李 超，李 誠，王冰冰，張潤琪，李春艷

(石河子大學農(nóng)學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)國家重點實驗室培育基地，新疆石河子 832000)

小麥籽粒胚乳細胞的充實及發(fā)育狀況與胚乳細胞的程序性死亡(PCD)進程密切相關(guān)，并受細胞內(nèi)源激素乙烯的影響[1]。小麥花后干旱打破了乙烯與其他內(nèi)源激素的平衡，加快了胚乳細胞程序性死亡進程，導致籽粒灌漿時間縮短，灌漿不充分，籽粒干癟，產(chǎn)量下降[2-3]。探明干旱脅迫下小麥胚乳PCD變化特征，可為通過栽培措施延緩干旱脅迫下胚乳PCD進程提供理論基礎。

小麥胚乳細胞是蛋白質(zhì)和淀粉合成與積累的主要場所[4]。胚乳細胞的分裂、分化與充實狀況，對粒重乃至品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用[5-6]。在小麥籽粒灌漿過程中，隨著代謝物的積累貯藏，淀粉胚乳細胞啟動程序性死亡，最終導致在成熟的籽粒中只有胚和糊粉層細胞保持活力[7-9]。植物激素之間的相互作用與外界環(huán)境信號及細胞自身發(fā)育程序共同構(gòu)成了一個精確而復雜的調(diào)控網(wǎng)絡[10-11]。對激素調(diào)控途徑及其分子機制的全面認識，有助于更好地了解激素在植物生長發(fā)育中的作用[12]。植物內(nèi)源激素乙烯(ETH)對禾谷類作物胚乳PCD及灌漿過程具有明顯的調(diào)控作用[2]。Young等[1,13]研究發(fā)現(xiàn)，ETH參與調(diào)控小麥和玉米胚乳PCD的進程，外源ETH可誘導小麥和玉米胚乳PCD提前出現(xiàn)，抑制ETH合成物質(zhì)——氨基氧乙烯會使胚乳細胞DNA片段化明顯推遲。Rantong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，水蕹葉中高含量的乙烯和低表達量的乙烯受體是導致葉子發(fā)生程序性死亡和葉穿孔的關(guān)鍵因素。Gallie等[15]推測，高表達量的乙烯受體可限制胚乳細胞的死亡速率，使胚乳細胞有足夠的時間來保證貯藏物質(zhì)的合成。近年來，關(guān)于乙烯調(diào)控PCD進程的研究取得了一定進展，但是花后干旱脅迫下乙烯對小麥胚乳PCD的調(diào)控機理尚不明確。本研究抑通過人工干預措施調(diào)節(jié)小麥籽粒灌漿中乙烯的合成，以明確乙烯對小麥胚乳PCD的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

選用新疆主栽冬小麥品種新冬18號為試驗材料，種子由石河子大學冬小麥課題組提供。新冬18號為冬性中熟品種，生育期273 d左右。試驗于2015-2016在石河子大學農(nóng)學院試驗站(44°17′N，86°03′E，海拔461 m)進行。采用隨機區(qū)組設計，小區(qū)面積為7 m2。所有試驗小區(qū)從播種至開花前采用相同于大田滴灌種植的管理方式，開花后干旱處理采用遇陰雨天搭遮雨棚，開花至成熟期停止田間灌水。抑制乙烯合成處理在花后干旱脅迫開始的第9天進行，在小麥穗部噴施含5×10-5mol·L-1硝酸鈷(乙烯合成抑制劑)、0.1%(v/v)乙醇和0.1%(v/v)Tween20的蒸餾水溶液，用量800 mL·m-2；對照噴施等量含0.1%(v/v)乙醇和0.1%(v/v)Tween20的蒸餾水溶液。每天下午六點噴施，連續(xù)噴施7 d，3個重復。開花當天選取同天開花、長勢一致的麥穗掛牌標記。分別于小麥開花后5、10、15、20、25、30和35 d取穗中上部籽粒，一部分籽粒用固定液固定備用；一部分立即置于液氮中速凍5 min，再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；另一部分?05 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重備用。

1.2 胚乳細胞活力檢測

參考Young等[1]方法將不同發(fā)育時期的新鮮小麥籽粒用刀片橫切，置于 0.1%的 Evan’s Blue 水溶液中浸染 2 min，雙蒸水浸洗 1 h，轉(zhuǎn)至粘附載玻片上，體視顯微鏡(Zeiss Discovery V20，Germany)觀察并拍照。

