山東省及周邊地區(qū)肉鴨源大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性分析

駱延波 李蘭波 賈紀(jì)美 齊靜 李璐璐 胡明 劉玉慶 鄧旭明

摘要：為建立鴨大腸桿菌快速鑒定及藥敏檢測方法，篩選合適的抗生素，本試驗從山東省12個、河北4個及河南4個地區(qū)養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖小區(qū)采集到447份疑似感染鴨大腸桿菌的肉鴨肝臟和腦部組織病料，共分離到300株大腸桿菌，分離率為67.11%。利用大腸桿菌phoA基因為目的基因，建立了PCR快速鑒定鴨源大腸桿菌的方法。該PCR檢測方法可快速鑒定鴨源大腸桿菌，鑒定效率顯著提高。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)及瓊脂稀釋法藥敏試驗原理，建立了96點接種藥敏檢測盒快速檢測方法，結(jié)果表明：硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星抑菌率相對較高；卡那霉素、氨芐西林、氟苯尼考抑菌率相對較低。根據(jù)藥敏檢測結(jié)果可快速篩選適用的敏感藥物和劑量，并交替輪流使用抗生素。

關(guān)鍵詞：鴨；大腸桿菌；藥敏試驗；多重耐藥

中圖分類號：S858.322.61+2文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0119-05

Abstract This study was aimed to establish the methods for rapid separation and identification of Escherichia coli from ducks and drug susceptibility test， and screen proper antibiotics. We collected 447 histological materials including livers and brains from ducks with suspected coli bacillosis from 12 districts or cities of Shandong Province， 4 cities of Hebei Provice and 4 cities of Henan Province.Based on the phoA gene，a PCR method was established for rapidly identifying Escherichia coli from ducks. By this method， 300 strains of Escherichia coli were identified with the isolation rate as 67.11%. This PCR method could be used to rapidly identify Escherichia coli from ducks， and the identification efficiency was significantly improved. According to the standard of the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI） and agar dilution method， the rapid detection method of 96 array antimicrobial susceptibility test was established. The results showed that the antibacterial rate of polymyxin sulfate and pefloxacin mesylate were higher，while that of kanamycin， ampicillin and florfenicol were relatively lower. So the optimal sensitive drugs and doses could be screened out according to the drug sensitivity test results， and the antibiotics could be used alternately.

Keywords Duck； Escherichia coli； Antibiotic susceptibility test； Multi drug resistance

鴨大腸桿菌感染是目前肉鴨養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的細(xì)菌性傳染病之一，而且該菌常與其它細(xì)菌混合感染[1-3]?？股刈鳛榧?xì)菌感染的有效治療手段得以普遍應(yīng)用，但是近些年來廣譜抗菌藥的濫用以及細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)等因素，導(dǎo)致鴨大腸桿菌表現(xiàn)出了普遍的多重耐藥性[4-8]，不同地區(qū)分離到的鴨大腸桿菌對不同抗菌藥的敏感程度存在較大差異[9-11]，進行大批量鴨大腸桿菌鑒定及藥敏試驗需要耗費相當(dāng)長的時間才能得到相應(yīng)的結(jié)果，給該病的診斷與治療造成了極大的困難。針對目前山東省及周邊地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖中細(xì)菌傳染病發(fā)病率高、防治困難，同時傳統(tǒng)的鴨大腸桿菌鑒定及藥敏試驗方法檢測效率較低的現(xiàn)狀，本研究建立了鴨大腸桿菌的PCR快速鑒定方法，并根據(jù)CLSI瓊脂稀釋法藥敏試驗原理，建立了96點接種藥敏檢測盒，菌株的分離檢測效率大大提高，并可為獸醫(yī)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從山東省12個地區(qū)、河北4地區(qū)及河南4地區(qū)養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖小區(qū)采集到447份疑似鴨漿膜炎的病鴨肝臟及腦部組織病料。

