吳 斌，姜珊珊，張 眉，王升吉，趙玖華，徐德坤，辛相啟

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.臨沂市植物保護(hù)站，山東臨沂 276000)

小麥土傳花葉病毒病是危害冬小麥的一種重要病害，該病害由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)以持久性方式傳播。感病小麥植株癥狀表現(xiàn)為葉片褪綠、黃化，分蘗減少，植株矮縮，拔節(jié)、返青期推遲，成穗率低，一般可造成減產(chǎn)30%左右，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[1]。小麥土傳花葉病毒病于1958年在中國山東省榮成市埠柳鎮(zhèn)不夜村首次被發(fā)現(xiàn)，自20世紀(jì)70年代，該病害發(fā)生逐年加重，引起了廣泛重視[2-3]。其病原主要是小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)、中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)、小麥梭條斑花葉病毒(Wheat spindle streak virus, WSSMV)和土傳小麥花葉病毒(Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV),在我國，沒有發(fā)現(xiàn)WSSMV和SBWMV[4-7]。WYMV是大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)成員，主要分布在河南、山東、江蘇、陜西、湖北、安徽6省[8]；CWMV為真菌傳桿狀病毒屬(Furovirus)成員[9]，主要分布在山東膠東半島、江蘇大豐等冬小麥產(chǎn)區(qū)[10-12]。

近年來隨著作物耕作制度和推廣品種抗性變化，小麥土傳花葉病毒病已成為河南、山東、江蘇和安徽等省市小麥生產(chǎn)中存在的重要問題，全國常年發(fā)生面積約200萬hm2，嚴(yán)重威脅中國小麥安全生產(chǎn)。2009年小麥土傳花葉病毒病在山東臨沂、棗莊等地突發(fā)，且有蔓延加重趨勢；2012年山東全省發(fā)病面積約5 600 hm2，毀種面積86.7 hm2；2013年全省發(fā)病面積達(dá)6 600余hm2；2014年僅臨沂市發(fā)病面積就達(dá)4 000 hm2左右，棗莊市發(fā)病面積約3 330 hm2，給當(dāng)?shù)匦←溕a(chǎn)帶來巨大損失[13]。小麥土傳花葉病毒病的發(fā)生、流行受品種抗病性、氣候條件和栽培方式等多種因素的影響，目前有效的防治方法是使用抗病品種[14-15]。在小麥品種推廣過程中，由于對小麥品種抗該病害的抗性評價(jià)重視不夠，造成感病品種在病區(qū)大面積種植，促使病害蔓延流行[16]。山東冬小麥種植區(qū)環(huán)境差異較大，栽培方式復(fù)雜多樣，品種抗病性差異大，CWMV可能存在更多不同的致病株系[17]。針對山東省小麥土傳花葉病毒病的分布、毒原鑒定等尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究于2013-2016年基于田間調(diào)查，結(jié)合斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測定法(dot-Enzyme linked immunosorbent assay, dot-ELISA)和反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測法，對山東省小麥土傳花葉病毒病的分布、主要的病原種類以及CWMV的系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析，以期為該區(qū)小麥品種的合理布局提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 田間調(diào)查與樣品采集

于2013-2016年每年3月中上旬至4月上旬，在小麥土傳花葉病毒病發(fā)生盛期，對山東省小麥主要種植區(qū)的70多個縣市進(jìn)行該病害發(fā)生危害情況調(diào)查，采集疑似病毒侵染的小麥樣品512份，放入超低溫(-80 ℃)冰箱冷凍保存，用于病毒病原檢測。

1.2 Dot-ELISA檢測

對采集的疑似病樣進(jìn)行dot-ELISA檢測，以健康小麥(濟(jì)麥22)葉片為陰性對照，以緩沖液為空白對照。樣品按1∶10(w/v)加入磷酸鹽緩沖液，研磨成漿，8 000 r·min-1離心3 min，取上清即為待檢樣品。一抗分別為WYMV和CWMV抗兔血清(由浙江省農(nóng)科院病毒與生物技術(shù)研究所饋贈)，二抗為羊抗兔IgG-堿性磷酸酶(Sigma公司，美國)。

1.3 小麥樣品總RNA的提取

稱取冷凍小麥樣品材料0.1 g放入盛有液氮的研缽中研磨成粉末，加入1 mL Trizol溶液(Invitrogen公司，美國)劇烈振蕩，室溫靜置10 min；加入200 μL氯仿劇烈振蕩，室溫靜置5 min；12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清；加入600 μL異丙醇，室溫靜置15 min；12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min；用75%(v/v)乙醇洗滌兩次，8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min；加入適量DEPC處理雙蒸水(DNase/RNase-free ddH2O)，65 ℃溶解RNA 10～15 min，-80 ℃保存。同時(shí)提取健康小麥葉片總RNA作為健康對照。

