穆　碩　羅　潔　楊子彪　肖　晨　?！≤S

(1.中國農業(yè)大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100083；2.大理農林職業(yè)技術學院食品工程與經管系， 大理 671003；3.中國農業(yè)大學教育部北京市共建功能乳品重點實驗室， 北京 100083； 4.河北省畜產食品工程技術中心， 三河 065200)

0　引言

乳餅是云南少數民族地區(qū)的一種傳統(tǒng)奶酪制品，具有鮮美的味道和獨特的口感，被稱為“中國奶酪”[1-2]，深受消費者喜愛。目前乳餅的生產大多為手工作坊式生產，工藝落后，沒有現代奶酪加工的凝乳酶，只是采用當地的鮮青羊參葉作為凝乳劑，制作的乳餅得率低，產品品質不穩(wěn)定。

青羊參(CynanchumotophyllumSchneid.)是蘿藦科鵝絨藤屬多年生草質藤本植物，分布于云南、四川和西藏、貴州、廣西、湖南等省區(qū)[3]。目前關于青羊參的研究大多集中在其藥理作用和提取物成分分析[4-5]，青羊參已分離鑒定出來的成分多為青羊參皂苷及其皂苷元素，具有抗癲癇作用。云南少數民族在長期的生產實踐中發(fā)現了其具有較好的凝乳作用，因此，將其作為制作乳餅的原料。但是凝乳機理尚未闡明，其有效凝乳成分的提取及應用條件也未見報道。

作為一種即食型的新鮮奶酪，凝乳的好壞直接影響乳餅的得率、質構及感官品質。傳統(tǒng)乳餅是一種典型的酸熱輔助酶凝奶酪，即將鮮乳(羊乳或牛乳)加熱煮沸后添加前次乳餅制作時排出的酸乳清或食用酸，并輔助添加凝乳劑凝結成塊，壓榨成型[6]。凝乳時使用的酸乳清多憑經驗自然調制而成，其中微生物、酶系組成復雜，存在安全隱患，并極易導致污染和產品質量不穩(wěn)定等問題。除了酸凝乳外，在云南省劍川、鶴慶等縣市，當地人民將當地特色植物青羊參和貫筋藤浸泡液代替部分酸乳清，利用其中的植物凝乳酶凝乳制作乳餅[7]。由于青羊參和貫筋藤等浸泡液的配制工藝不規(guī)范，凝乳活力差異較大，其添加量也靠經驗判斷，沒有統(tǒng)一的標準，難以達到工業(yè)化生產的要求。因此，制備符合標準化生產的乳餅凝乳劑具有重要的應用前景。

本文從青羊參提取溫度、液料比及提取液種類入手，優(yōu)化青羊參凝乳劑的提取條件，并將優(yōu)化后提取的凝乳劑進行乳餅的制作，比較該方法與云南傳統(tǒng)加工方法(酸凝和利用青羊參葉浸泡液凝乳)制得的乳餅組分、得率、質構特性和微觀結構，以期為青羊參凝乳劑的開發(fā)及其在乳餅標準化生產中的應用提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

鮮牛乳：取自北京市沙河春山奶牛廠，蛋白質質量分數3.30%，脂肪質量分數3.75%。

青羊參葉：采自云南省大理市劍川縣，由云南大理農林職業(yè)學院提供。自然晾干，放于-20℃冷凍保存。

1.2　主要儀器與設備

UV-2102 PC型紫外可見分光光度計，上海UNICO公司；Thermo Sorvall LYNX4000型低溫高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；UF/UVPL 5124型超純水儀，美國Pall公司；KDY-9830型凱氏定氮儀，北京思貝得機電技術研究所；TMS Pro型質構儀，美國Food Technology Corporation公司；A1Rsi型激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.3　方法