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑 麥康凱培養(yǎng)基，MH培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基；新生牛血清，PCR反應(yīng)試劑（Taq酶、dNTP Mix、MgCl2、10×Loading buffer），DNA Marker（DL2000 plus），PMD18-T載體，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，核酸膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖，50×TAE電泳緩沖液，氨芐青霉素（Amp）貯存液，LB+Amp平板，1%瓊脂糖凝膠等。

1.1.2 試驗藥物 購自青島康地恩藥業(yè)有限公司，主要成分分別為氨芐西林鈉、乳酸環(huán)丙沙星、硫酸多粘菌素、硫酸卡那霉素、甲磺酸培氟沙星、氟苯尼考、磺胺氯噠嗪鈉、痢菌凈、多西環(huán)素等。

1.1.3 主要試驗儀器 96孔聚乙烯板藥敏檢測盒；VD-650型桌上式超凈臺；LDZX-40SBI高壓滅菌鍋；DYY-2電泳儀；移液器（德國Eppendoff公司）；凝膠成像系統(tǒng)；HPP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱；生物安全柜；Ultrospec 3100 Pro紫外分光光度計（英國Biochrom公司）； FA2104N電子分析天平；HZQ-C空氣浴振蕩器；PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌分離培養(yǎng) 從病死鴨病變組織（肝、腦等）中無菌穿刺采樣，接種于裝有2 mL滅菌LB瓊脂培養(yǎng)基的穿刺管中培養(yǎng)36～48 h；之后用接種環(huán)從穿刺管中心插入，抽出后劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平皿，37℃倒置培養(yǎng)16～18 h，即可出現(xiàn)紫黑色、帶金屬光澤的圓形疑似大腸桿菌菌落。取疑似菌落劃線接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，37℃倒置培養(yǎng)16～18 h進行純化。鉤取純化菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢，進行后續(xù)生化及分子鑒定。

1.2.2 生化鑒定 取疑似菌落分別接種于五糖發(fā)酵管、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛瓊脂上進行糖發(fā)酵（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇）試驗、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗、硫化氫試驗，置于37℃培養(yǎng)2～3 d觀察結(jié)果。

1.2.3 分子鑒定 將分離菌株無菌劃線接種于TSA培養(yǎng)基上，挑取單菌落于MH液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h，離心，棄上清，用50 μL滅菌水懸浮沉淀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出后迅速放入冰塊中，冷卻5 min，12 000 r/min離心3 min，吸上清液作為DNA模板，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻[12]～[14]，選取大腸桿菌phoA保守基因為目的片段設(shè)計引物，引物序列為F：5′-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3′，R：5′-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3′，擴增序列長度750 bp。檢測基因的PCR反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min[15，16]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行進目的核苷酸克隆測序，并用DNAStar MegAlign進行多序列比對，確定種屬關(guān)系。

1.2.4 瓊脂稀釋法藥敏試驗 首先按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)或臨床推薦劑量稀釋藥物至L值（獸藥成品的L值等于養(yǎng)殖戶治療動物疾病使用的藥物濃度或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)“R”值），然后設(shè)置L/4、L/2、L、2 L、4 L五個濃度梯度。

菌液制備：將分離得到的大腸桿菌菌液200 μL按順序接入96孔板Ⅰ中，每板接48株菌為宜，之后取96點陣板扣入已接菌液的96孔板Ⅰ中，充分接觸后，把96點陣板扣入每孔裝有200 μL LB液體的96孔板Ⅱ中，充分接觸后，再把此點陣板扣入每孔裝有200 μL LB液體的96孔板Ⅲ中，充分接觸后，保留96孔板Ⅲ（每孔菌液濃度約為105 CFU/mL），同時做好標(biāo)記，記錄菌株順序。

