楊玉潔，王克柱，董黎明，姜 寧，范琳犀，張宏霞，呂靜薇，陳善廣，劉新民，王 瓊*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州 646000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 4.廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523808；5.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208； 6.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100193)

19世紀(jì)末到20世紀(jì)初，伊萬·巴甫洛夫和桑代克分別提出了經(jīng)典條件反射理論和動物學(xué)習(xí)定律，到20世紀(jì)30年代后期B. F. 斯金納在前人的基礎(chǔ)上提出了操作性條件反射理論，并研制出斯金納箱，成為操作式條件反射理論的奠基者。隨著神經(jīng)科學(xué)研究的深入，國內(nèi)外眾多研究者將經(jīng)典條件反射理論廣泛應(yīng)用于研究認(rèn)知行為。本實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上研制了國內(nèi)首臺獎勵性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)，通過條件性刺激(stimulus，S)、踏板操作(response，R)、物質(zhì)獎勵(outcome，O)建立了一種關(guān)聯(lián)性的認(rèn)知檢測模式，先在條件刺激下訓(xùn)練動物獲得獎賞，建立條件反射(S-O)聯(lián)系，再利用踏板和條件刺激的關(guān)聯(lián)獲得獎賞，建立操作條件反射(S-R-O)聯(lián)系。與傳統(tǒng)的認(rèn)知行為評價(jià)方法(如：跳臺、穿梭、避暗等)單一的學(xué)習(xí)記憶能力檢測相比，該檢測系統(tǒng)可用于多方面考察動物的聯(lián)合性學(xué)習(xí)記憶能力，包括進(jìn)行復(fù)雜任務(wù)時的興趣、動機(jī)、反應(yīng)力、執(zhí)行力、信號辨識力、決策力和記憶力等相關(guān)認(rèn)知能力表現(xiàn)。目前，獎勵性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)正在成為一種在評價(jià)動物認(rèn)知功能領(lǐng)域中新起的無傷害刺激且準(zhǔn)確可靠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。

獎勵性條件反射理論在國際上運(yùn)用廣泛，但至今對其所涉及到的一些實(shí)驗(yàn)因素?zé)o明確比較和研究，因此本研究通過探討不同顏色光刺激、不同刺激時長和晝/夜訓(xùn)練三種實(shí)驗(yàn)因素對大鼠獎賞性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響，為規(guī)范獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)方法學(xué)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)一：SPF級雄性Wistar大鼠30只，8周齡，體重(290±10) g。實(shí)驗(yàn)二：SPF級雄性Wistar大鼠32只，8周齡，體重(290±10) g。實(shí)驗(yàn)三：SPF級雄性Wistar大鼠16只，8周齡，體重(290±10) g。均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司[SCXK (京) 2016-0011]。實(shí)驗(yàn)室安靜，溫度恒溫保持在22℃～25℃，濕度條件為(55±10)%，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(8:30～20:30亮燈)[SYXK (京) 2013-0023]，飼養(yǎng)期間給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈自來水。所有動物實(shí)驗(yàn)遵守國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要儀器

獎勵性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所與中國航天員科研訓(xùn)練中心聯(lián)合研制。測試系統(tǒng)包括4個測試箱，每個測試箱的內(nèi)側(cè)壁安裝有兩套蔗糖水獎賞裝置、踏板裝置以及三色信號燈，左右對稱。獎賞裝置下方安裝寬度為4 cm的踏板裝置，踏板上方各有一個三色信號燈(紅、黃、藍(lán))。內(nèi)箱的頂部安裝有攝像裝置和環(huán)境光源，可以實(shí)時監(jiān)控動物在測試箱內(nèi)暗環(huán)境下的行為活動。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同顏色光刺激對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響

(1)飲食限制與雙瓶喂養(yǎng)：30只大鼠隨機(jī)分為3組，適應(yīng)環(huán)境3天后，開始飲食限制。采用雙瓶喂養(yǎng)的方法，給予動物兩瓶飲水，每只大鼠每天給予30 mL的8%蔗糖水或純凈水。兩瓶飲水每天位置對換，以免動物偏愛其中某一方位。飲水控制的同時，每只大鼠每天給予鼠糧14～17 g，連續(xù)飲食限制10 d，目的是使限食后的動物體重減輕到正常進(jìn)食動物體重的80%～85%[1]，此時動物對食物的渴求動機(jī)最大，同時不影響動物正常的生理需求。

