三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低鹽脅迫中的表達(dá)特征分析*

張 杰 呂建建 劉 萍① 李 健 王竹青 張小輝

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)動物，在中國、朝鮮、日本等海域均有分布，在我國黃渤海及東海分布尤為廣泛(薛俊增等,1997)。由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、水體環(huán)境污染加重、累代養(yǎng)殖造成的種質(zhì)退化，三疣梭子蟹的病害也日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(高保全等, 2015)。研究表明，對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)均會造成三疣梭子蟹組織病變乃至死亡(王忠發(fā)等, 2008; 閻斌倫等,2010)。此外，鹽度作為一種重要的水體環(huán)境因子，也對三疣梭子蟹的免疫功能產(chǎn)生較大影響。三疣梭子蟹等甲殼動物在水體鹽度發(fā)生急劇變化時(shí)，可能會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)和生理代謝紊亂，導(dǎo)致其免疫力下降，從而促使病害暴發(fā)并造成大量死亡(王林等, 2016; 付萍等, 2016)。然而，三疣梭子蟹等無脊椎動物沒有類似于哺乳動物的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，因此，其不具有獲得性免疫系統(tǒng)(Uematsuset al, 2008)，但可以依賴獨(dú)特的先天性免疫系統(tǒng)通過免疫信號通路級聯(lián)反應(yīng)清除入侵機(jī)體的病原微生物。

三疣梭子蟹等甲殼動物的先天免疫是由 Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)等模式識別受體(Pathogen recognize receptors, PRRs)所介導(dǎo)(Cartyet al,2010)，通過識別保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，啟動先天性免疫應(yīng)答(Aderemet al, 2000)。Toll受體蛋白于1980年首次在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)，參與果蠅背腹側(cè)軸形成，缺失 Toll受體蛋白會引起果蠅成體不對稱(Nusslein-Volhardet al, 1980)。Hoffmann 等(1996)發(fā)現(xiàn)并證實(shí) Toll受體蛋白在先天免疫中起到了重要作用。各物種的Toll樣受體都具有多名成員，目前，已在果蠅中發(fā)現(xiàn)了9種類型的Toll受體蛋白，而在哺乳動物中也有13種Toll樣受體被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)(Iwasakiet al,2004; Bilaket al, 2003)。

目前，TLRs家族基因在哺乳動物和果蠅中已有較為深入的研究，但在甲殼動物中，TLRs家族基因的研究還處于起步階段。Yang等(2007)在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中發(fā)現(xiàn)了一個Toll樣受體，命名為LvToll，這是在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的首個TLRs家族基因。目前，在三疣梭子蟹中僅發(fā)現(xiàn)了 3種 Toll樣受體(Zhouet al, 2015)。

為進(jìn)一步完善TLRs基因家族在三疣梭子蟹先天免疫中發(fā)揮的功能，本研究利用RACE技術(shù)克隆了一個新的三疣梭子蟹TLRs家族基因，命名為PtToll4，并對其序列進(jìn)行分析，闡明了其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了經(jīng)副溶血弧菌和WSSV感染后，PtToll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)變化。此外，初步探究了低鹽脅迫對PtToll4基因表達(dá)量的影響。旨在為進(jìn)一步研究PtToll4基因在三疣梭子蟹先天免疫中發(fā)揮的功能提供理論支持。

（1）加強(qiáng)巡查力度，對新投入的改進(jìn)裝置及時(shí)維護(hù)保養(yǎng)，使其保持良好的運(yùn)行狀態(tài)，及時(shí)調(diào)整盤根壓蓋的松緊度。

（3）水力噴射泵（排砂采油工藝）具有很強(qiáng)的排砂和攜砂能力。該裝置無運(yùn)動部件，在地層流體被舉升的過程中，由于排砂采油裝置的特殊結(jié)構(gòu)，使地層砂在井筒內(nèi)的上升速度大于沉降速度，從而阻止地層砂下沉，砂埋管柱。