菌液接種：首先在9 cm平皿上依次標(biāo)明待測藥物名稱與藥物濃度梯度，并各加入20 mL高壓滅菌水，然后在每種藥物的4 L濃度平皿中加入20 mL待測藥物，其余各皿按藥物濃度依次進行梯度稀釋。分別向每個96點陣藥敏檢測盒中加入18 mL高壓滅菌且冷卻至55℃左右的MH瓊脂與2 mL不同濃度梯度的待測藥物，并立即混勻，同時避免產(chǎn)生氣泡（此時每種藥物的濃度依次為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL）。然后使用多位點接種器接種96孔板Ⅲ中菌液至96點陣藥敏檢測盒瓊脂表面，首先接種無抗菌藥物的對照盒，然后從每種藥物的最低藥物濃度至最高藥物濃度依次開始接種。將接種后的96點陣藥敏檢測盒在室溫靜置至接種點的水分被瓊脂完全吸收，干燥，但整個過程不能超過30 min。然后將平皿倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。

結(jié)果判定：有菌生長，此藥物濃度無效；無菌生長，此藥物濃度有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

從山東、河北、河南部分區(qū)、市采集到的447份病鴨的腦、肝組織病料中共分離到大腸桿菌300株，分離率為67.11%。

2.2 培養(yǎng)特性、鏡檢及生化鑒定結(jié)果

在伊紅美蘭瓊脂平板上長出紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落，疑似為大腸桿菌菌落；另有少數(shù)樣品在伊紅美蘭瓊脂平板上出現(xiàn)乳白、邊緣不規(guī)則菌落，判為雜菌。疑似大腸桿菌在顯色培養(yǎng)基上純化，挑取純化的單菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)和染色特征。大腸桿菌染色后為紅色，細(xì)菌形態(tài)為短小的桿狀，單個存在。最終鑒定結(jié)果為300株大腸桿菌。生化反應(yīng)見表2。

2.3 分子鑒定結(jié)果

對大腸桿菌phoA基因進行PCR 擴增，結(jié)果300株大腸桿菌均擴增出750 bp特異性條帶（圖1）。陽性擴增產(chǎn)物經(jīng)純化測序后，通過NCBI BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，均與其標(biāo)準(zhǔn)菌株有高達(dá)99%的同源性。根據(jù)同源性達(dá)到99%以上為同一種屬的原則，可以判定其為同一種屬， phoA是保守的特異性基因，可以作為大腸桿菌快速檢測的候選基因之一。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

如表3所示，硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星、痢菌凈、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星抑菌率相對較高，可作為目前選用的主要藥物。硫酸卡那霉素、氨芐西林、氟苯尼考長期用于獸醫(yī)臨床，抑菌率較低，建議暫時不用該類抗生素。

多重抗藥性現(xiàn)象嚴(yán)重（表4）。以L值作為抗藥性判定標(biāo)準(zhǔn)，300株大腸桿菌中不存在單重抗藥株，二重抗藥占比3%，三重抗藥17%，4重抗藥10%，5重以上抗藥共占70%。這與長期使用復(fù)方抗生素有很大關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

3.1 大腸桿菌分離培養(yǎng)

本研究中從447份病死鴨的肝、腦組織病料共分離到大腸桿菌300株，分離率較高。大腸桿菌分離率明顯高于沙門氏菌和里默氏桿菌，表明從總體來看，在疑似鴨漿膜炎病傳播中大腸桿菌仍是主要致病菌。雖然從細(xì)菌分離率來看，沙門氏菌和里默氏桿菌要低的多，但是由于其致病力更強、致死率更高，這兩種病原菌也不容忽視。

3.2 大腸桿菌鑒定

大腸桿菌可以通過菌落形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)鑒定、生化反應(yīng)[17-20]等傳統(tǒng)技術(shù)手段相互配合來進行鑒定，但這些方法操作繁瑣，靈敏度低、特異性差。phoA是大腸桿菌內(nèi)特異性較高的基因，編碼磷酸酯分解酶A。本研究在該基因上選取目的片段，設(shè)計PCR引物，對受試菌株進行PCR檢測，檢測結(jié)果與生化鑒定相符，而且其特異性更高、靈敏性更強，可以作為快速檢測方法。

