秦 蕾，孫玉英，畢可然，高迎莉

(淮海工學院 海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇 連云港 222005)

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的一種極其重要的致病原。隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，因該菌引發(fā)的病害問題日益突出，給該產(chǎn)業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失[1]。魚類遲緩愛德華氏菌病難以防控的原因是多方面的。其中，遲緩愛德華氏菌是胞內寄生菌，對其致病機理和胞內寄生機制不清楚是主要原因之一。研究表明，魚類主要通過巨噬細胞參與對遲緩愛德華氏菌感染的炎癥應答[2-5]。遲緩愛德華氏菌可以逃避巨噬細胞的吞噬并在巨噬細胞內繁殖，最終導致宿主全身感染[6]。 遲緩愛德華氏菌與巨噬細胞的相互作用是該菌感染致病過程的重要環(huán)節(jié)，針對其互作機制的研究，對魚類遲緩愛德華氏菌病的防治具有重要意義。

目前較為集中深入的工作是關于遲緩愛德華氏菌各種毒力因子的研究，包括T3SS、T6SS、雙組份系統(tǒng)、溶血素和外膜蛋白等[7-12]， 但對遲緩愛德華氏菌復雜的胞內寄生機制仍缺乏足夠了解，對遲緩愛德華氏菌與巨噬細胞的互作關系也仍然不明確，這在很大程度上限制了對魚類遲緩愛德華氏菌病的防治。 巨噬細胞主要通過凋亡、產(chǎn)生活性氧和一氧化氮等效應分子的方式來清除病原微生物[13-15]。本研究通過對不同毒力遲緩愛德華氏感染巨噬細胞后產(chǎn)生的Caspase-3、活性氧和一氧化氮等相關生物效應分子進行測定，探討不同毒力菌株對巨噬細胞免疫應答的影響，旨在為明晰遲緩愛德華氏菌的致病機理和胞內寄生機制奠定基礎，同時也為尋找根除魚類遲緩愛德華氏菌病的關鍵靶點開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用健康大菱鲆(Scophthalmusmaximus)取自江蘇贛榆某大菱鲆養(yǎng)殖場，充氧運回實驗室暫養(yǎng)3 d后用于分離巨噬細胞，遲緩愛德華氏菌強毒株和弱毒株分離自不同養(yǎng)殖場患病的大菱鲆，其半數(shù)致死密度分別為3.2×102cfu/mL和1.7×106cfu/mL。

1.2 試驗試劑

L-15培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；Percoll(Pharmacia)；青鏈霉素、慶大霉素(碧云天)；MS-222(杭州動物藥品廠)；TrypLE(Invitrogen)；Caspase-3檢測試劑盒(BioVision)；活性氧(ROS)測試盒(南京建成)；一氧化氮檢測(NO)試劑盒(碧云天)。

1.3 大菱鲆頭腎巨噬細胞的分離培養(yǎng)

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉大菱鲆，75%酒精消毒魚體剖取頭腎。用加有雙抗和慶大霉素的細胞洗滌液清洗頭腎，清洗后將其置于100目的細胞篩上研磨得到細胞懸液。利用31%/45%的Percoll密度梯度，400 g，20 min，水平離心分離巨噬細胞。收集位于梯度帶的巨噬細胞加入L-15培養(yǎng)基，200 g，5 min離心反復清洗兩次。獲得的巨噬細胞以1.5×106cfu/mL密度接種于24孔板，20 ℃培養(yǎng)24 h后換新培養(yǎng)基，以去除懸浮細胞，提高巨噬細胞純度。培養(yǎng)的巨噬細胞TrypLE消化后計數(shù)并同時做細胞涂片，甲醛固定用于Giemsa染色觀察。

1.4 遲緩愛德華氏菌侵染巨噬細胞

巨噬細胞換新培養(yǎng)基后加入計數(shù)好的處于對數(shù)生長期的菌液進行感染，感染復數(shù)采用50∶1 (設3個重復)， 400 g離心5 min，孵育2 h，細胞培養(yǎng)基洗滌3次，加入含有200 μg/mL的慶大霉素處理1 h，洗滌3次后繼續(xù)培養(yǎng)，在指定的時間點取樣做各項檢測。同時設不加菌液的細胞作為對照。

1.5 巨噬細胞Caspase-3活性檢測

分別在感染后12 h和24 h取樣，按Caspase-3檢測試劑盒說明進行操作，計數(shù)細胞1×106cfu/mL,用50 μL預冷的細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育10 min，10 000 g離心1 min，測定上清液蛋白濃度，稀釋100 μg蛋白于50 μL細胞裂解液中，先后加入50 μL 2×反應緩沖液(含10 mmol/L DTT)和5 μL 4 mmol/L DEVD-pNA底物(終濃度200 mmol/L)，孵育2 h后酶標儀讀數(shù)A405。