1.2.4 病原感染實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)所用三疣梭子蟹暫養(yǎng)7 d后分為2個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組，即副溶血弧菌感染組、WSSV感染組、PBS對照組，每組80只。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，三疣梭子蟹注射感染副溶血弧菌和WSSV后，72 h三疣梭子蟹的半致死濃度分別為2.6×107CFU/ml、3.2×107拷貝/ml，分別以此濃度進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。將3組三疣梭子蟹分別注射100 μl副溶血弧菌、WSSV和PBS，實(shí)驗(yàn)期間的飼養(yǎng)與管理與暫養(yǎng)期保持一致。分別于0、3、6、12、24、48和72 h進(jìn)行取樣，每個時(shí)間點(diǎn)各取3只三疣梭子蟹，取其血淋巴，4000 r/min離心15 min，棄血清，保留血細(xì)胞并立即加入300 ml TRIzol，置于液氮中保存。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1.2.2PtToll4基因cDNA序列全長的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組庫中所得到的PtToll4基因EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)3′和 5′末端特異性引物(表1)，由擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。參照 SMART RACE說明書，利用Advantange 2 PCR Kit(Clontech)使UPM與相應(yīng)的特異性引物分別結(jié)合，進(jìn)行PtToll4基因 cDNA 3′和5′末端擴(kuò)增。PCR程序：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃90 s，30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up試劑盒(TaKaRa)切膠回收得到目的片段。將目的片段和pMD19-T進(jìn)行載體連接，16℃反應(yīng)3 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃平板培養(yǎng)12 h。挑取陽性菌落在LB液體培養(yǎng)基(含AMP)中培養(yǎng)5 h，隨后進(jìn)行菌液PCR檢測，由擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將提取得到的三疣梭子蟹各組織總RNA用核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳對其質(zhì)量和完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，其OD260nm/OD280nm均在1.9～2.0之間，28S、18S和 5S rRNA條帶清晰，表明所提總 RNA質(zhì)量較好，可用于合成RACE模板。利用合成的cDNA第一鏈作為模板，進(jìn)行5′和3′末端RACE擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)公司測序后與已知的 EST序列分析比較測序結(jié)果，拼接得到PtToll4基因cDNA全長序列。利用EditSeq軟件以及BLAST對序列分析，發(fā)現(xiàn)已知序列包含完整的開放閱讀框(ORF)，表明所得到的基因序列完整可靠。PtToll4基因cDNA序列(GenBank登錄號：KY432366)全長4276個核苷酸，包含2685 bp的開放閱讀框(ORF)、339 bp的 5′端非編碼區(qū)(UTR)和1252 bp的 3′端非編碼區(qū)(UTR)，3′末端具有由 28個腺嘌呤核苷酸組成的poly(A)尾(圖1)。

本實(shí)驗(yàn)所用三疣梭子蟹取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，體重為(35±5) g，置于整理箱(560 mm×360 mm×280 mm)中暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間保持水溫為(20±2)℃，鹽度為31，pH=8.2。期間持續(xù)充氧，定時(shí)換水清污，換水量為原水量的 1/3，定時(shí)投喂餌料并對暫養(yǎng)個體進(jìn)行篩選，保留活力形態(tài)均較好的個體。

時(shí)間序列分析提示，1991-2010年間AP患者的中位年齡呈下降趨勢(均方根誤差為1.275，可決系數(shù)為0.702，圖1)。

表1 PtToll4克隆和mRNA表達(dá)分析所用引物序列Tab.1 Primers used for PtToll4 cloning and mRNA expression analysis

1.2.3PtToll4基因的生物學(xué)分析 利用 Contig Express Project軟件去除載體序列，并保留目的片段，將所得到的目的片段序列與PtToll4基因EST序列進(jìn)行比對，通過拼接得到PtToll4基因cDNA序列全長。將得到的PtToll4基因的 cDNA序列利用 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對。利用EditSeq和Gene Tool預(yù)測開放閱讀框(ORF)并翻譯得到其氨基酸序列。氨基酸序列分子量及等電點(diǎn)使用在線 ExPASy進(jìn)行預(yù)測，利用 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析。利用DNAMAN將PtToll4氨基酸序列和其他物種相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，對PtToll4基因的親緣關(guān)系分析。

靜力計(jì)算模擬了壩體分層填筑與蓄水過程，在靜力計(jì)算基礎(chǔ)上進(jìn)行動力計(jì)算。動力計(jì)算對傳統(tǒng)的Hardin-Drnevich模型進(jìn)行了改進(jìn)，以反映圍壓對材料動力特性影響[10-12]，模型基本表達(dá)式如下：