青羊參蛋白酶的提取條件參照王紅燕等[7]的方法并做部分修改，具體如下。

1.3.1青羊參葉子提取溫度

選用4℃、55℃和25℃(室溫)3種溫度研究不同溫度處理對青羊參葉子凝乳效果的影響，實驗方案如下：稱取3份相同質量的青羊參葉子，分別于4、25、55℃靜置40 min平衡溫度，后將青羊參干葉子剪碎，以液料比20 mL/g加入pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，混勻后分別于4、25、55℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾去除葉子，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離(前期預實驗結果得知10.0 kD超濾管效果最好)，取上層截留液獲得青羊參蛋白酶濃縮液，隨后以體積比1∶20分別加入12 g/mL脫脂還原乳(含10 mmol/L CaCl2)混勻后放置于30℃水浴鍋，觀察并記錄形成凝塊所需要的時間即為凝乳時間。

1.3.2青羊參葉子提取液料比

選取10、20、30 mL/g 3種液料比探究其對青羊參葉子蛋白酶提取效果的影響。實驗方案如下：將青羊參干葉子剪碎，分別以液料比10、20、30 mL/g加入pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，混勻于4℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾去除葉子。濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離。采用考馬斯亮藍法[8]測定濃縮液蛋白含量，并用12 g/mL脫脂還原乳觀察凝乳時間。

1.3.3青羊參葉子提取溶液

選用檸檬酸-磷酸緩沖液和超純水研究不同提取溶液對提取效果的影響。實驗方案如下：將葉子剪碎后，以液料比20 mL/g加入超純水、pH值6.5的10 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液(含150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Cys和EDTA)，混勻，于4℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離，取上層截留液獲得青羊參蛋白酶濃縮液。采用考馬斯亮藍法[8]測定濃縮液蛋白含量，并用12 g/mL脫脂還原乳觀察凝乳時間。

1.3.4凝乳活性測定

凝乳活性鑒定參照BRUTTI等[9]的方法并略做修改。12 g/mL脫脂還原乳(含10 mmol/L CaCl2)1 mL加入0.1 mL酶液混勻后置于37℃條件下，觀察并記錄凝乳時間。一個凝乳活力單位定義為在特定溫度下40 min凝結1 mL中乳所需酶的量，用索氏單位(U)表示。計算公式為

N=2 400V0/(Vt)

(1)

式中N——凝乳活力

V0——加入底物的體積，mL

V——加入蛋白酶溶液的體積，mL

t——凝乳時間，s

1.3.5青羊參凝乳劑制備

確定以上最優(yōu)提取條件后，在最適溫度下，用選定的提取液以最佳液料比浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離，取上層截留液獲得青羊參凝乳劑，測定其凝乳活力。

1.3.6傳統(tǒng)葉子浸泡液制備

將傳統(tǒng)酸凝制作乳餅時排出的乳清，經3 000g離心20 min后，按液料比20 g/mL浸泡青羊參葉子12 h，備用。

1.3.7乳餅制作

3L原料奶經過濾雜后于63℃加熱30 min進行巴氏殺菌，升溫至80℃，分別加入50%乳酸、1.5%浸泡液和1.5%青羊參凝乳劑，調節(jié)pH值至開始凝乳。加入乳酸時要緩慢并保持攪拌，防止局部pH值較高提前出現凝塊。3組凝乳20 min后用8層紗布過濾，并用紗布將凝塊包住，600 kPa擠壓6 h壓制成型。

1.3.8乳餅理化指標測定

采用干燥法(GB 5009.3—2016)測定含水率；采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定蛋白質含量；采用羅茲-哥特里法(GB 5009.6—2016)測定脂肪含量。

1.3.9乳餅得率、蛋白質回收率和脂肪回收率測定

乳餅得率、蛋白質回收率和脂肪回收率計算公式為

Y=Mc/Mr×100%

(2)

Rp=McCp/(MrCrp)×100%

(3)

Rf=McCf/(MrCfr)×100%

(4)

式中Y——乳餅得率，%

Mc——乳餅質量，g

Mr——原料乳質量

Rp——蛋白質回收率，%

Cp——乳餅蛋白質質量分數，%

Crp——原料乳蛋白質質量分數，%

Rf——脂肪回收率，%

Cf——乳餅脂肪質量分數，%

Cfr——原料乳脂肪質量分數，%

1.3.10乳餅質構特性測定

乳餅質構測定參照WANG等[10]的TPA質構分析法，將乳餅樣品切割成1 cm×1 cm×1 cm的小方塊，采用二次下壓法進行測定，具體參數如下：探頭類型為P/25，測試速度為0.4 mm/s，樣品變形量為30%，觸發(fā)力為0.2 N，2次壓縮間隔時間5 s。