1.6 巨噬細胞產(chǎn)生活性氧檢測

活性氧檢測工作在菌液加入巨噬細胞后直接進行。分別在感染后30 min和120 min添加DCFH-DA于細胞培養(yǎng)基中(工作濃度10 μmol/L),孵育30 min。TrypLE消化細胞2 min，培養(yǎng)基終止消化，600 g離心5 min收集細胞，預冷的 1磷酸鹽緩沖液洗2遍，離心收集細胞沉淀物，磷酸鹽緩沖液重懸后酶標儀讀數(shù)A525。

1.7 巨噬細胞一氧化氮分泌量測定

于感染后6 h和24 h吸取上清培養(yǎng)液。按一氧化氮測定試劑盒操作分別加入Griess試劑，測定細胞培養(yǎng)上清液中巨噬細胞一氧化氮生成量。

1.8 統(tǒng)計分析

所有結果數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差表示，采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，與對照組比較；P<0.05，不同毒力感染組比較)。

2 結 果

2.1 大菱鲆頭腎巨噬細胞的Giemsa染色觀察

培養(yǎng)的大菱鲆頭腎巨噬細胞經(jīng)Giemsa染色見圖1，可見細胞形態(tài)不規(guī)則，胞質豐富，含有大小不等的空泡，胞核較小多偏向一端，符合巨噬細胞典型的形態(tài)特點。

圖1 大菱鲆頭腎巨噬細胞的Giemsa染色(比例尺=10 μm)

2.2 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細胞Caspase-3活性的比較

遲緩愛德華氏菌強毒株和弱毒株分別感染巨噬細胞12 h和24 h后，胞內Caspase-3的活性檢測結果見圖2。與對照組相比，兩株菌感染的巨噬細胞均能檢測到較高的Caspase-3活性，而且隨時間延長其活性逐漸增加，其中弱毒株感染組Caspase-3的活性在各時間點均顯著高于強毒株感染組(P<0.05)。

2.3 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生活性氧的比較

研究結果顯示，遲緩愛德華氏菌能夠誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生活性氧，感染后30 min，強毒株感染組和弱毒株感染組巨噬細胞產(chǎn)生活性氧差異不顯著(P>0.05)；但感染后120 min，與弱毒株相比，強毒株能夠顯著抑制活性氧的產(chǎn)生(P<0.05)，表明強毒株未能引發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生強烈的呼吸爆發(fā)(圖3)。

圖2 遲緩愛德華氏菌強毒株和弱毒株對巨噬細胞Caspase-3活性的影響

圖3 遲緩愛德華氏菌強毒株和弱毒株對巨噬細胞產(chǎn)生活性氧的影響

2.4 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細胞分泌一氧化氮的比較

遲緩愛德華氏菌能夠誘發(fā)大菱鲆巨噬細胞釋放一氧化氮，但與弱毒株感染組相比，在各時間點強毒株感染表現(xiàn)出對巨噬細胞釋放一氧化氮的抑制作用(P<0.05)(圖4)。

圖4 遲緩愛德華氏菌強毒株和弱毒株對巨噬細胞分泌一氧化氮的影響

3 討 論

巨噬細胞不僅是執(zhí)行固有免疫重要的效應細胞，同時作為抗原呈遞細胞也在適應性免疫應答中起重要輔助功能。其強大的吞噬能力能對病原菌造成很大的威脅，而病原微生物在與巨噬細胞的長期斗爭過程中會逐漸形成多種逃避殺傷的有效策略，使其得以在巨噬細胞內存活并增殖[16]。已有的研究證實，遲緩愛德華氏菌能夠在巨噬細胞內生存和繁殖[17-19]，這說明遲緩愛德華氏菌具備適應巨噬細胞殺傷的能力，并且能夠在巨噬細胞內大量繁殖并導致隨后的全身性感染，而遲緩愛德華氏菌弱毒株卻能被巨噬細胞吞噬后逐漸清除顯示出較弱的致病能力[14]。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3是最關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。在細胞凋亡的早期階段，Caspase-3被激活裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞的凋亡。Caspase-3的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[20]。巨噬細胞發(fā)生凋亡可殺死胞內寄生菌，阻止細菌在宿主體內的傳播擴散，并能激活臨近未感染的巨噬細胞增強其對病原的殺傷力[21-22]。因此，對胞內寄生菌而言，巨噬細胞的凋亡情況對其命運至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，不同毒力的遲緩愛德華氏菌侵染巨噬細胞后都能夠檢測到Caspase-3的活性，但與弱毒株相比，遲緩愛德華氏菌強毒株能夠顯著抑制Caspase-3的活性。研究結果表明，遲緩愛德華氏菌能夠觸發(fā)巨噬細胞發(fā)生不同程度的凋亡，但強毒株能夠抑制巨噬細胞凋亡，從而在胞內存活繁殖，而弱毒株則能誘發(fā)巨噬細胞凋亡，導致其最終被清除。Okuda等[18]在遲緩愛德華氏菌感染鼠巨噬細胞的研究中也證實，遲緩愛德華氏菌能夠通過上調NF-κB基因的表達來抑制巨噬細胞的凋亡從而來保護自己。 遲緩愛德華氏菌的這種抗凋亡能力可能為其逃離凋亡細胞之前提供足夠的時間以改變其毒力相關的表型，從而增強其感染寄生的能力。遲緩愛德華氏菌的抗凋亡機制目前仍不十分清楚，還有待進一步研究。