1.2.5 低鹽脅迫實(shí)驗(yàn) 選取暫養(yǎng)后的三疣梭子蟹120只，均分為2組，即鹽度脅迫組和正常對照組。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到三疣梭子蟹低鹽脅迫72 h半致死鹽度為 11，以此鹽度進(jìn)行低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)水體由自然海水和自來水調(diào)配所得并充分曝氣，正常對照組所用實(shí)驗(yàn)水體為正常海水(鹽度為31)。實(shí)驗(yàn)期間的飼養(yǎng)與管理與暫養(yǎng)期保持一致。分別于0、3、6、12、24、48和72 h取樣，每個時(shí)間點(diǎn)各取3只，取其血淋巴，4000 r/min離心15 min，棄血清，保留血細(xì)胞并立即加入300 ml TRIzol，置于液氮中保存，以便用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6PtToll4基因的定量表達(dá)分析 將經(jīng)過暫養(yǎng)的正常狀態(tài)下的三疣梭子蟹的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、眼柄、表皮、胃和腸等組織以及不同實(shí)驗(yàn)組所取組織分別提取 RNA，用核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的質(zhì)量和完整性，確保 RNA質(zhì)量與完整性均好，隨后用PrimeScript RT reagent kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法按照說明書進(jìn)行。

對PtToll4基因在不同組織的表達(dá)差異情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，PtToll4基因在各組織中均有一定表達(dá)，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高，在表皮和胃中也有較高表達(dá)量，而在肝胰腺中的表達(dá)量最低(圖5)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到的PtToll4基因的開放閱讀框cDNA序列，設(shè)計(jì)合成一對正反向特異熒光定量引物，并且以內(nèi)參基因β-actin作為對照(β-actin-F和β-actin-R；PtToll4-F和PtToll4-R)(表1)。參照SYBR Premix ExTaqTMⅡ說明書，利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀分析所提三疣梭子蟹各組織中PtToll4基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系 10 μl：5 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，0.4 μl 10 μmol/L 的正反向引物，0.2 μl ROX Reference Dye Ⅱ，1.0 μl cDNA，3.0 μl滅菌雙蒸水。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。各樣本均設(shè)3個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法2–ΔΔCt(Livaket al, 2001)進(jìn)行相對定量計(jì)算，并利用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并對其顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PtToll4基因cDNA的克隆及其序列分析

1.2.1 RNA的提取及 RACE第一鏈合成 用TRIzol法分別提取三疣梭子蟹各組織總 RNA，利用核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)與瓊脂糖凝膠電泳等方法，檢測所提總RNA的質(zhì)量和完整性。按照 SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)說明書，取等量所取各組織總RNA混勻，用來合成3′和5′RACE第一鏈，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

耐用品部門與非耐用品部門名義工資調(diào)整的依據(jù)在于效用，即：當(dāng)且僅當(dāng)調(diào)整名義工資可以獲得更高的效用時(shí)，耐用品部門與非耐用品部門就業(yè)者才支持工資調(diào)整。與Gal1’ 和Monacelli[19]相似，決定耐用品部門與非耐用品部門最優(yōu)工資的一階條件為：

2.2 PtToll4基因序列的生物信息學(xué)分析

圖1 PtToll4基因序列全長及編碼的氨基酸序列Fig.1 PtToll4 nucleotide sequence and deduced amino acids sequence

使用EditSeq軟件以及ExPASy預(yù)測得到PtToll4基因cDNA序列開放閱讀框(ORF)的長度為2685 bp，編碼一個由895個氨基酸組成的分子量為102.5 kDa、理論等電點(diǎn)為6.03的蛋白。利用SMART和Interpro-Scan對PtToll4基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，PtToll4推導(dǎo)的氨基酸序列主要包括一個由 21個氨基酸組成的信號肽(Signal peptide)、8個LRR或LRR-TYP結(jié)構(gòu)域、2個LRRCT結(jié)構(gòu)域(C-端 LRR)、1個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)以及1個TIR結(jié)構(gòu)域組成(圖2)。

圖2 利用SMART在線軟件預(yù)測的PtToll4的蛋白結(jié)構(gòu)Fig.2 The predicted domain architecture of PtToll4 by SMART

2.3 PtToll4基因序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分別分析副溶血弧菌和WSSV 感染后 0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和 72 h三疣梭子蟹血細(xì)胞中PtToll4基因mRNA表達(dá)量的變化，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：與 PBS對照組相比，經(jīng)副溶血弧菌感染后，PtToll4基因在血細(xì)胞中僅在48 h出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.05)，為對照組的 1.41倍，在其他時(shí)間點(diǎn)無顯著變化(圖6)。然而，經(jīng)WSSV感染后，PtToll4基因在血細(xì)胞中均出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P＜0.05)并且在6 h達(dá)到了表達(dá)量的峰值，為對照組的 5.03倍(P＜0.01)。經(jīng) WSSV感染后，三疣梭子蟹血細(xì)胞中的PtToll4基因被誘導(dǎo)表達(dá)更為顯著(圖7)。