1.3.11乳餅微觀結構測定

參照LOPEZ等[11]的方法：從乳餅樣品切下5 mm×5 mm×2 mm的薄片置于載玻片上。用膠頭滴管吸取1.0 g/L的快綠超純水溶液滴至樣品上，在暗盒中充分染色5 min后用滴管吸取0.1 g/L的尼羅紅乙醇溶液滴至樣品上，在暗盒中繼續(xù)染色5 min。染色完成后用純水從樣品一角緩緩沖洗3遍以洗凈染料，清洗結束后覆蓋蓋玻片，倒置于顯微鏡下用60倍油鏡觀察。尼羅紅與快綠的激發(fā)波長分別為488 nm與633 nm。調整至視野清晰后采集圖片。

1.3.12數據分析

每組實驗均重復3次并取平均值。實驗數據采用Excel整理和制圖，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，各表中數值以平均值±標準差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2　結果與分析

2.1　青羊參蛋白酶提取方法評價

2.1.1溫度處理對提取效果的影響

青羊參葉子在55℃處理40 min后，其所需要的凝乳時間是(110.37±3.48) min，是4℃處理下凝乳時間((15.93±0.67) min)的7倍，結果表明55℃處理40 min會使青羊參葉子凝乳作用顯著減弱；25℃處理組的凝乳時間是(40.58±1.39) min，是4℃組的3倍。陶亮等[12]在開發(fā)貫筋藤植物凝乳劑時發(fā)現其最佳提取溫度為55℃；但多數研究表明，較高溫度處理可導致蛋白酶活性降低甚至喪失[13]。AHMED等[14]提取茄屬橙色虎眼新鮮種子中的凝乳酶時發(fā)現最佳提取溫度是4℃。本研究結果表明，青羊參葉的最佳提取溫度為4℃，為維持青羊參蛋白酶的活性，青羊參在采摘后應保存在4℃條件下，且提取過程中需要嚴格控制低溫。

2.1.2液料比對提取效果的影響

液料比是蛋白酶提取條件中的重要因素，一方面液料比升高會增加蛋白酶的溶出效率，另一方面隨著液料比的升高，蛋白酶的濃度會降低，從而影響酶的穩(wěn)定性和活性[15]。GUIAMA等[16]提取茄屬果實中蛋白酶的最佳液料比為10 mL/g；王紅燕等[7]研究貫筋藤莖中凝乳酶的提取工藝發(fā)現其最佳提取的液料比為20 mL/g。在本研究中，液料比10、20、30 mL/g組的凝乳活力分別為(147.7±1.98)U/mg、(213.6±3.42)U/mg、(204.2±2.87)U/mg，20 mL/g組的青羊參蛋白酶濃縮液的凝乳活力最大。

2.1.3提取溶液對提取效果的影響

MAZORRA-MANZANO等[17]從酸橙柑橘的花中提取植物凝乳酶時確定的最佳提取液為pH值6.5的10 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液(含150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Cys和EDTA)；而在云南傳統(tǒng)乳餅加工中通常使用超純水進行青羊參中酶的提取[6-7]。本研究結果如表1所示，相比于超純水浸提提取，pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液提取得到的蛋白酶溶液凝乳活力較高((213.6±3.42) U/mg)，且蛋白含量高出一倍，這是由于蛋白酶在低鹽溶液中的溶解度高于超純水[18]，用檸檬酸-磷酸緩沖液可以提取更多蛋白酶。因此確定青羊參蛋白酶的提取溶液為檸檬酸-磷酸緩沖液。

表1　不同提取溶液對提取效果的影響Tab.1　Effect of different extraction solutions on Cynanchum otophyllum leaves