1.3 胚乳細胞細胞核形態(tài)觀察

參考安麗華和尤瑞麟[16]的方法對所取樣品進行包埋和切片。取不同時期的小麥籽粒用2.0%戊二醛固定液固定，乙醇逐級脫水，將純Steedman’s wax和 1-hexadecanol (十六醇)按重量比9∶1 混合作為包埋劑，包埋塊在石蠟切片機(Kedee，1508A，China)上切成10 μm厚的切片。切片經(jīng)乙醇脫蠟后放在滴有一滴雙蒸水的粘附載玻片上，滴DAPI(1 μg·mL-1)染液，蓋玻片封片，吸水紙吸掉蓋玻片四周多余染液，用體視顯微鏡觀察并拍照。

1.4 胚乳基因組DNA完整性檢測

用植物基因組DNA提取試劑盒EasyPure Plant Genomic DNA(Transgen, China) 提取不同時期籽粒胚乳基因組DNA。核酸蛋白分析儀(NanoDrop，USA)檢測基因組DNA的純度和濃度。3.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行片段化檢測，各時期各處理保持上樣量一致，銀染法染色觀察。

1.5 胚乳細胞細胞核的計數(shù)

參考Singh等[17]的方法并稍作修改。取4個小麥籽粒，剝除種皮和種胚，在卡諾氏固定液中固定24 h，儲存在70%酒精中備用。將固定好的材料經(jīng)系列濃度的酒精復水、60 ℃水浴、HCl處理、錫夫試劑黑暗染色。水洗后0.5%纖維素酶酶解過夜；用水將酶解液定容至10 mL，混勻后吸取0.5 mL于10 mL水中，通過微孔濾膜(孔徑0.22 μm，直徑13 mm)抽濾，將濾膜放置在滴有甘油的載玻片上，在光學顯微鏡下觀察被染紅的細胞核數(shù)目，每個樣本計10個視野。

1.6 胚乳核酸酶活性、核酸含量測定

核酸酶活性測定參考楊 莉等[18]的方法；核酸含量參照朱廣廉等[19]的方法測定。

1.7 胚乳細胞超微結(jié)構(gòu)觀察

超薄切片的制備參照李和平[20]的方法，切片用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡(JEMTEM 100CX II，Japan)觀察與拍照。

1.8 籽粒粒重測定

籽粒粒重測定參考蘭盛銀等[21]的方法，取不同發(fā)育時期的穎果，105 ℃下殺青 30 min 后 80 ℃下烘至恒重，計算籽粒的千粒重。

1.9 乙烯受體基因相對表達量的測定

1.9.1 引物設計

用Primer Premier 5.0，根據(jù)NCBI公布的乙烯受體基因序列設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物的合成。用小麥actin基因(NCBI編號DN551593)作為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.9.2 RNA的提取和cDNA的合成

將保存于-80 ℃冰箱的新鮮樣品于液氮中研磨，用Fruit-mate(Takara, Japan)和RNAiso plus (Takara，Japan)試劑盒按說明書提取RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取的總RNA完整性。用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(Tiangen, China)合成cDNA，用合成的cDNA作為模板擴增actin基因以檢驗其完整性。

1.9.3 基因的相對表達量測定

使用SYBR Green I Master 試劑盒 (Roche，USA)，用實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler 480 Ⅱ)擴增各個基因，具體操作按說明書進行。

1.10 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2003和 SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理?；蛳鄬Ρ磉_量按下面的公式計算：

△Ct=Ct1-Ct2

相對表達量=2-△Ct

式中：△Ct為目標基因與內(nèi)參基因的差值；Ct1為目標基因；Ct2為內(nèi)參基因。

表1 引物序列表Table 1 Information of the primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鈷對小麥胚乳細胞活力的影響

從圖1中可以看出，兩個處理在灌漿初期(花后10 d)胚乳細胞不著色，其著色部位主要集中在果皮(圖A1)?；ê?5 d胚乳開始著色(圖A2)，隨著灌漿進程的推移著色逐漸加深(圖A3、A4)。硝酸鈷處理下小麥花后15、20、25 d胚乳細胞著色程度(B2-B4)明顯低于同時期的對照。說明噴施硝酸鈷可使胚乳細胞的活力有所提高。

