gè)疫苗僅表達(dá)抗原Ag85A。這個(gè)疫苗通過(guò)鼻內(nèi)給藥而不是肌肉注射，在臨床Ⅰ期試驗(yàn)中表現(xiàn)出高免疫原性，能刺激多功能T細(xì)胞應(yīng)答，比BCG更有效地提高了CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫。該疫苗能提高BCG的保護(hù)效力，已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)。

Ad5-CEAB也是一種通過(guò)鼻內(nèi)滴注的腺病毒載體疫苗，其表達(dá)的抗原包括CFP-10、ESAT-6、Ag85A、Ag85B。在小鼠模型中，該疫苗能導(dǎo)致強(qiáng)烈的抗原特異性免疫應(yīng)答以及體液應(yīng)答，已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。

TB/ FLU-04L是由流感病毒株A/Puetro Rico/8/34 H1N1和Mtb抗原Ag85A、ESAT6組成的重組流感疫苗。該疫苗正在計(jì)劃進(jìn)行IIa期試驗(yàn)。

2.4 治療性疫苗

治療性疫苗設(shè)計(jì)的主要目標(biāo)是預(yù)防潛伏感染或減少化療的持續(xù)時(shí)間[2,7,10]。

M.Vaccae是通過(guò)滅活母牛分枝桿菌全細(xì)胞株開(kāi)發(fā)的，其耐受性良好，沒(méi)有報(bào)道嚴(yán)重的不良反應(yīng)。該疫苗具有有效的免疫原性和安全性，已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)，目前正在中國(guó)接受針對(duì)LTBI患者的有效性和安全性試驗(yàn)。

MIP是一種快速生長(zhǎng)的非致病性腐生菌，在一項(xiàng)小鼠模型研究中，通過(guò)氣霧劑給藥時(shí)，MIP具有比BCG更高的免疫原性和保護(hù)效力。該疫苗已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)。

RUTI是由脂質(zhì)體遞送的解毒、半純化的Mtb細(xì)胞碎片制成的治療性疫苗，這些Mtb在脅迫和饑餓條件下培養(yǎng)而成，該疫苗的療效得益于Mtb在肉芽腫病變中通常表達(dá)的休眠期抗原的富集。研究顯示，RUTI在小鼠和豚鼠中顯示出控制結(jié)核感染潛伏形式的功效，在短期化療后誘導(dǎo)多抗原反應(yīng)和抗體產(chǎn)生。該疫苗已進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)。

Ag85A/B DNA是一個(gè)DNA疫苗，將Ag85A和Ag85B基因插入到質(zhì)粒載體中，在Ag85A/B嵌合DNA肌肉注射小鼠免疫治療實(shí)驗(yàn)中，小鼠顯示出顯著的免疫反應(yīng)，對(duì)治療結(jié)核病有效。已進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)。

分枝桿菌obuense衍生的DAR-901是一種多抗原熱滅活全細(xì)胞疫苗，該疫苗使用肉湯培養(yǎng)方法制造，與Mtb共享多種抗原，因此可以提供交叉保護(hù)。DAR-901旨在成為艾滋病毒感染和未感染艾滋病毒的青少年和成人預(yù)防結(jié)核病的強(qiáng)化疫苗，該疫苗已進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)。

3 結(jié)核病疫苗研究中存在的問(wèn)題、對(duì)策與展望

3.1 存在的問(wèn)題與對(duì)策

目前，全球的結(jié)核病疫情日益嚴(yán)峻，主要存在以下幾方面問(wèn)題有，（1）不同地區(qū)BCG的特異性差異。（2）MDT-TB的出現(xiàn)使疫情控制困難，疫情下降緩慢或有所回升。（3）Mtb與HIV的合并感染；目前沒(méi)有十分適用于HIV+患者的疫苗，BCG也同樣不能用于HIV+患者。HIV感染使BCG失控增長(zhǎng)和傳播，導(dǎo)致卡氏病的出現(xiàn)，因此HIV+兒童不能接種BCG。（4）Mtb與寄生蟲(chóng)感染；寄生蟲(chóng)感染使患者Th細(xì)胞向Th2極分化，對(duì)抗寄生蟲(chóng)；而Th2細(xì)胞將下調(diào)Th1細(xì)胞，從而降低對(duì)TB的保護(hù)。（5）疫苗的人群特異性問(wèn)題。（6）疫苗的評(píng)測(cè)需要更優(yōu)良的模型；研究發(fā)現(xiàn)很多實(shí)驗(yàn)的免疫結(jié)果與實(shí)際使用效果不符。

對(duì)于這些問(wèn)題，可以采用的對(duì)策有：（1）對(duì)前人的臨床實(shí)驗(yàn)失敗進(jìn)行總結(jié)，吸取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)；（2）對(duì)不同的BCG菌株進(jìn)行鑒定；（3）隨著MDR-TB的出現(xiàn)，未來(lái)患者的治療應(yīng)考慮藥物和治療性疫苗聯(lián)合使用的手段；（4）開(kāi)發(fā)針對(duì)不同人群的結(jié)核病疫苗，如HIV+患者、兒童、老年人等易感人群；（5）創(chuàng)建新的疫苗評(píng)估模型。

3.2 對(duì)未來(lái)的展望

未來(lái)將有越來(lái)越多的結(jié)核病候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，疫苗的測(cè)試需要更多的經(jīng)費(fèi)和更大的平臺(tái)。對(duì)于未來(lái)結(jié)核病的發(fā)展方向，應(yīng)如下：（1）研制安全性和保護(hù)力強(qiáng)于BCG的疫苗以代替BCG；（2）采用初始免疫和增強(qiáng)免疫相結(jié)合的策略，如改良BCG和亞單位疫苗共用；（3）研發(fā)可針對(duì)所有年齡人群的多階段亞單位疫苗，特別是對(duì)休眠抗體的研究；（4）未來(lái)的疫苗應(yīng)考慮利用BCG非特異性免疫的潛在作用。

世界衛(wèi)生組織《終止結(jié)核病策略》確定的具體目標(biāo)有：在2015年基礎(chǔ)上，到2030年將結(jié)核病死亡人數(shù)減少90%，將結(jié)核病發(fā)病率降低80%。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，需要科學(xué)和社會(huì)層面的密切合作，世界各國(guó)各地區(qū)的共同努力。