注：同列不同字母表示數據差異顯著(P<0.05)。

綜合考慮溫度、液料比和提取溶液對提取效果的影響，最終確定蛋白酶提取工藝為：液料比20 mL/g，提取液為pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，浸提溫度為4℃。制備的青羊參蛋白酶凝乳劑凝乳活力為(213.6±3.42) U/mg，顯著高于文獻中報道的植物凝乳酶木瓜蛋白酶的凝乳活力((100.2±1.67) U/mg)，與菠蘿蛋白酶的凝乳活力((222.2±3.21) U/mg)相近[19]。因此，青羊參蛋白酶具備廣闊的開發(fā)和應用前景，可用于乳餅的工業(yè)化生產。

2.2　乳餅的理化指標、回收率及得率

凝乳是乳餅制作中最關鍵的工藝，顯著影響乳餅的組分和質構。根據酪蛋白膠束穩(wěn)定性破壞的原理，凝乳可分為酸凝、酶凝和酸酶共促3種。酸凝是指酪蛋白膠束隨著體系pH值的下降而解離，解離后酪蛋白相互聚合重新形成酸凝膠[20]。酶凝是指表面的κ-酪蛋白在蛋白酶的作用下水解釋放酪蛋白巨肽，酪蛋白膠束空間位阻減小，在鈣橋的作用下酪蛋白聚集從而形成酶凝膠[21]。在酸酶共促的凝乳過程中，酸化與凝乳酶共同作用誘導凝乳的形成。酸酶共促形成的凝膠中存在鈣橋，可以增強凝膠結構的強度，酸酶共促的方法也因此有更加廣泛的應用[22]。乳餅凝乳結構的強弱對乳餅的理化組成影響顯著[23]。

乳餅中主要固形物是蛋白質和脂肪，研究其含量、回收率及乳餅得率對于乳餅的工業(yè)化生產有重要意義[24]。3組凝乳方法制作出乳餅的理化性質如表2所示，傳統(tǒng)酸凝組和青羊參凝乳劑組制得乳餅的含水率和蛋白質質量分數沒有顯著差異(P>0.05)，但青羊參凝乳劑組的脂肪質量分數更高；傳統(tǒng)浸泡組的蛋白質質量分數和脂肪質量分數最低但含水率最高。對于回收率而言，青羊參凝乳劑組有最高的蛋白質回收率((83.84±2.32)%)和脂肪回收率((78.31±1.98)%)，較傳統(tǒng)浸泡組分別提高了20.26和33.04個百分點。該結果與青羊參凝乳劑組有較高的蛋白質和脂肪質量分數一致，且說明使用青羊參凝乳劑可以有效減少乳餅制作過程中蛋白質和脂肪的損失；傳統(tǒng)酸凝組與傳統(tǒng)浸泡組的得率沒有顯著差異(P>0.05)，而青羊參凝乳劑組得率較其他兩組顯著提升，提高了3個百分點左右。

表2　不同凝乳方法制得乳餅的組分含量、回收率及得率Tab.2　Compositions, yield and recovery rate of milk cake made by different coagulants　%

注：不同字母表示同一行數據之間差異顯著(P<0.05)。

2.3　乳餅質構特性

質構是影響消費者購買乳餅的關鍵品質之一。其中，硬度是奶餅質構特性的重要指標，乳餅屬于新鮮干酪，硬度不能過軟也不能過硬[25]。3組乳餅的硬度如表3所示：傳統(tǒng)酸凝組的硬度最高；使用蛋白酶凝乳劑制作乳餅可減小乳餅的硬度，使其質地更加柔軟；傳統(tǒng)浸泡組的硬度最低。含水率和脂肪含量以及乳餅凝乳方式影響乳餅結構，進而影響乳餅的硬度[26]。

表3　不同凝乳方法制得乳餅的質構特性Tab.3　Texture properties of milk cake made by different coagulants