圖1 獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)操作流程Fig.1 Operational process of the reward conditioned reflex experiment

(2)經(jīng)典的獎勵性條件反射：三組動物第9天開始，按照圖1操作流程進(jìn)行為期1 d的適應(yīng)訓(xùn)練，即動物自由適應(yīng)模式，獎賞裝置每(60±10) s自動給予一滴0.2 mL 20%蔗糖水，實(shí)驗(yàn)時間30 min。第10天動物開始進(jìn)行為期7 d的獎勵性條件反射的訓(xùn)練階段。在獎勵性條件反射訓(xùn)練期中，踏板縮回，紅色光刺激信號組給予紅燈刺激，黃色光刺激信號組給予黃燈刺激，藍(lán)色光刺激信號組給予藍(lán)燈刺激，周期性亮燈，每次亮燈10 s，此時動物探索飲水盒時自動促發(fā)紅外感應(yīng)裝置，發(fā)出信號至計(jì)算機(jī)，并反饋到獎賞裝置自動給予一滴獎賞物質(zhì)(0.2 mL)，我們將此定義為正確鼻觸反應(yīng)，鼻觸次數(shù)被記為正確鼻觸次數(shù)(correct nose pokes，CNPs)；10 s之后信號燈熄滅，實(shí)驗(yàn)進(jìn)入間隔期(30±5) s，若此時動物進(jìn)行探索飲水盒，將沒有獎賞物質(zhì)的獲得，同樣系統(tǒng)也會記錄其鼻觸反應(yīng)，我們將其定義為錯誤鼻觸反應(yīng)，鼻觸次數(shù)被記為錯誤鼻觸次數(shù)(incorrect nose pokes，INPs)。每天訓(xùn)練20 min，連續(xù)訓(xùn)練7 d。記錄正確鼻觸次數(shù)、錯誤鼻觸次數(shù)等，動物的學(xué)習(xí)能力及獎勵性條件反射獲得能力通過比較正確鼻觸次數(shù)和鼻觸正確率[CNPs/(CNPs + INPs)]表現(xiàn)出來。

1.3.2 不同刺激時長對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響

(1)飲食限制與雙瓶喂養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1中(1)所述。

(2)經(jīng)典的獎勵性條件反射：實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1中(2)所述，但在獎勵性條件反射訓(xùn)練模式中，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：Ⅰ組：燈亮持續(xù)時間10 s，實(shí)驗(yàn)時長20 min；Ⅱ組：燈亮持續(xù)時間30 s，實(shí)驗(yàn)時長22.5 min；Ⅲ組：燈亮持續(xù)時間60 s，實(shí)驗(yàn)時長30 min。三組均將藍(lán)燈作為刺激信號，周期次亮燈，亮燈次數(shù)均為15次，其他參數(shù)相同。記錄正確鼻觸次數(shù)、鼻觸正確率等指標(biāo)。

1.3.3 晝/夜訓(xùn)練對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響

(1)飲食限制與雙瓶喂養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1中(1)所述。

(2)經(jīng)典的獎勵性條件反射：實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1中(2)所述，每組連續(xù)訓(xùn)練7 d，每天一次，每次實(shí)驗(yàn)時長20 min，記錄正確鼻觸次數(shù)、鼻觸正確率等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

注：紅光刺激與藍(lán)光刺激比較，* P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；黃光刺激與藍(lán)光刺激比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖2 三種光刺激對Wistar大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響Note. Right light stimulus compared with blue light stimulus,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Yellow light stimulus compared with blue light stimulus,#P< 0.05,##P< 0.01.Fig.2 Effects of light stimulation with three different color on the reward conditioned reflex of Wistar rats