利用MEGA 5.0軟件對PtToll4基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，PtToll4首先與親緣關(guān)系最近的中華絨螯蟹EsToll2聚為一支，其次與中國明對蝦FcToll、凡納濱對蝦LvToll、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)SpToll等親緣關(guān)系較近的甲殼動物聚為一支，然后與果蠅(Drosophila melanogaster)DmToll等無脊椎動物聚為一支(圖4)。

2.4 PtToll4基因的組織表達(dá)分布

棉林鉆栽：10月下旬至11月上旬棉林(棉花可正常采收)鉆栽油菜，11月下旬至12月上旬棉稈拔除后即可穴施基肥，次年4月中旬可在油菜地做營養(yǎng)缽育棉苗，5月中下旬即可機(jī)械收割油菜，然后移栽棉花。

2.5 不同病原感染對三疣梭子蟹血細(xì)胞PtToll4基因mRNA表達(dá)的影響

通過BLAST同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，PtToll4氨基酸序列與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)EsToll2、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)FcToll、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)PmToll、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)MjToll2、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)LvToll、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)PcToll2等具有較高的同源性，同源性為 41%～61%，其中，與中華絨螯蟹EsToll2同源性最高，為61%(圖3)。

2.6 低鹽脅迫對三疣梭子蟹血細(xì)胞 PtToll4基因mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)鹽度為11的水體環(huán)境對三疣梭子蟹進(jìn)行低鹽脅迫后，對三疣梭子蟹血細(xì)胞中PtToll4基因表達(dá)情況進(jìn)行分析表明，與正常對照組相比，在0～72 h均出現(xiàn)了顯著下調(diào)(P＜0.01)，其中，在48 h下調(diào)達(dá)到最低值，為正常對照組的0.1倍，在72 h表達(dá)量有所回升，為正常對照組的0.5倍(P＜0.01) (圖8)。

3 討論

三疣梭子蟹等無脊椎動物由于不具有獲得性免疫，因此，先天免疫是其抵抗外界病原入侵的重要防御機(jī)制(Liuet al, 2014)。先天免疫主要是由胚系基因所編碼的模式識別受體所介導(dǎo)，Toll樣受體便是一種重要的模式識別受體(Cartyet al, 2010)。本研究通過RACE技術(shù)獲得PtToll4基因 cDNA序列全長(GenBank登錄號：KY432366)。通過與其他無脊椎動物進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，PtToll4的蛋白序列與中華絨螯蟹EsToll2的蛋白序列相似度最高，為61% (Yuet al, 2013)，與其他甲殼類動物如克氏原螯蝦PcToll2、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)MrToll、斑節(jié)對蝦PmToll也具有較高的同源性(Lanet al, 2016; Srisuket al, 2014; Assavalapsakulet al, 2012)。

圖3 PtToll4基因編碼的氨基酸序列與其他無脊椎動物Tolls氨基酸序列比對Fig.3 Multiple amino acid sequence alignment of PtToll4 with other invertebrate Tolls

根據(jù) SMART預(yù)測得到的結(jié)構(gòu)域可知，PtToll4具有TLRs家族的典型特征，歸屬I型跨膜蛋白，胞內(nèi)有保守的 TIR結(jié)構(gòu)域，胞外含有多個亮氨酸重復(fù)(LRRs)。TIR結(jié)構(gòu)域是一種進(jìn)化十分保守的蛋白互作結(jié)構(gòu)域，對于誘導(dǎo)Toll信號通路下游信號級聯(lián)反應(yīng)具有重要作用。TLRs家族基因胞外區(qū)的進(jìn)化速度比胞內(nèi)區(qū)要快，正是基于胞外結(jié)構(gòu)的多樣性，使得 TLRs家族基因具有特異性識別病原相關(guān)分子模式的功能(Johnsonet al, 2003; Nget al, 2011)。比如在哺乳動物中，TLR1、TLR2和 TLR6能夠直接與脂肽結(jié)合(Schneideret al, 2011)，TLR2能夠直接識別脂蛋白和肽聚糖(Takeuchiet al, 1999)，TLR5可直接識別細(xì)菌鞭毛(Ramoset al, 2004)，TLR9可直接與未甲基化的細(xì)菌CpG DNA結(jié)合(Hemmiet al, 2000)。PtToll4的LRR結(jié)構(gòu)域含有8個LRR基序以及2個LRRCT帽子結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于包埋暴露的疏水性氨基酸殘基，從而使胞外結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定(Gayet al, 2006; Bellet al,2005)，在分子互作中具有重要作用(Leulieret al,2008)。此外，PtToll4的胞外區(qū)有13個潛在的糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在TLRs家族基因識別、結(jié)合病原相關(guān)分子模式中也起著重要作用(Zhanget al, 2011)。