活性氧在巨噬細胞介導的免疫應答中扮演著極其重要的角色，巨噬細胞受到刺激或進行吞噬作用后能夠發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量活性氧，并通過活性氧清除吞噬的微生物。然而其產(chǎn)生的氧壓力同時對巨噬細胞本身也會產(chǎn)生重要的影響[23]。已發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌能夠抑制藍曼龍頭腎巨噬細胞和牙鲆腹腔巨噬細胞活性氧的釋放[14,17]。同樣，本研究結果顯示遲緩愛德華氏菌強毒株未能引起大菱鲆頭腎巨噬細胞產(chǎn)生強烈的呼吸爆發(fā)，進一步證實該菌株有能力阻止巨噬細胞產(chǎn)生活性氧，以達到保護自己和減少巨噬細胞受損從而為其提供更適居住場所的雙重目的。遲緩愛德華氏菌抑制活性氧產(chǎn)生的機制尚不十分明確。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌能夠上調RhoGDI蛋白的表達(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)， 該蛋白被證實能夠抑制活性氧的主要來源-NADPH氧化酶的活化[24]，或許能夠解釋這一現(xiàn)象，但遲緩愛德華氏菌抑制巨噬細胞產(chǎn)生活性氧的真正機制還有待探討。

作為活化巨噬細胞產(chǎn)生的一種重要的細胞效應分子，一氧化氮能夠介導巨噬細胞抑制和殺傷細菌、病毒及寄生蟲等病原體，是巨噬細胞防御系統(tǒng)中的一個重要因子[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與弱毒株相比，遲緩愛德華氏菌強毒株能夠顯著抑制大菱鲆頭腎巨噬細胞產(chǎn)生大量一氧化氮。與之類似，強毒力結核桿菌也表現(xiàn)出對巨噬細胞分泌一氧化氮的抑制作用[26]。 遲緩愛德華氏菌強毒株表現(xiàn)出對巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮的抑制作用可能是其能夠逃避巨噬細胞殺傷的重要原因之一。然而，Ishibe等[15]研究卻發(fā)現(xiàn)相較于弱毒株，遲緩愛德華氏菌強毒株能誘發(fā)牙鲆腹腔巨噬細胞更多的一氧化氮產(chǎn)生。不同來源的巨噬細胞對遲緩愛德華氏菌應答出現(xiàn)部分差異，可能與巨噬細胞存在的異質性有關[27]，但也無法排除菌株之間的差異所導致的結果。

本研究闡明了不同毒力遲緩愛德華氏菌感染對巨噬細胞應激的調控作用，初步揭示了遲緩愛德華氏菌與巨噬細胞相互作用的機理，即強毒株和弱毒株分別對巨噬細胞的應激發(fā)揮抑制和誘導作用，從而影響了細菌的生長，繁殖和宿主的發(fā)病，為闡明遲緩愛德華氏菌病的發(fā)病機制提供了理論依據(jù)。

[1] Xu T T,Zhang X H.Edwardsiellatarda：an intriguing problem in aquaculture [J].Aquaculture,2014,431(2):129-135.

[2] Darwish A,Plumb J A,Newton J C.Histopathology and pathogenesis of experimental infection withEdwardsiellatardain channel catfish[J].J Aquat Anim Health,2000,12(4):255-266.

[3] Meagan E P,Peter E,Phelan Ⅲ,et al.Pathogenesis and inflammatory response toEdwardsiellatardainfection in the zebrafish[J].Dev Comp Immunol,2005,29(6):501-513.

[4] Padrós F,Zarza C,Dopazo L,et al.Pathology ofEdwardsiellatardainfection in turbot,Scophthalmusmaximus(L.)[J].J Fish Dis,2006,29(2):87-94.

[5] Qin L,Xu J,Wang Y G.Edwardsiellosis in farmedScophthalmusmaximus(L.),associated with unusual variant ofEdwardsiellatarda: a clinical,aetiological and histopathological study[J].J Fish Dis,2014,37(2):103-111.