2.1 三種顏色光刺激對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響

如圖2可以看出，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，三個組別的大鼠的正確鼻觸次數(shù)、鼻觸正確率均逐漸上升，到第5天基本達(dá)到穩(wěn)定值。鼻觸潛伏期代表動物首次進(jìn)行鼻觸反應(yīng)的時間，反映出動物對S-O關(guān)聯(lián)的記憶程度，圖中看出三個組別的鼻觸潛伏期隨著訓(xùn)練的延長均呈現(xiàn)大幅度下降趨勢。在訓(xùn)練第1天、第2天三組大鼠的正確鼻觸次數(shù)和錯誤鼻觸次數(shù)即差異有顯著性，可能是由于大鼠對新環(huán)境的熟悉程度不一致導(dǎo)致的，由于學(xué)習(xí)是一個循序漸進(jìn)的過程，所以不能說明其學(xué)習(xí)能力有差異。對獎賞訓(xùn)練中的運(yùn)動路程與平均速度比較發(fā)現(xiàn)(圖3)，動物在三種不同顏色光刺激下的運(yùn)動路程與平均速度相似，差異無顯著性。

2.2 不同光刺激時長對獎賞條件反射記憶獲得的影響

如圖4顯示，與刺激持續(xù)時間10 s比較，30 s和60 s組大鼠的正確鼻觸次數(shù)顯著升高。同樣鼻觸正確率也在緩慢提高。獎賞訓(xùn)練前3 d，10 s組大鼠的潛伏期最長，說明大鼠對獎賞的記憶能力最差。

2.3 晝/夜訓(xùn)練對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響

如圖5所示，白天訓(xùn)練組與夜晚訓(xùn)練組二者間的正確鼻觸次數(shù)、鼻觸潛伏期和鼻觸正確率差異均無顯著性。

圖3 三種顏色光刺激對Wistar大鼠運(yùn)動路程和平均速度的影響Fig.3 Effect of light stimulation with three different color on the movement distance and average speed of Wistar rats in the reward conditioned reflex test

注：與10 s組比較，* P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與30 s組比較，# P< 0.05，## P< 0.01，### P< 0.001。圖4 光刺激時長對大鼠獎賞條件反射實(shí)驗(yàn)的影響Note. Compared with the 10 s group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the 30 s group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001.Fig.4 Effect of time duration of conditioned stimulus on reward conditioned reflex of the rats

3 討論

經(jīng)典條件反射理論長久以來被應(yīng)用于認(rèn)知行為學(xué)研究，包括獎勵性條件反射和懲罰性條件反射。目前常用的評價(jià)認(rèn)知行為的實(shí)驗(yàn)方法中穿梭、避暗、跳臺、Y迷宮等均是建立在條件反射理論的基礎(chǔ)上，但這些給予厭惡條件和懲罰刺激的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)會對動物的心理和生理產(chǎn)生一定影響，而獎勵性條件反射理論的應(yīng)用減小了對動物本身的傷害，更加符合國際上對實(shí)驗(yàn)動物的3R原則[2]，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。課題組研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)的獎勵性操作條件反射實(shí)時測試系統(tǒng)是一種精細(xì)敏感的的認(rèn)知功能評測系統(tǒng)，利用計(jì)算機(jī)對信號資源進(jìn)行綜合分析、優(yōu)化重組，建立了針對不同認(rèn)知功能與操作方式的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑约搬槍Σ煌僮魅蝿?wù)與學(xué)習(xí)記憶評價(jià)的敏感行為評價(jià)指標(biāo)體系[3]，是國內(nèi)首臺應(yīng)用于大鼠的獎勵性操作條件反射檢測系統(tǒng)。國外有大量文獻(xiàn)報(bào)道獎勵性操作條件反射實(shí)驗(yàn)方法，研究對象主要為昆蟲[4-5]、斑馬魚[6]、軟體動物[7]，檢測指標(biāo)主要為探頭潛伏期[8]，而此獎勵性操作條件反射檢測系統(tǒng)不僅能記錄動物軌跡，還能自動統(tǒng)計(jì)動物的鼻觸次數(shù)、鼻觸潛伏期、正確鼻觸次數(shù)、運(yùn)動路程與速度等，該系統(tǒng)還能進(jìn)行信號識別辨識，位置信號識別等實(shí)驗(yàn)，可多方面評價(jià)動物的學(xué)習(xí)、記憶、判斷與執(zhí)行能力。