2.2 硝酸鈷對小麥胚乳細胞核形態(tài)的影響

從圖2中可以看出，花后20 d對照胚乳細胞的細胞核發(fā)生了變形，噴施硝酸鈷時小麥花后20 d細胞核形態(tài)基本保持正常，體積小且呈規(guī)則圓球形(圖2A1, B1)；花后25 d對照細胞核變形明顯，而噴施硝酸鈷時小麥胚乳細胞的正常細胞核比例明顯高于對照處理(圖2A2,B2)?；ê?0 d，對照中已基本觀察不到形態(tài)正常的細胞核，但硝酸鈷處理仍可以觀察到形態(tài)正常的細胞核(圖2A3, B3)?；ê?5 d，可以觀察到分布在淀粉粒之間的細胞核殘體，硝酸鈷處理的細胞核殘體數(shù)量明顯多于對照(圖2A4, B4)。說明噴施硝酸鈷可使小麥胚乳細胞的細胞核變形解體速度減緩。

A1～A4分別為對照花后10、15、20和25 d籽粒胚乳橫切面；B1～B4分別為噴施硝酸鈷處理下花后10、15、20和25 d籽粒胚乳橫切面。SE:胚乳；P:種皮。

A1-A4 were the grain endosperm cross-section at 10, 15, 20 and 25 days after anthesis under control; B1-B4 were grain endosperm cross-section treated with cobalt nitrate at 10, 15, 20 and 25 days after anthesis; SE:Endosperm; P:Pericarp.

圖1小麥籽?；ê蟛煌瑫r期的Evan’sBlue染色圖

Fig.1PictureofEvan’sBluestainingofwheatatdifferentstagesafteranthesis

A1～A4分別為對照花后20、25、30和35 d；B1～B4分別為噴施硝酸鈷處理組花后20、25、30和35 d。放大倍數(shù)為150倍。

A1-A4 were control at 20, 25, 30 and 35 days after anthesis, respectively; B1-B4 were sprayed with cobalt nitrate at 20, 25, 30 and 35 days after anthesis, respectively, with the magnification of 150 times.

圖2小麥胚乳細胞的DAPI染色圖

Fig.2PictureofDAPIstainingofwheatendospermcells

2.3 小麥胚乳細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

對不同發(fā)育時期的小麥胚乳細胞進行透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，干旱條件下，花后15 d，對照的細胞核變形比較嚴重，但核仁較為明顯；硝酸鈷處理的細胞核變形不明顯，只觀察到了輕微的核膜內(nèi)陷(圖3A1, B1)?；ê?0 d，對照的細胞核被淀粉粒包裹，核仁消失，異染色質(zhì)增多，核質(zhì)濃縮；硝酸鈷處理的染色質(zhì)也發(fā)生了濃縮，但核仁仍在，細胞核形態(tài)仍表現(xiàn)正常形態(tài)(圖3A2, B2)?；ê?5 d，對照的細胞核解體消失，只剩下核殘體分布在淀粉顆粒之間；硝酸鈷處理的細胞核核質(zhì)濃縮，但仍可以觀察到細胞核的存在(圖3A3, B3)。說明噴施硝酸鈷可使胚乳細胞核變形和降解速度明顯變緩，這與DAPI染色觀察到的結(jié)果一致。

A1～A3分別是對照花后15、20和25 d的胚乳細胞核；B1～B3 分別是噴施硝酸鈷花后15、20和25 d的胚乳細胞核。圖A1和A3中箭頭指向核膜內(nèi)陷；圖A3中箭頭指向細胞核殘體。n：細胞核；s：淀粉粒；v：液泡；p：蛋白質(zhì)。

A1-A3 were the endosperm nuclei of the control treatment at 15, 20 and 25 days after anthesis, respectively；B1-B3 were the endosperm nuclei of cobalt nitrate treatment at 15, 20 and 25 days after anthesis, respectively. The arrows in A1 and A3 point to nuclear membrane retraction; The arrow in A3 point to the nucleus remnant. N:Nucleus; S:Starch; V:Vacuole; P:Protein.

圖3小麥胚乳細胞核的超微結(jié)構(gòu)變化

Fig.3Ultra-structuralmorphologicalchangesofnucleusinwheatstarchyendosperm

2.4 硝酸鈷對小麥胚乳細胞DNA完整性的影響

基因組DNA特異片段化是PCD的典型標志。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行DNA片段化的檢測(圖4)發(fā)現(xiàn)，在花后20 d可以檢測到胚乳細胞DNA特意片段，但不十分明顯，隨著灌漿時期的推移，片段化程度加深，對照在花后30 d胚乳細胞DNA片段化達到最大程度，35 d DNA片段化程度減弱。硝酸鈷處理的胚乳細胞達到片段化最大程度的時期推遲到花后35 d，且片段化最大程度明顯弱于對照組。說明花后噴施硝酸鈷可有效延緩胚乳細胞DNA片段化峰值出現(xiàn)的時間。

5～35：開花后天數(shù)；M:DNA 標準分子量；DPA:花后天數(shù)。

5-35：Days after anthesis；M:DNA Marker;DPA:Days after anthesis.