圖4 基于Toll4氨基酸序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Fig.4 NJ tree based on Toll4 amino acids

組織表達(dá)分布結(jié)果顯示，PtToll4基因在三疣梭子蟹各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高，而血細(xì)胞在甲殼動物的免疫系統(tǒng)中具有重要作用(姚翠鸞等, 2006)。在本研究中，選取了副溶血弧菌和 WSSV兩種病原對三疣梭子蟹分別進(jìn)行感染，在感染的過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨著感染時(shí)間的延長，三疣梭子蟹出現(xiàn)了行動遲緩、不進(jìn)食等現(xiàn)象。定量結(jié)果表明，經(jīng)副溶血弧菌感染后，PtToll4基因在血細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并不顯著，而經(jīng) WSSV感染后，PtToll4在血細(xì)胞中被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，其中，在6 h的表達(dá)量最高，約為對照組的5倍。而Arts等(2007)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)WSSV感染后，斑節(jié)對蝦PmToll基因在組織中的表達(dá)量并無變化，這也說明TLRs家族不同成員可能具有受體識別特異性。由此，推斷PtToll4基因作為模式識別受體可能參與了WSSV的特異識別。

由于父親去世早，是三爹陪伴我們度過最艱辛的日子，細(xì)心照顧我和姐姐，在我們?nèi)兆泳S持不下去的情況下，三爹毅然選擇外出打工，在外面省吃儉用只為湊齊我的學(xué)費(fèi)。農(nóng)忙時(shí)辭工再回來干農(nóng)活，這些，我總是看在眼里，記在心里。

已有研究表明，鹽度的變化可以影響甲殼動物的免疫能力，如鄭萍萍等(2010)發(fā)現(xiàn)，鹽度的變化會造成三疣梭子蟹中免疫因子的活性發(fā)生變化；Joseph等(2007)發(fā)現(xiàn)，低鹽脅迫會使斑節(jié)對蝦更容易被 WSSV感染。為了探究低鹽環(huán)境對PtToll4基因表達(dá)的影響，本研究選擇鹽度為11的水體環(huán)境對三疣梭子蟹進(jìn)行低鹽脅迫。定量結(jié)果顯示，整個低鹽脅迫的過程中，PtToll4在血細(xì)胞中的表達(dá)量均為顯著下降(P＜0.01)，但在72 h出現(xiàn)了較為明顯的回升，但仍顯著低于對照組。在低鹽狀態(tài)下，推測三疣梭子蟹TLRs等免疫相關(guān)基因的表達(dá)可能也會受到抑制，從而影響識別外來病原的能力，使得自身免疫能力下降，導(dǎo)致死亡率增加。

圖5 三疣梭子蟹PtToll4基因在不同組織中的表達(dá)分布Fig.5 The expression of PtToll4 in different tissues of P. trituberculatus

圖6 副溶血弧菌感染后三疣梭子蟹血細(xì)胞中PtToll4基因的表達(dá)Fig.6 The expression of PtToll4 in P. trituberculatus hemocytes after V. parahaemolyticus infection

圖7 WSSV感染后三疣梭子蟹血細(xì)胞中PtToll4基因的表達(dá)Fig.7 The expression of PtToll4 in P. trituberculatus hemocytes after WSSV infection

圖8 低鹽脅迫后三疣梭子蟹PtToll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)Fig.8 The expression of PtToll4 in P. trituberculatus hemocytes under low salinity stress

綜上所述，可以確定PtToll4基因是三疣梭子蟹TLRs基因家族中的一位新成員。PtToll4在三疣梭子蟹的各個組織中均能被檢測到且在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高。通過不同病原刺激后發(fā)現(xiàn)，PtToll4可被 WSSV顯著誘導(dǎo)表達(dá)，從而在宿主抵抗 WSSV入侵感染的過程中發(fā)揮一定的功能。此外，低鹽脅迫狀態(tài)下，PtToll4基因的表達(dá)受到了顯著抑制，可能間接影響了三疣梭子蟹的機(jī)體免疫能力，這或許是低鹽環(huán)境導(dǎo)致三疣梭子蟹等甲殼動物死亡率升高的一個重要因素。PtToll4基因在抵御不同病原入侵時(shí)出現(xiàn)的表達(dá)量的差異還需要進(jìn)一步的研究，這些結(jié)果為進(jìn)一步探究三疣梭子蟹TLRs家族基因?qū)ζ湎忍烀庖叩挠绊懱峁┝藬?shù)據(jù)支持。

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