注：不同字母表示同一行數據之間差異顯著(P<0.05)。

傳統(tǒng)酸凝組和青羊參凝乳劑組的彈性沒有顯著差異(P>0.05)；傳統(tǒng)浸泡液組的彈性最小(0.47±0.01)，其原因是傳統(tǒng)浸泡液組的乳餅含水率很高，體系中很多蛋白質之間的鍵可以松弛和重組，導致了酪蛋白網狀結構的更快重組[27]，在下壓后酪蛋白網絡結構快速重組，回彈程度低，彈性小。

粘著度是乳餅的重要感官評價指標之一，由表3可以看出傳統(tǒng)酸凝組的粘著度最低。乳餅的粘著度受其凝膠結構強度的影響[28]，在酸凝工藝的pH值條件下，酪蛋白膠束中以磷酸鈣形式存在的鈣離子完全釋放[27]，在酸酶共促的pH值條件下，酪蛋白膠束中還存磷酸鈣[29]，在凝膠過程中還可形成鈣橋。相較氫鍵和疏水作用力形成的凝膠結構，擁有鈣橋的凝膠結構擁有更高的強度，因而具有較大的粘著度[30]。傳統(tǒng)浸泡組的乳餅粘著度比青羊參凝乳劑組的小，這是因為傳統(tǒng)浸泡組乳餅中含有大量水分且乳餅的結構不固定，擠壓時會有大量的水滲出，降低了乳餅的粘著度。

2.4　乳餅微觀結構

利用激光共聚焦熒光顯微鏡，對用不同加工工藝制得乳餅的微觀結構進行觀測，結果如圖1所示，其中紅色熒光表示脂肪球，綠色熒光代表蛋白質。傳統(tǒng)酸凝組制作的乳餅酪蛋白網絡分布不均，酪蛋白膠束結構致密，酪蛋白基質強度較大，而脂肪形成大塊游離油脂浮于酪蛋白膠束網絡之外(圖1a)，從而導致乳餅硬度較大[31]，這也與質構特性的結果一致(表3)。

圖1　不同加工方法制得乳餅的微觀結構Fig.1　Microstructures of milk cake made by different coagulants

傳統(tǒng)浸泡組制得的乳餅酪蛋白結構松散，未形成較強的交聯結構，大量脂肪在凝乳過程中隨乳清排出，剩余的脂肪不均勻地分布在角落的酪蛋白網絡中(圖1b)。這種松散的凝膠結構也導致了傳統(tǒng)浸泡組乳餅硬度小、彈性小等質量缺陷。這是由于浸泡無法高效提取青羊參中的凝乳成分，且浸泡液中雜質較多，制得的乳餅無法固定成型，酪蛋白形成的網絡結構松散且易被破壞，不能對脂肪球起到有效的鎖定作用，脂肪多以游離脂肪的形式存在，游離在乳清通道，并在乳餅擠壓成型時隨水分流出較多，損失較大，這與傳統(tǒng)浸泡組脂肪含量低、脂肪回收率低等結果一致(表2)。

青羊參凝乳劑組的乳餅酪蛋白網絡結構均一，粒徑一致的脂肪球均勻地鑲嵌在酪蛋白網絡中(圖1c)，這種結構可以賦予乳餅更加柔軟的質地和細膩的口感[25]。與傳統(tǒng)酸凝組、傳統(tǒng)浸泡組相比，添加青羊參凝乳劑可以形成孔隙更加均一的酪蛋白網絡結構，增強對脂肪球的鎖定效果，從而提高脂肪回收率，降低乳餅的硬度，使乳餅質地更加柔軟。

3　結束語

從云南特色植物青羊參中提取有效凝乳成分制備新型凝乳劑，并將其應用于云南傳統(tǒng)乳餅的制作。青羊參蛋白酶最佳提取工藝為：青羊參葉子以液料比20 mL/g浸泡在檸檬酸-磷酸緩沖液中于4℃浸提2 h。與傳統(tǒng)乳餅制作方法相比，使用青羊參凝乳劑可以顯著提高乳餅的蛋白、脂肪回收率及得率；所制得的乳餅有更均勻、細致的凝乳結構，更適宜的硬度和較高的粘著度。研究結果為青羊參凝乳劑的應用及云南傳統(tǒng)乳餅工業(yè)化生產提供了理論依據。

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