1.4 RT-PCR檢測

根據(jù)已報(bào)道的WYMV和CWMV外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以提取的待檢樣品總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在RNase-free的0.2 mL離心管中依次加入總RNA 5 μL，Random Primer 1 μL，DEPC-treated ddH2O 6 μL，65 ℃水浴5 min后迅速置于冰上，加入5×buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV reverse transcriptase 1 μL，25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，反應(yīng)得到的cDNA保存于-20 ℃。

取cDNA 1 μL，加入10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，Taq酶(5 U/ μL)0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 WYMV和CWMV的特異引物Table 1 Primers for wheat yellow mosaic virus and Chinese wheat mosaic virus in this study

1.5 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及分析

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit，TransGen Biotech, 北京)回收目的片段，并與pMD18-T載體(Takara，日本)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，通過PCR鑒定后，送樣于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。借助軟件DNAstar(ver. 7.10)和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行基因同源性分析，利用MEGA 5軟件鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對選定的CWMV的CP(coat protein)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹中各分支置信度(Bootstrap)進(jìn)行1 000 次重復(fù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥土傳花葉病毒病的病原種類

對2013-2016年采集的疑似小麥土傳花葉病毒病樣品進(jìn)行dot-ELISA檢測結(jié)果(圖1，圖2，表2)表明，山東小麥土傳花葉病毒病的病原為WYMV和CWMV。對dot-ELISA檢測結(jié)果為WYMV和CWMV陽性的樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，WYMV陽性的樣品均擴(kuò)增出約740 bp的特異條帶(圖3)，與預(yù)期目的片段長度一致；CWMV陽性樣品中均擴(kuò)增出大小約375 bp的特異條帶，與預(yù)期的目的片段長度一致，WYMV和CWMV陰性樣品和健康植株葉片均未擴(kuò)增出相對應(yīng)的特異條帶。

點(diǎn)陣A1～A11、B1～B11、C1～C8、D1～D11和E1～E11為魯南地區(qū)52個樣品；點(diǎn)陣C9、C10和C11分別為陽性、陰性和空白對照。

A1-A11, B1-B11, C1-C8, D1-D11 and E1-E11 were 52 diseased samples from the south of Shandong. C9,C10 and C11 were positive control, negative control and blank control, respectively.

圖1小麥土傳花葉病毒病病葉部分樣品WYMV的dot-ELISA檢測結(jié)果

Fig.1ImageofWYMVdetectedinthediseasedleafsamplesbydot-ELISA

A1～A11、B1～B11、C1～C11和D1～D8為魯東41個樣品；D9、D10和D11分別為陽性對照、陰性對照和空白對照。

A1-A11, B1-B11, C1-C11 and D1-D8 were 41 samples from the east of Shandong province; D9, D10 and D11 were positive control, negative control and blank control, respectively.

圖2山東省小麥土傳花葉病毒病部分樣品CWMV的dot-ELISA檢測結(jié)果

Fig.2ImageofCWMVdetectedindiseasedleafsamplesbydot-ELISA

2.2 WYMV和CWMV在田間的分布

dot-ELISA檢測和RT-PCR檢測的結(jié)果(表2，圖4)表明，小麥土傳花葉病毒病主要分布在魯南地區(qū)，魯東、魯中和魯北地區(qū)均有零星分布。臨沂市、棗莊市、濟(jì)寧市、泰安市、濰坊市、日照市、淄博市和濟(jì)南市的主要病原為WYMV，其中在濟(jì)南市長清區(qū)首次檢測到WYMV。CWMV主要分布在煙臺市、威海市、青島市、德州市和臨沂市，其中德州市平原、臨沂市沂水縣和莒南縣為CWMV新發(fā)現(xiàn)的病區(qū)。煙臺市福山區(qū)、威海市榮成市、文登市、青島市膠州市和臨沂莒南縣檢測到此兩種病毒復(fù)合侵染。在濰坊昌邑、青島平度等早期報(bào)道的病區(qū)，并未檢測出小麥土傳花葉病毒病。

表2 山東小麥土傳花葉病毒病dot-ELISA檢測結(jié)果Table 2 Result of wheat soil-borne virus disease in Shandong province by dot-ELISA

A:WYMV的RT-PCR檢測；B:CWMV的RT-PCR檢測； 1～12:12個樣品；M:DL2000Marker；N:陰性對照。

A:Image of WYMV tested by RT-PCR; B:Image of CWMV tested by RT-PCR; 1-12:12 samples; M:DL2000 Marker; N:Negative control.

