王利彬 董爽爽 王燦國 程敦公 李豪圣 劉愛峰 宋健民 劉建軍 劉成 張玉梅 穆平 趙振東 曹新有

摘要：本研究從黑麥中克隆了一個熱激蛋白Hsp90基因，暫命名為ScHsp90-1，并對其序列進行分析。結果顯示，該基因cDNA序列全長2 103 bp，共計編碼700個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約80.47 kD。序列同源性分析表明，ScHsp90-1與小麥、玉米、水稻等物種的熱激蛋白同源性較高；進化樹分析表明ScHsp90-1與小麥的TaHsp90親緣關系最近。利用實時熒光定量PCR技術對其表達特性分析表明，ScHsp90-1對高溫、低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫均有響應，其可能是黑麥的一個脅迫相關基因。

關鍵詞：黑麥；熱激蛋白Hsp90；克??；表達分析

中圖分類號：S512.5：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0001-05

Abstract In this study， a Hsp90 gene was isolated from rye， named ScHsp90-1.The full cDNA sequence of ScHsp90-1 is 2 103 bp， which encodes 700 amino acids with a predicted molecular mass of 80.47 kD. The sequence analysis showed that ScHsp90-1 had higher homology with that of wheat， maize and rice. The phylogenetic analysis indicated that ScHsp90-1 was especially similar to TaHsp90 from wheat. The real-time quantitative PCR analysis showed that ScHsp90-1 had response to high-temperature， cold， high-salt and drought treatments in rye. These results indicated that ScHsp90-1 gene might be a stress-related gene of rye.

Keywords Rye； Heat-shock protein Hsp90； Cloning； Expression analysis

在受到高溫或其他理化因素脅迫后，生物體內(nèi)的熱激蛋白（heat-shock protein， Hsp）會極速合成并積累，從而參與生物體內(nèi)蛋白的折疊，防止體內(nèi)蛋白聚合[1]。熱激蛋白作為一類分子伴侶蛋白，根據(jù)其分子量大小可分為小分子量Hsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110等不同家族。目前對Hsp90的研究相對較多，Hsp90家族在生物體內(nèi)蛋白折疊、降解及各種條件下的生長發(fā)育等方面均起到了十分重要的作用；其底物蛋白也廣泛參與了生物細胞信號的傳導[2]。當生物遭受逆境脅迫時，Hsp90家族基因會迅速做出響應，發(fā)揮其保護作用，阻止相關蛋白變形或功能出現(xiàn)紊亂，進而維持生物的正常生長。

大量研究表明，Hsp90家族基因廣泛參與植物對各類逆境脅迫的應答。擬南芥中7個Hsp90家族基因已經(jīng)被成功克隆，其中AtHsp90.2、AtHsp90.3、AtHsp90.4的蛋白序列相似度達96%以上，功能也有一定的交叉重復[3]。有研究表明，在擬南芥植株中過表達AtHsp90.3，轉基因植株對高鈣離子濃度耐受能力增強，對高溫及重金屬離子的耐受性卻變?nèi)鮗4]；過表達AtHsp90.2、AtHsp90.5 和AtHsp90.7，轉基因擬南芥植株對鈣離子濃度的耐受性有所增強，但是對高鹽和干旱的耐受能力卻有所降低[5]。同時，在小麥和水稻上的研究證明，Hsp90在脅迫環(huán)境響應及抗病性中也具有非常重要的作用[6，7]。

黑麥作為小麥的近緣物種之一，有許多可利用的條銹病、腥黑穗病、白粉病等抗性基因，與產(chǎn)量相關的大穗、多小穗性狀，較高的蛋白質(zhì)含量等；并且耐低溫、耐干旱、耐土壤酸性[8]。目前對黑麥DNA重復序列及遺傳連鎖圖譜構建的研究相對較多，而對其優(yōu)異基因的挖掘卻較少。為此，我們利用構建的NTT系統(tǒng)及后差減剔除技術[9]，獲得了黑麥熱激蛋白Hsp90家族基因的EST序列，本試驗在前期研究的基礎上克隆到一個基因全長（GenBank accession no. JQ685506.1），暫定名為ScHsp90-1。對ScHsp90-1蛋白序列進行生物信息學分析，進一步明確該基因的序列特征；并通過實時熒光定量PCR技術，對ScHsp90-1基因的表達特性進行研究，明晰ScHsp90-1基因在高溫、低溫、高鹽、干旱等逆境條件下的表達特性，為進一步明晰ScHsp90-1基因可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡奠定基礎及為下一步應用于分子育種提供優(yōu)良的候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