本課題組前期研究了動物品系對獎賞條件反射和操作式條件反射的行為學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)雄性SD大鼠對獎賞條件反射經(jīng)典條件反射階段對飲水盒的探索能力強(qiáng)，表現(xiàn)出對獎賞物質(zhì)較強(qiáng)的興趣；而在獎賞操作條件反射階段雄性Wistar大鼠的表現(xiàn)優(yōu)于雄性SD大鼠[9]。故本研究選擇雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，綜合探討不同實(shí)驗(yàn)因素對大鼠獎勵性條件反射獲得的影響，為獎勵性操作條件反射實(shí)驗(yàn)做鋪墊。

圖5 晝/夜訓(xùn)練對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響Fig.5 Effect of day/night training on reward conditioned reflex of the rats

獎勵性條件反射在巴浦洛夫[10]經(jīng)典條件反射基礎(chǔ)上，條件刺激可為光刺激或聲音刺激[11]，獎賞物質(zhì)可為固體食物或糖水，建立動物自主獲得獎賞物的條件反射。在獎勵性條件反射中，動物將條件刺激與獎賞物結(jié)合在一起，產(chǎn)生正性作用，起到預(yù)測獎勵的作用[12]。為研究不同光刺激對大鼠條件反射建立的影響，本實(shí)驗(yàn)選取三種光作為條件刺激，紅色、藍(lán)色和黃色，同時也考察大鼠的視覺識別能力。嚙齒類動物的視覺辨別能力是由其體內(nèi)的SWS1(shortwavelengthsensitivetype1)和LWS(longwavelengthsensitivetype)基因家族控制[13]，且大、小鼠的SWS1色素只能接收紫外光(400 nm)，LWS色素可接收光波長為510～540 nm的光[14]。而紅光波長為620～750 nm，藍(lán)光波長為460～480 nm[15]，黃光波長為570～590 nm，因此，大鼠對藍(lán)光較其他兩光源更敏感[16]。但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，三組動物的鼻觸次數(shù)、正確鼻觸率、鼻觸潛伏期、運(yùn)動路程及速度差異均無顯著性。說明三組運(yùn)功能力相當(dāng)，不存在由于運(yùn)動功能缺陷導(dǎo)致的條件反射記憶獲得的差異，所以紅、黃、藍(lán)三種光刺激對大鼠獎勵性條件反射的獲得無影響。

大量研究表明，訓(xùn)練次數(shù)的增加對條件反射的建立有促進(jìn)作用，可形成長期的條件反射記憶[5, 17]。要建立穩(wěn)定的條件反射，條件刺激信號須反復(fù)出現(xiàn)，且經(jīng)不斷訓(xùn)練，動物才能逐漸習(xí)得信號與獎勵間的關(guān)聯(lián)。條件刺激在條件反射習(xí)得過程中充當(dāng)了一種強(qiáng)有效的條件強(qiáng)化物，能加固非條件刺激與獎賞物之間的聯(lián)系[18]。故本研究考察條件刺激持續(xù)時間的長短對條件反射獲得的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)訓(xùn)練天數(shù)及其他參數(shù)一致時，前3 d條件刺激時間為10 s時，動物對獎勵條件的記憶力最差，而當(dāng)條件刺激作用30 s或60 s時，動物表現(xiàn)出對獎勵物有很強(qiáng)的興趣，且鼻觸正確率顯著提高。本實(shí)驗(yàn)室前期研究者石哲[19]選擇給予藍(lán)光條件刺激持續(xù)10 s[20]，每天訓(xùn)練一次，共訓(xùn)練10 d，動物對獎勵物也表現(xiàn)出強(qiáng)烈的探索興趣，條件反射形成。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以說明適當(dāng)延長條件強(qiáng)化物的持續(xù)時間有利于在短時間內(nèi)建立良好的條件反射，提高動物記憶效率。