圖3WYMV和CWMV部分RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.3ImagesofpartRT-PCRforWYMVandCWMV

圖4 WYMV(■)和CWMV(▲)在山東的分布情況

2.4 CWMV的進(jìn)化分析

對分屬于7個地市的CWMV陽性樣品進(jìn)行CP基因全序列克隆及測序分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的CP基因有531個核苷酸，編碼176個氨基酸。對獲得的序列進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，7個被測CP基因的同源性為94.7%～98.3%。

對所獲得的7個分離物和已報(bào)道的CWMV構(gòu)建CP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖5)表明，煙臺福山(YT)、文登(WD)、平原(PY)、莒南(JN)4個分離物與日本分離物(GenBank accession No.:AB299272.1)聚類為一簇；榮成(RC)、膠州(JZ)、沂水(YS)與江蘇分離物(JS2006)聚類為一簇，所形成的分枝與地理來源無明確關(guān)系。

3 討 論

小麥土傳花葉病毒病是近年來危害山東冬小麥生產(chǎn)、且呈逐年加重趨勢的重要病害，研究該病害的分布和病原種類可為小麥抗病品種的合理布局和病害防控提供依據(jù)。本研究通過田間調(diào)查，結(jié)合dot-ELISA和RT-PCR檢測方法，系統(tǒng)分析了小麥土傳花葉病毒病在山東省的最新發(fā)生狀況與地理分布及各病區(qū)的病原種類。發(fā)現(xiàn)小麥土傳

YT:煙臺株系；WD:文登株系；PY:平原株系；JN:莒南株系；RC:榮成株系；JZ:膠州株系；YS:沂水株系。

JN:Junan strain; PY:Pingyuan strain; YT:Yantai strain; WD:Wendeng strain; YS:Yishui strain; JZ:Jiaozhou strain; RC:Rongchen strain.

圖5CWMV中CP基因的臨近法系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.5PhylogeneticanalysisoftheCWMVCPgenesbyNeighbor-Joining

花葉病毒病在魯南、魯東、魯中和魯北地區(qū)均有分布，其中，魯南地區(qū)仍為小麥土傳花葉病毒病的主要發(fā)病區(qū)，德州平原和濟(jì)南長清為新發(fā)現(xiàn)病區(qū)；臨沂沂水、莒南地區(qū)由早期報(bào)道的WYMV單獨(dú)侵染發(fā)展為WYMV與CWMV復(fù)合侵染?？傮w上來講，該病害在山東省發(fā)病呈蔓延傳播趨勢。

小麥土傳花葉病毒病的發(fā)生與耕作方式和氣候等多個因素密切相關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，同一地點(diǎn)不同年份該病害發(fā)病情況存在明顯差異。此外，小麥推廣品種的抗病性也是影響小麥土傳花葉病毒病分布的重要因素[18-20]。在WYMV發(fā)生較為嚴(yán)重的臨沂和棗莊地區(qū)，種植的小麥品種多為易感病品種臨麥4號，而在濰坊昌邑等老病區(qū)，由于近年來推廣的小麥品種多為抗病品種濟(jì)麥22[21]，因此，該病害在此地區(qū)發(fā)生呈減弱趨勢。目前，在小麥品種的選育、區(qū)試和推廣過程中，缺乏對小麥土傳花葉病毒病的抗性評價(jià)，大面積推廣和種植感病品種后，造成小麥土傳花葉病毒病大規(guī)模發(fā)生流行，發(fā)病區(qū)域范圍擴(kuò)大。同時(shí)，粘附病菌的麥種通過種子調(diào)運(yùn)和農(nóng)業(yè)機(jī)械大范圍跨區(qū)作業(yè)途徑加劇了該病害的蔓延傳播。因此，加強(qiáng)對小麥品種抗小麥土傳花葉病毒病抗病性評價(jià)尤為重要，特別是在病害重發(fā)區(qū)。明確小麥主栽品種抗病性，篩選高抗品種資源，因地制宜，提出適合不同地區(qū)的小麥土傳花葉病毒病防控體系，科學(xué)指導(dǎo)小麥抗病品種的種植和推廣，加強(qiáng)調(diào)種、引種機(jī)制及農(nóng)機(jī)大范圍跨區(qū)作業(yè)制度的規(guī)范管理，可有效控制小麥土傳花葉病毒病的發(fā)生和蔓延，為該病害合理有效的防控提供保障。

對山東省7個地市CWMV的CP基因的克隆豐富了基因資源庫，為小麥土傳花葉病毒病的病原群體動態(tài)積累了資料。CWMV 的CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，山東省各個病害樣品分離物的基因序列一致率較高，同源性大于90%；基因聚類結(jié)果表明，分離物與地域來源并無明確關(guān)系。進(jìn)一步開展對不同地區(qū)CWMV的遺傳結(jié)構(gòu)研究分析，以明確病毒的進(jìn)化機(jī)制，對預(yù)測病害的流行趨勢和制定有效的控制措施均具有指導(dǎo)意義。

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