圖4小麥籽?；蚪MDNA的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜

Fig.4PolyacrylamidegelelectrophoresismapofgenomicDNAinwheatgrain

2.5 小麥胚乳細胞細胞核的數(shù)目變化

為了觀察小麥胚乳PCD過程中胚乳細胞數(shù)量變化, 對花后各時期胚乳細胞核數(shù)目進行了統(tǒng)計。如圖5所示，兩個處理的胚乳細胞核數(shù)量變化趨勢相同，開花后5～10 d是胚乳細胞核快速增殖期，花后20 d達到峰值后開始迅速減少。硝酸鈷處理的花后15、20和30 d胚乳細胞核數(shù)目顯著高于對照。說明在干旱脅迫下噴施硝酸鈷可以顯著增加胚乳細胞數(shù)目，減緩灌漿后期胚乳PCD發(fā)生速率。

2.6 小麥胚乳細胞DNA水解酶活性變化

為了進一步研究噴施硝酸鈷對胚乳PCD的影響，測定了花后不同時期小麥籽粒DNA水解酶活性。結(jié)果如圖6所示，在干旱條件下噴施硝酸鈷可明顯降低各時期小麥籽粒中DNA水解酶的活性。兩個處理的DNA水解酶活性變化趨勢相同，均呈先增后降的單峰曲線，在花后30 d DNA水解酶活性達到峰值。在硝酸鈷處理下，在花后15、20、25和30 d，DNA水解酶活性顯著低于對照，但在花后35 d顯著高于對照，這可能是由于噴施硝酸鈷在花后35 d仍有較多胚乳細胞未完全死亡，仍需較多核酸水解酶。在相同時期，噴施硝酸鈷處理的DNA水解酶活性顯著低于對照，且DNA水解酶活性升高時伴隨DNA片段化高發(fā)，說明噴施硝酸鈷可以顯著降DNA水解酶活性，進而降低DNA片段化程度。

2.7 乙烯受體蛋白基因表達的變化

不同處理下乙烯受體蛋白基因的相對表達量

*和**分別代表處理間在0.05和0.01水平差異顯著。下同。

* and ** represent significant difference at 0.05 and 0.01 level between treatments,respectively. The same in figure 5, 6 and table 1.

圖5小麥胚乳細胞的細胞核數(shù)目

Fig.5Numberofnucleiofwheatendospermcell

如圖7所示。硝酸鈷處理下 ers1基因在花后15、20、30和35 d表達量顯著高于對照， ers2基因在花后25、30和35 d表達量顯著高于對照， etr1基因表達量在花后20、30和35 d顯著高于對照， etr2基因表達量在花后25～35 d顯著高于對照。 ers1和 etr2基因表達量低峰值均出現(xiàn)在灌漿中期(15～25 d)， etr1基因表達量低峰值出現(xiàn)在花后20和25 d。在小麥灌漿過程中，四個乙烯受體基因表達模式不盡相同，但硝酸鈷處理較對照的表達量呈顯著上調(diào)趨勢，且乙烯受體蛋白表達峰值主要出現(xiàn)在灌漿后期。

圖6 小麥籽粒核酸水解酶活性

2.8 小麥千粒重的變化

由表 1可知，在花后10、15和25 d，硝酸鈷處理的小麥千粒重極顯著高于對照；花后35 d，硝酸鈷處理的小麥千粒重顯著高于對照組；花后20和30 d兩處理組間千粒重無顯著差異?；ê?5～25d是胚乳細胞PCD快速發(fā)生的階段，在這一階段兩個處理的千粒重增加幅度都比較大?；ê?0～35 d，胚乳細胞基本死亡，粒重幾乎無增加。

圖7 不同處理下小麥不同發(fā)育時期籽粒中乙烯受體基因的相對表達量

花后天數(shù)Daysafteranthesis/d對照Control/g噴施硝酸鈷Sprayingcobaltnitrate/g105．36±0．347．95±0．13??1510．48±0．4612．19±0．27??2024．66±0．1124．80±0．622537．30±0．6238．59±0．84??3039．56±0．1942．15±1．013539．92±0．4942．27±0．83?