將黑麥（AR132）幼苗25℃條件下培養(yǎng)10 d后分別進行不同脅迫處理：（1）干旱：將整株黑麥幼苗置于干燥濾紙上進行干旱處理；（2）低溫：將培養(yǎng)的黑麥幼苗置于4℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理；（3）高溫：將培養(yǎng)的黑麥幼苗置于42℃培養(yǎng)箱中進行高溫處理；（4）高鹽：將黑麥幼苗根系完全置于100 mmol/L NaCl溶液中進行高鹽處理；25℃條件下恒溫培養(yǎng)。所有處理分別處理0、1、2、5、12、24 h后取樣，快速置于液氮中，-80℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ScHsp90-1基因全長的獲得及特性分析

用RNA提取試劑盒（天根公司，北京）提取黑麥整株RNA，利用AMV反轉錄酶進行反轉錄。根據(jù)我們前期NTT系統(tǒng)及后差減剔除技術獲得的黑麥Hsp90家族基因的EST序列及網(wǎng)上拼接，設計全長引物進行擴增（F： 5′-GCCATGGCGACGGAGACC-3′； R： 5′-GCTTAGTCGACCTCCTCCATCTTGCT-3′）。反應體系50 μL：10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，高保真Taq酶0.5 μL，ddH2O 38.5 μL。反應條件：95℃變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，40個循環(huán)。對擴增產(chǎn)物純化后，連接到pEasy載體上（全式金公司，北京），轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行測序，獲得全長序列利用CLUSTAL X和MEGA 4.1軟件進行分析。

1.3 ScHsp90-1基因表達特性分析

將經(jīng)過干旱、高溫、低溫、高鹽處理的黑麥整株cDNA稀釋50倍為Real-time PCR 反應模板， 設計實時熒光定量PCR引物ScHsp90-1-F（5′-GACCGAGACCTTCGCCTTCC-3′）；ScHsp90-1-R（5′-TGGTCATGCCAATGCCGCTGTC-3′）。以Actin基因（ F： 5′-TACTCCCTCACAACAACC-3′； R： 5′-GCTCCTGCTCATAATCAA-3′） 為內(nèi)參。根據(jù)RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（天根公司，北京）操作說明書，建立反應體系，每個樣品設3個重復。反應體系：2×Mix 12.5 μL、正向引物 （10 μmol/L）0.5 μL、反向引物 （10 μmol/L） 0.5 μL、模板cDNA 5.0 μL、ddH2O 6.5 μL，共計25 μL 體系。反應程序： 95℃變性2 min；95℃變性20 s， 56℃退火30 s，68℃延伸30 s，40個循環(huán)。在ABI PRISM7000 實時定量PCR 儀上進行。采用2-△△CT算法[10]對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 ScHsp90-1基因序列的獲得及分析

以黑麥整株cDNA為模板，利用設計的全長引物，PCR擴增后電泳可見明顯的擴增條帶（圖1），回收連接載體、轉化、挑單克隆進行測序，結果表明，該基因全長2 103 bp，共計編碼700個氨基酸，命名為ScHsp90-1。經(jīng)網(wǎng)上序列分析（http：//www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html），其蛋白質(zhì)相對分子量為80.47 kD。與其它植物的熱激蛋白氨基酸序列分析比對 （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）表明，ScHsp90-1與小麥、水稻、玉米等物種的熱激蛋白具有較高的同源性；進一步進化樹分析（圖2）表明，ScHsp90-1與小麥的TaHsp90親緣關系比較近，與水稻親緣關系僅次于小麥。可見，Hsp90類蛋白在長期的進化過程中具有較好的保守特性。

2.2 ScHsp90-1基因時空表達特性分析

根據(jù)實時熒光定量PCR結果（圖3），在高溫42℃處理1 h后， ScHsp90-1的基因表達量達到最高值，之后表達量又降低，在10 h時又增加，隨后減少；4℃低溫處理條件下，ScHsp90-1基因在24 h時誘導表達量最大；在干旱脅迫處理下，ScHsp90-1的表達量均低于未脅迫水平；經(jīng)高鹽處理后，ScHsp90-1表達量增加，處理1 h時達到最大值，后迅速下降且低于未處理水平。上述結果表明，ScHsp90-1基因可能對高溫、低溫、高鹽等脅迫均具有一定的響應表達，而在高溫脅迫條件下誘導表達最為強烈。

3 討論與結論

Hsp90家族基因作為分子伴侶，是一類廣泛存在于生物體中高度保守的脅迫蛋白，在生物體受到高溫等脅迫時快速響應，其作用十分廣泛且重要[11-14]。作為分子伴侶，其可以保護細胞分子蛋白免受傷害，同時折疊已損壞的蛋白；還在植物的發(fā)育與進化、細胞信號傳遞、植物抗病性和遺傳隔離中具有十分重要的作用[15，16]。