[6] Leung K Y,Siame B A,Tenkink B J,et al.Edwardsiellatarda-virulence mechanisms of an emerging gastroenteritis pathogen[J].Microbes Infect，2012,14(1):26-34.

[7] 王波,莫照蘭.遲緩愛德華氏菌及其致病機理[J].海洋科學集刊,2007(48):138-144.

[8] 賀揚,張曉華.遲緩愛德華氏菌致病相關因子的研究進展[J].中國海洋大學學報：自然科學版,2009,39(5):979-987.

[9] 王斌,李軍偉,趙鳳梅,等.遲鈍愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白功能域預測[J].水產(chǎn)科學,2013,32(7):385-390.

[10] Hu Y H,Sun L.The global regulatory effect ofEdwardsiellatardaFur on iron acquisition,stress resistance,and host infection: a proteomics-based interpretation[J].J Proteomics,2016,140(5):100-110.

[11] Chen H,Yang D H,Han F J,et al.The bacterial T6SS effector EvpP prevents NLRP3 inflammasome activation by inhibiting the Ca2+-Dependent MAPK-Jnk Pathway[J].Cell Host Microbe,2017,21(1): 47-58.

[12] Liu F,Tang X,Sheng X,et al.Comparative study of the vaccine potential of six outer membrane proteins ofEdwardsiellatarda,and the immune responses of flounder (Paralichthysolivaceus) after vaccination[J].Veterinary Immunology & Immunopathology,2017,185(2):38-47.

[13] Lancellotti M,Brocchi M,Silveira W D D.Bacteria- induced apoptos and approach to bacterial pathogenesis[J].Braz J Morphol Sci,2006,23(1):75-86.

[14] Ishibe K,Osatomi K,Hara K,et al.Comparison of the responses of peritoneal macrophages from Japanese flounder (Paralichthysolivaceus) against high virulent and low virulent strains ofEdwardsiellatarda[J].Fish and Shellfish Immun,2008,24(2):243-251.

[15] Ishibe K,Yamanishi T,Wang Y,et al.Comparative analysis of the production of nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-[alpha](TNF-[alpha]) from macrophages exposed to high virulent and low virulent strains ofEdwardsiellatarda[J].Fish and Shellfish Immun,2009,27(2):386-389.

[16] 羅云蔓,郭曉奎,姜敘誠.病原菌逃避單核-巨噬細胞殺滅策略的研究進展[J].微生物與感染,2010,5(2):117-120.

[17] Srinivasa R P S,Lim T M,Leung K Y.Opsonized virulentEdwardsiellatardastrains are able to adhere to and survive and replicate within fish phagocytes but fail to stimulate reactive oxygen intermediates[J].Infect Immun,2001,69(9):5689-5697.

[18] Okuda J,Arikawa Y,Takeuchi Y,et al.Intracellular replication ofEdwardsiellatardain murine macrophage is dependent on the type Ⅲ secretion system and induces an up-regulation of anti-apoptotic NF-κB target genes protecting the macrophage from staurosporine-induced apoptosis[J].Microb Pathogenesis,2006,41(6):226-240.

[19] Qin L,Sun Y Y,Zhao Y J,et al.In vitro model to estimateEdwardsiellatarda-macrophage interactions using RAW264.7 cells[J].Fish & Shellfish Immun,2017,60(1):177-184.

[20] Porter A G,Janicke R U.Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J].Cell Death Differ,1999,6(2):99-104.

[21] Vaux D L,H?cker G.Hypothesis: apoptosis caused by cytotoxins represents a defensive response that evolved to combat intracellular pathogens[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,1995,22(11):861-863.

[22] 史會連,孫東平,陳澍,等.結核桿菌毒力的研究進展 [J].中華微生物學和免疫學雜志,2012,32(4):378-380.

[23] Pick E.Role of the Rho GTPase Rac in the activation of the phagocyte NADPH oxidase: outsourcing a key task[J].Small Gtpases,2014,5(1):e27952.

[24] Abo A,Webb M R,Grogan A,et al.Activation of NADPH oxidase involves the dissociation of p21rac from its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rhoGDI) followed by its translocation to the plasma membrane[J].Biochem J,1994,298(3):585-591.

[25] O′brien L,Carmichael J,Lowrie D B,et al.Strains ofMycobacteriumtuberculosisdiffer in susceptibility to reactive nitrogen intermediates in vitro[J].Infect Immun,1994,62(11):5187-5190.

[26] 劉丹霞,董偉杰,庹清章,等.不同毒力結核分枝桿菌對感染宿主巨噬細胞應激的調控作用研究[J].中國病原生物學雜志,2013(3):217-219.

[27] Forlenza M,Fink I,Raes,R G,et al.Heterogeneity of macrophage activation in fish[J].Dev Comp Immunol,2001,35(12):1246-1255.