3.3 大通量瓊脂稀釋法藥敏試驗

藥敏試驗方法多樣，耗費低、耗時少，試驗結(jié)果在臨床用藥中具有很高的指導(dǎo)意義，是一種標(biāo)準(zhǔn)化的、易于掌握和操作的技術(shù)，但即便如此在畜牧生產(chǎn)中遠(yuǎn)沒有被有效的利用。本試驗改進CLSI藥敏試驗體系，以臨床推薦劑量為準(zhǔn)，設(shè)定多個梯度，基于瓊脂稀釋法建立了大通量篩選敏感藥物及其適宜的臨床使用劑量的方法。試驗結(jié)果表明該方法易于確認(rèn)結(jié)果，比標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴散法更準(zhǔn)確且效率高，比微量肉湯稀釋法藥敏試驗的效率提高10倍，適合高通量藥敏檢測。結(jié)合穿刺采樣，集中多種鑒定檢測策略，我們相對高效地完成了覆蓋山東全省的抗藥性普查，并針對各地區(qū)現(xiàn)狀推薦了適宜的抗菌藥物及劑量。利用該方法可以建立養(yǎng)殖廠區(qū)內(nèi)及更大區(qū)域內(nèi)動態(tài)的藥敏檢測系統(tǒng)，以便篩選有效藥物，用于藥物區(qū)域輪換。

參 考 文 獻：

[1] 郭玉璞，張大丙. 鴨疫里默氏桿菌病[J].養(yǎng)禽與禽病防治，1999（10）：6-7.

[2] 蘇敬良.禽病學(xué)[M].第十版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：76-78.

[3] 張大丙，郭玉璞.不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的部分特性比較[J].中國獸醫(yī)雜志，1999（10）：13-15.

[4] 汪銘書，程安春，李淑梅，等.RAPD用于鴨疫里默氏桿菌鴨源致病性大腸桿菌和鴨沙門氏菌的遺傳相似性及聚類分析的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志，2007（9）：9-11.

[5] Saif Y M，Barnes H J，Glisson J R， et al. Diseases of poultry[M].11th edition. America：Wiley-Blackwell，2003：354-363.

[6] 宋立，寧宜寶，張秀英，等.中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1466-1473.

[7] 劉建民，張瑞華，姜世金.濰坊市肉鴨源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性的檢測[J]. 家禽科學(xué)，2015（11）：17-20.

[8] 劉玉慶，等譯.細(xì)菌抗藥性[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

[9] 丁孟建，胡世君，鄭凱，等.規(guī)模養(yǎng)殖場肉鴨大腸桿菌病病原的分離鑒定及耐藥性檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（5）：105-107.

[10]葉保國，林大捷，邢漫萍，等.鴨大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 家禽科學(xué)， 2013（10）：43-44.

[11]程方俊，周廷宣，田晉紅，等.重慶養(yǎng)鴨場雛鴨大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，28（6）：1007-1010.

[12]教郁，高維凡，胡彩光.大腸桿菌耐藥性研究進展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2013（5）：53-58.

[13]劉巍申.鴨疫里默氏桿菌脂多糖在致病機制中的作用研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[14]倪粒瓊.鴨源大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌原生質(zhì)體融合及其融合子研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[15]謝永平，彭昊，陳澤祥，等.鴨疫里默桿菌PCR快速檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（1）：88-89.

[16]Davies J， Smith D I. Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents[J]. Annu. Rev. Microbiol.， 1978， 32：469-518.

[17]李富祥，楊斌，常志順，等.間接ELISA檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（1）： 202-206.

[18]程安春，汪銘書，方鵬飛，等.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清1，2，4和5型鴨疫里默氏桿菌抗體的研究[J].中國家禽，2004（16）：11-14.

[19]劉維平，程安春，汪銘書，等.間接免疫組化法檢測鴨疫里默氏桿菌感染和抗原定位[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2005，25（4）：362-365.

[20]杜娟，牛艷波，王麗.鴨致病性大腸桿菌耐藥性調(diào)查與分析[J].飼料博覽，2015（6）：41-43.