隨著植物中大量Hsp90家族基因不斷被挖掘與克隆，對其氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，植物中的Hsp90與動物或酵母中的Hsp90 約有63%～71%的同源性；而在植物物種間，Hsp90的同源性高達90%左右[17]。本研究進化樹分析表明，ScHsp90-1與TaHsp90親緣關系最近，與其他植物的熱激蛋白序列也有較高的同源性。由此可見Hsp90家族在植物長期進化過程中的作用應該比較重要，進而在不同植物中保持序列的高度保守。

Hsp90同時受多種生物或非生物逆境脅迫的誘導表達。有研究表明，水稻在遭受低溫、高鹽、干旱及ABA誘導后，體內(nèi)的Hsp90基因表達量顯著增加[7]；擬南芥中，Hsp90基因在重金屬、高鹽或高溫逆境脅迫條件下，其表達量也有明顯增加[18]。本試驗表明，ScHsp90-1基因受低溫、高溫、干旱和高鹽逆境脅迫的誘導表達，但在不同的逆境脅迫條件下，其表達模式不盡相同。其在高溫脅迫條件下誘導表達最為強烈，而在干旱脅迫下表達量最低。然而，這種高度保守的Hsp90家族基因在不同植物中多個或單個核苷酸的變化是否具有一定的規(guī)律，以及其對各種脅迫的響應及作用機制，都可能是我們下一步研究的重要內(nèi)容。

參 考 文 獻：

[1] 李琳， 徐兆師， 劉麗，等. 小麥熱激蛋白WHSP90基因的原核表達及多克隆抗體制備[J]. 麥類作物學報， 2009， 29（3）：380-384.

[2] Taipale M， Jarosz D F， Lindquist S. HSP90 at the hub of protein homeostasis： emerging mechanistic insights[J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2010， 11： 515-528.

[3] Song H， Fan P， Li Y. Overexpression of organellar and cytosolic AtHSP90 in Arabidopsis thaliana impairs plant tolerance to oxidative stress[J]. Plant Mol. Biol. Rep.，2009，27：342-349.

[4] Xu X， Song H， Zhou Z， et al. Functional characterization of AtHsp90.3 in Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana under heat stress[J]. Biotechnol Lett.， 2010， 32：979-987.

[5] Song H， Zhao R， Fan P， et al. Overexpression of AtHsp90.2， AtHsp90.5 and AtHsp90.7 in Arabidopsis thaliana enhances plant sensitivity to salt and drought stresses[J]. Planta， 2009， 229： 955-964.

[6] Wang G F， Wei X， Fan R， et al. Molecular analysis of common wheat gene sencoding three types of cytosolic heat shock protein 90 （Hsp90）：functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance[J]. New Phytologist， 2011， 191： 418-431.

[7] Liu D， Zhang X， Cheng Y， et al. rHsp90 gene expression in response to several environmental stresses in rice （Oryza sativa L.） [J]. Plant Physiol. Biochem.， 2006， 44： 380-386.

[8] 曹新有， 陳雪燕， 陳朝輝，等. 黑麥屬優(yōu)異基因在小麥改良中的研究與應用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2014， 22（8）：1035-1045.

[9] Cao X， Chen X， Liu Y， et al. An iNTT system for the large-scale screening of differentially expressed， nuclear-targeted proteins： cold-treatment-induced nucleoproteins in Rye （Secale cereale L.）[J]. BMC Genomics， 2016， 17（1）：1-12.

[10]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J]. Methods， 2001， 25：402-408.

[11]Wang W， Vinocur B， Shoseyov O， et al. Role of plant heat shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science， 2004， 9： 244-252.

[12]Bhattarai K K， Li Q， Liu Y， et al. The Mi-1-mediated pest resistance requires Hsp90 and Sgt1 [J]. Plant Physiology， 2007， 144：312-323.

[13]Pratt W B， Galigniana M D， Harrell J M， et al. Role of hsp90 and the hsp90-binding immunophilins in signalling protein movement [J]. Cell Signal， 2004， 16： 857-872.

[14]Botr M， Amigues B， Peart J， et al. Structural and functional analysis of SGT1 reveals that its interaction with HSP90 is required for the accumulation of Rx， an R protein involved in plant immunity [J]. Plant Cell， 2007， 19： 3791-3804.

[15]Pearl L H. Review： The HSP90 molecular chaperone—an enigmatic ATPase[J]. Biopolymers， 2016， 105（8）：594-607.

[16]Lamoth F， Juvvadi P R， Steinbach W J. Heat shock protein 90 （Hsp90）： a novel antifungal target against Aspergillus fumigatus[J]. Critical Reviews in Microbiology， 2016， 42（2）：310-321.

[17]Krishna P， Gloor G. The Hsp90 family of proteins in Arabidopsis thaliana[J]. Cell Stress & Chaperones， 2001， 6： 238-246.

[18]Milooni D， Hatzopoulos P. Genomic organization of hsp90 gene family in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology， 1997， 35：955-961.