幾個世紀(jì)以來關(guān)于植物[21]和動物[22]的晝夜節(jié)律的研究眾多，機(jī)體的一切生理活動均受晝夜節(jié)律的控制，如睡眠、激素分泌和行為等[23]，晝夜節(jié)律對認(rèn)知功能的影響也有大量報(bào)道[24-27]。幾項(xiàng)研究表明，生物鐘對學(xué)習(xí)和記憶的影響可能是不相同的。在某些情況下，形成記憶的能力可能與晝夜節(jié)律相獨(dú)立，但時間戳作為聯(lián)系回憶與表現(xiàn)的線索，在倉鼠[28]和大鼠[29]學(xué)習(xí)后間隔24 h內(nèi)會更好。在其他情況下，回憶可能很大程度上與檢測階段無關(guān)，但記憶的獲取或整合可能取決于訓(xùn)練的晝夜節(jié)律，如軟體動物[30-31]、昆蟲[27,32-33]、魚[34]和小鼠[35]。Cain等人[36]研究了Wistar大鼠與Long Evans大鼠兩種大鼠的條件位置偏好的時間節(jié)律，發(fā)現(xiàn)大鼠品系對學(xué)習(xí)記憶任務(wù)的表現(xiàn)有很大影響，一天中某個特定時間點(diǎn)的學(xué)習(xí)任務(wù)作為一個變量對Wistar大鼠的影響更大。目前，大多數(shù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是在白天進(jìn)行，而嚙齒類動物屬夜行性動物，在研究晝/夜訓(xùn)練對獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響時，結(jié)果顯示白天訓(xùn)練組與夜晚訓(xùn)練組大鼠的正確鼻觸次數(shù)和鼻觸正確率沒有明顯差異，說明晝/夜訓(xùn)練不影響大鼠獎勵性條件反射的習(xí)得。但對大鼠獎勵性操作條件反射是否受晝夜節(jié)律影響，還需深入研究。

此次研究首次探討了三種因素對大鼠獎勵性條件反射實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果說明了三種不同顏色的光刺激對大鼠條件反射的習(xí)得無影響，但光刺激時間長短對其學(xué)習(xí)成績有影響，適當(dāng)增長光刺激時間有利于條件反射的形成。同時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明晝/夜訓(xùn)練對大鼠訓(xùn)練成績無影響，可在白天進(jìn)行與獎勵性條件反射相關(guān)的訓(xùn)練。

[1] Shi Z, Sun X, Liu X, et al. Evaluation of an Aβ(1-40)-induced cognitive deficit in rat using a reward-directed instrumental learning task [J]. Behav Brain Res, 2012, 234(2): 323-333.

[2] 石哲, 陳善廣, 陳玲玲, 等. 獎勵性操作式條件反射任務(wù)在大鼠學(xué)習(xí)記憶研究中的應(yīng)用 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào), 2012, 20(4): 9-15.

[3] 陳鈴鈴. 基于獎勵性操作條件反射的開心散益智藥效研究 [D]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[4] Hussaini SA, Komischke B, Menzel R, et al. Forward and backward second-order Pavlovian conditioning in honeybees [J]. Learn Mem, 2007, 14(10): 678-683.

[5] Menda G, Bar HY, Arthur BJ, et al. Classical conditioning through auditory stimuli in Drosophila: methods and models [J]. J Exp Biol, 2011, 214(Pt 17): 2864-2870.

[6] Valente A, Huang KH, Portugues R, et al. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish [J]. Learn Mem, 2012, 19(4): 170-177.

[7] Ribeiro MJ, Schofield MG, Kemenes I, et al. Activation of MAPK is necessary for long-term memory consolidation following food-reward conditioning [J]. Learn Mem, 2005, 12(5): 538-545.

[8] O’Connor EC, Crombag HS, Mead AN, et al. The mGluR5 antagonist MTEP dissociates the acquisition of predictive and incentive motivational properties of reward-paired stimuli in mice [J]. Neuropsychopharmacology, 2010, 35(8): 1807-1817.

[9] 王克柱, 徐攀, 盧聰, 等. 兩品系大鼠在經(jīng)典條件反射和操作式條件反射中的行為學(xué)表現(xiàn) [J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào), 2016, 24(1): 65-71.

[10] Pavlov IP. Conditioned reflexes. New York: Dover, 1960.

[11] Ranaldi R, Egan J, Kest K, et al. Repeated heroin in rats produces locomotor sensitization and enhances appetitive Pavlovian and instrumental learning involving food reward [J]. Pharmacol Biochem Behav, 2009, 91(3): 351-357.

[12] 王克柱. 基于獎賞操作的慢性束縛應(yīng)激所致大鼠認(rèn)知功能損傷及Rg1, Rb1防護(hù)作用研究 [D]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2016.