3 討 論

胚乳是小麥籽粒貯藏物質(zhì)(淀粉和蛋白)的主要積累部位，占籽粒重量85%以上，胚乳的發(fā)育狀況對粒重乃至品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用[22]。胚乳細胞的發(fā)育伴隨著貯藏物質(zhì)的積累和胚乳PCD的過程，Young[1]和Fan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，小麥胚乳PCD在籽粒灌漿的早期即開始出現(xiàn)，且PCD發(fā)生部位是隨機的。本研究通過Evan’s Blue染色發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下花后15 d胚乳細胞即開始發(fā)生PCD直到籽粒成熟，這與Young[1]和Fan等[23]的研究結(jié)果一致；對花后干旱脅迫的小麥穗部噴施硝酸鈷發(fā)現(xiàn)，同一時期細胞活力有所提高。Young[1]和李 睿等[2]研究發(fā)現(xiàn)，對小麥穗部噴施外源乙烯能夠加速胚乳PCD，使DNA片段化程度加深。本研究結(jié)果顯示，噴施硝酸鈷小麥胚乳細胞DNA片段化程度有所減弱，且達到片段化峰值時間推后，這與Young[1]和李 睿等[2]的研究結(jié)果一致。說明在灌漿期間對小麥穗部噴施乙烯合成抑制劑可以提高胚乳細胞活力，推遲和減弱DNA片段化，延緩胚乳PCD進程。

本研究通過對花后各發(fā)育時期的小麥胚乳細胞核染色和細胞核超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，胚乳PCD過程伴隨著細胞核的衰退和解體。在成熟胚乳細胞中，細胞核殘體仍然可見，這與韋存虛等[24]在大麥和Chen等[25]在小麥中的研究結(jié)果一致。但水稻胚乳PCD過程中，胚乳細胞首先完成去核化(花后12 d)，且細胞核衰退和解體的同時也是灌漿速率最大化的時期，胚乳細胞完成去核化后灌漿速率顯著下降[21]。本研究結(jié)果顯示，小麥胚乳PCD快速發(fā)生期是千粒重增加的高峰時期，說明延長胚乳細胞核衰退和解體時間可以延長籽粒灌漿期。通過對小麥穗部噴施硝酸鈷發(fā)現(xiàn)，胚乳細胞細胞核的衰退速度有所下降，且最大胚乳細胞數(shù)目明顯增加。噴施硝酸鈷能夠明顯降低胚乳細胞中核酸水解酶活性，進而延緩細胞核衰退的時間。說明噴施硝酸鈷可降低籽粒中乙烯含量，進而降低了核酸水解酶活性使DNA片段化推遲，增加了后期胚乳發(fā)育所需要的基因轉(zhuǎn)錄，使得淀粉合成和蛋白積累增多，進而使籽粒粒重增加。

Rantong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯和乙烯受體水平是影響細胞PCD的關(guān)鍵因素。乙烯受體是調(diào)節(jié)乙烯通路的負調(diào)節(jié)子，與乙烯結(jié)合后就會失去活性[26]。當任意一個乙烯受體發(fā)生突變，植物對乙烯的反應不會發(fā)生很大變化，說明這五個受體雖然結(jié)構(gòu)不同，但功能相似、可以相互替代；而當5個受體基因全部突變后,植物會組成性地表現(xiàn)對乙烯的反應[27]。本研究結(jié)果顯示，在籽粒灌漿中期(花后15～25 d)，乙烯受體的整體表達量下降，暗示造成胚乳細胞PCD所需要的乙烯的閾值下降，而此時正是胚乳PCD快速發(fā)生時期; 這表明低表達量的乙烯受體是導致胚乳發(fā)生PCD的重要因素。噴施硝酸鈷后，灌漿中后期乙烯受體表達量明顯上調(diào)，推測噴施硝酸鈷不僅可以抑制乙烯生成，還可以增加胚乳PCD發(fā)生所需要的乙烯閾值水平。

本研究結(jié)果表明，在花后干旱脅迫下，對小麥穗部噴施硝酸鈷(乙烯合成抑制劑)可以降低小麥胚乳細胞中核酸水解酶活性，增加胚乳細胞數(shù)量，延緩胚乳PCD進程，進而延長灌漿時間，增加粒重。這為探索小麥灌漿期通過栽培措施調(diào)節(jié)小麥籽粒中內(nèi)源激素水平，以應對花后干旱環(huán)境對小麥籽粒灌漿帶來的危害，從而為小麥的增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

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