[13] Jacobs GH. Evolution of colour vision in mammals [J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2009, 364(1531): 2957-2967.

[14] Jacobs GH, Neitz J, Deegan JF 2nd. Retinal receptors in rodents maximally sensitive to ultraviolet light [J]. Nature, 1991, 353(6345): 655-656.

[15] Rea MS, Figueiro MG, Bierman A, et al. Modeling the spectral sensitivity of the human circadian system [J]. Lighting Res Technol, 2012, 44(4): 386-396.

[16] Jacobs GH, Williams GA, Fenwick JA. Influence of cone pigment coexpression on spectral sensitivity and color vision in the mouse [J]. Vision Res, 2004, 44(14): 1615-1622.

[17] Felsenberg J, Plath JA, Lorang S, et al. Short- and long-term memories formed upon backward conditioning in honeybees (Apismellifera) [J]. Learn Mem, 2013, 21(1): 37-45.

[18] Meyer PJ, Cogan ES, Robinson TE. The form of a conditioned stimulus can influence the degree to which it acquires incentive motivational properties [J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98163.

[19] 石哲. 基于獎勵性操作條件反射的益智復(fù)方中藥藥效評價(jià)方法研究 [D]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2012.

[20] Parkinson JA, Robbins TW, Everitt BJ. Dissociable roles of the central and basolateral amygdala in appetitive emotional learning [J]. Eur J Neurosci, 2000, 12(1): 405-413.

[21] McClung CR. Plant circadian rhythms [J]. Plant Cell, 2006, 18(4): 792-803.

[22] Moore MC, Sulzman FM, Fuller CA. The clocks that time us: physiology of the circadian timing system [J]. J Gerontology, 1983, 38(2): 246-247.

[23] Tapp WN, Holloway FA. Phase shifting circadian rhythms produces retrograde amnesia [J]. Science, 1981, 211(4486): 1056-1058.

[24] Fekete M, van Ree JM, Niesink RJ, et al. Disrupting circadian rhythms in rats induces retrograde amnesia [J]. Physiol Behav, 1985, 34(6): 883-887.

[25] Devan BD, Goad EH, Petri HL, et al. Circadian phase-shifted rats show normal acquisition but impaired long-term retention of place information in the water task [J]. Neurobiol Learn Mem, 2001, 75(1): 51-62.

[26] Krishnan HC, Lyons LC. Synchrony and desynchrony in circadian clocks: impacts on learning and memory [J]. Learn Mem, 2015, 22(9): 426-437.

[27] Decker S, McConnaughey S, Page TL. Circadian regulation of insect olfactory learning [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(40): 15905-15910.

[28] Cain SW, Chou T, Ralph MR. Circadian modulation of performance on an aversion-based place learning task in hamsters [J]. Behav Brain Res, 2004, 150(1-2): 201-205.

[29] Manrique T, Molero A, Ballesteros MA, et al. Time of day-dependent latent inhibition of conditioned taste aversions in rats [J]. Neurobiol Learn Mem, 2004, 82(2): 77-80.

[30] Fernandez RI, Lyons LC, Levenson J, et al. Circadian modulation of long-term sensitization in Aplysia [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(24): 14415-14420.

[31] Lyons LC, Rawashdeh O, Katzoff A, et al. Circadian modulation of complex learning in diurnal and nocturnal Aplysia [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(35): 12589-12594.

[32] Lyons LC, Roman G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila [J]. Learn Mem, 2008, 16(1): 19-27.

[33] Lehmann M, Gustav D, Galizia CG. The early bee catches the flower—circadian rhythmicity influences learning performance in honey bees,Apismellifera[J]. Behav Ecol Sociobiol, 2011, 65(2): 205-215.

[34] Rawashdeh O, de Borsetti NH, Roman G, et al. Melatonin suppresses nighttime memory formation in zebrafish [J]. Science, 2007, 318(5853): 1144-1146.

[35] Chaudhury D, Colwell CS. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice [J]. Behav Brain Res, 2002, 133(1): 95-108.

[36] Cain SW, Ko CH, Chalmers JA, et al. Time of day modulation of conditioned place preference in rats depends on the strain of rat used [J]. Neurobiol Learn Mem, 2004, 81(3): 217-220.